固相萃取和樣品堆積耦聯(lián)MEKC富集分離BPA*

王 丹

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012)

多年的研究表明，環(huán)境中的許多化學(xué)物質(zhì)對(duì)人體和動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng)具有干擾作用。雙酚A(BPA)就是其中的一種，它是生產(chǎn)聚碳酸酯和環(huán)氧樹(shù)脂的重要原料，由于其在多種包裝材料中的廣泛使用，又是環(huán)境雌激素的一種，已成為研究和監(jiān)測(cè)的重要物質(zhì)[1]。目前最為廣泛應(yīng)用的對(duì)BPA的分析技術(shù)是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和液相色譜等[2-3]。這些檢測(cè)方法大多需要復(fù)雜的前處理過(guò)程[3]，采用毛細(xì)管電泳分析方法可以對(duì)復(fù)雜樣品直接進(jìn)行分析，方法快速、綠色環(huán)保。膠束電動(dòng)色譜法(MEKC)分析BPA[4-6]等中性化合物的方法己有報(bào)道。但是，MEKC法對(duì)樣品的濃度檢出限仍偏高。為實(shí)現(xiàn)復(fù)雜環(huán)境水樣中痕量酚類污染物的MEKC法分離檢測(cè)，發(fā)展改善MEKC法濃度檢出限的富集技術(shù)十分必要。MEKC法樣品富集技術(shù)可以分為離線富集和在線富集[7-13]。在線富集方法在一定程度上受到進(jìn)樣體積的限制，富集倍數(shù)是有限的[10]，另外缺少某些離線富集技術(shù)所具有樣品凈化功能。在MEKC法離線富集技術(shù)中使用最廣的是固相萃取[14]，不但可以在一定程度上改善MEKC法的濃度檢出限，還可以結(jié)合樣品處理本身的優(yōu)勢(shì)，起到樣品凈化功能。筆者在之前的研究中，用β-環(huán)糊精鍵合硅膠(CDS)作選擇性吸附劑和1-金剛烷酸作頂替洗脫劑對(duì)雙酚A的樣品水溶液進(jìn)行SPE處理，收集下的洗脫溶液直接進(jìn)行MEKC法分析的方法，在對(duì)分析物富集和樣品凈化方面收到較好效果[15]。在之后的研究中建立了一種改進(jìn)的樣品堆積MEKC富集分離方法從而對(duì)分析物起到富集效果[16]。本文在前面研究的基礎(chǔ)上，將固相萃取與樣品堆積相結(jié)合，以期進(jìn)一步改善毛細(xì)管電泳濃度檢出限，拓寬毛細(xì)管電泳對(duì)復(fù)雜環(huán)境樣品中痕量酚類污染物的分析應(yīng)用。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 主要儀器與試劑

CE-L1毛細(xì)管電泳儀，新加坡CE Resources公司；UVIS 200紫外檢測(cè)器，美國(guó)Alltech公司；涂層熔硅彈性石英毛細(xì)管(內(nèi)徑為50 μm，柱長(zhǎng)為61 cm，有效柱長(zhǎng)為50 cm)，河北永年光纖廠；pH-3C酸度計(jì)，江蘇江分電分析儀器廠；KQ218超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；ABi04-N電子分析天平，感量值為0.1 mg，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；尼龍濾頭(0.45 μm)，上海泉島技術(shù)公司；微型注射器(1 mL)，中國(guó)上海醫(yī)療器械集團(tuán)。β-環(huán)糊精(β-CD)(分析純)，美國(guó)Sigma公司；1-金剛烷酸、雙酚A(BPA)、辛基酚(4-OP)、壬基酚(4-NP)(分析純)，美國(guó)Aldrich公司；氫氧化鈉、甲醇、乙腈、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鹽酸(分析純)，上海醫(yī)藥集團(tuán)試劑公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)(分析純)，上海豪紳化學(xué)試劑有限公司；β-環(huán)糊精鍵合桂膠(CDS)，實(shí)驗(yàn)室自己合成；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液：取適量雙酚A、辛基酚和壬基酚，用甲醇作為溶劑，取適量配制成1 000 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。

樣品溶液：用二次蒸餾水將混合標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液稀釋成含雙酚A、辛基酚和壬基酚各2.0 mg/L的混合溶液。

0.05 mol/L 1-金剛烷酸溶液：將1-金剛烷酸溶于0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液中，再用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.0。

0.1 mol/L 1-金剛烷酸溶液：將1-金剛烷酸溶于0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液中，再用氫氧化鈉稀釋至所需的體積。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：

BPA標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液：取適量雙酚A，用甲醇作為溶劑，配制成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。

BPA系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：移取0.1 mL BPA標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液于100 mL容量瓶中，用二次蒸餾水定容至刻度線，混合均勻，配制成濃度為1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。移取1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，然后用二次蒸餾水稀釋成濃度均分別為0.005，0.01，0.02，0.04，0.08 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 離線SPE萃取小柱的制作

以醫(yī)用1 mL聚丙烯注射器制作萃取小柱。將適量脫脂棉以甲醇潤(rùn)濕后置于注射器前端，以玻棒壓緊。取30 mg β-環(huán)糊精鍵合桂膠，以甲醇勻漿后注入注射器中，擠出填料及脫脂棉中的氣泡，使填料填充均勻無(wú)溝流產(chǎn)生。制作好的小柱在使用前需以甲醇和水充分活化。

1.4 SPE過(guò)程

制作好的小柱在使用前，先用4 mL的甲醇和4 mL的二次蒸餾水以2 mL/min的速度進(jìn)行沖洗。小柱在活化時(shí)和后續(xù)的萃取中均應(yīng)保持存有液體。將150 mL待測(cè)樣品溶液通過(guò)萃取小柱，之后用3 mL的0.05 mol/L l-金剛烷酸溶液洗脫溶質(zhì)。用1.5的MEKC方法測(cè)定洗脫出的溶質(zhì)濃度。

1.5 MEKC操作條件

用0.025 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)溶解0.02 mol/L的SDS，同時(shí)加入5%的乙腈和0.001 mol/L β-CD，溶液經(jīng)過(guò)0.45 μm濾頭過(guò)濾后，得到MECK緩沖溶液。采用壓力進(jìn)樣方式(2.07 kPa)，進(jìn)樣8 s，分離電壓為20 kV，檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm，實(shí)驗(yàn)溫度為25 ℃。

2 結(jié)果和討論

2.1 SPE洗脫溶劑的優(yōu)化

將10 mL 2.0 mg/L的BPA 樣品溶液通過(guò)固相萃取柱后，分別用3 mL含5%，10%、15%、20%乙腈的0.05 mol/L 1-金剛烷酸溶液進(jìn)行洗脫，采用1.5 MEKC條件進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算樣品回收率，考察1-金剛烷酸中不同體積分?jǐn)?shù)乙腈的加入，對(duì)β-環(huán)糊精鍵合硅膠(CDS)所保留BPA回收率的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，加入10%乙腈時(shí)樣品的萃取回收率最高，其原因可能是由于未鍵合上環(huán)糊精的硅膠對(duì)樣品有少量的保留，乙腈對(duì)這部分的樣品的洗脫有利。但是加入過(guò)多的乙腈時(shí)就會(huì)減弱1-金剛烷酸的洗脫效率。因此選擇加入10%乙腈的0.05 mol/L 1-金剛烷酸溶液作為分析樣品溶液的洗脫溶劑。

表1 0.05 mol/L 1-金剛烷酸洗脫液中加入乙腈時(shí)BPA的萃取回收率Table 1 Recoveries of BPA in eluate from the CDS with the eluting solution of 0.05 mol/L l-adamantanecarboxylate containing acetonitrile

2.2 CDS裝柱用量的選擇

萃取柱中CDS的用量會(huì)影響到洗脫溶液用量。在固相萃取柱內(nèi)分別裝入10、20、30、40、50 mg的CDS，再將10 mL BPA(2.0 mg/L)樣品溶液通過(guò)各固相萃取柱，之后用3 mL的含10%乙腈的0.05 mol/L 1-金剛烷酸溶液洗脫溶質(zhì)，再用1.5 MEKC檢測(cè)并計(jì)算回收率，結(jié)果列于表2。由表2可知，裝入30 mg CDS時(shí)的萃取回收率最高。因此在分析樣品溶液時(shí)固相萃取的CDS用量為30 mg。

表2 在固定3 mL洗脫溶液條件下不同CDS用量時(shí)BPA的萃取回收率Table 2 Recoveries of BPA with the SPE cartridges packed with different amount of CDS using 3 mL of the eluting solution

2.3 固相萃取和樣品堆積耦聯(lián)MEKC富集分離BPA的方法研究

取30 mg CDS制作萃取小柱，使用前先用4 mL的甲醇和4 mL的二次蒸餾水以2 mL/min的速度沖洗小柱。小柱在活化時(shí)和后繼的萃取中均應(yīng)保持存有液體。將150 mL待測(cè)液通過(guò)萃取小柱，之后用3 mL含10%乙腈的0.05 mol/L的1-金剛烷酸洗脫液洗脫溶質(zhì)。洗脫出的溶質(zhì)在進(jìn)樣之前先進(jìn)一段0.1 mol/L的1-金剛烷酸，再進(jìn)樣品溶液。按1.5 MEKC操作條件進(jìn)行分析。

2.3.1 置換塞進(jìn)樣時(shí)間的優(yōu)化

SPE過(guò)程使用含1-金剛烷酸的洗脫液進(jìn)行洗脫，樣品中含1-金剛烷酸可能會(huì)對(duì)改進(jìn)的樣品堆積富集過(guò)程產(chǎn)生影響。試驗(yàn)對(duì)1-金剛烷酸的進(jìn)樣時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，設(shè)置進(jìn)樣壓強(qiáng)為2.07 kPa，1-金剛烷酸塞子進(jìn)樣時(shí)間為4、6、8、10 s，然后再進(jìn)2.0 mg/L的BPA樣品溶液，考察在進(jìn)樣品溶液60 s條件下BPA峰高的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1-金剛烷酸進(jìn)樣6 s時(shí)BPA的峰高最高，峰型對(duì)稱；塞子進(jìn)樣8 s和12 s時(shí)峰展寬嚴(yán)重，嚴(yán)重影響分離效率。樣品中含1-金剛烷酸并未影響 BPA的檢測(cè)。所以在固相萃取和樣品堆積耦聯(lián)MEKC富集分離BPA 時(shí)確定1-金剛烷酸進(jìn)樣時(shí)間為6 s。

2.3.2 樣品進(jìn)樣時(shí)間的優(yōu)化

取2.0 mg/L的BPA樣品溶液，設(shè)置進(jìn)樣壓強(qiáng)為2.07 kPa，考察進(jìn)樣時(shí)間為60、90、120 s時(shí)，對(duì)富集效率(以峰高計(jì))的影響。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著進(jìn)樣時(shí)間的加長(zhǎng)，峰髙增加。但在進(jìn)樣90 s和120 s時(shí)，BPA電泳峰呈現(xiàn)平頂狀，說(shuō)明BPA的進(jìn)樣體積已過(guò)載。所以在固相萃取和樣品堆積耦聯(lián)MEKC富集分離BPA 時(shí)選擇進(jìn)樣時(shí)間為60 s。

2.3.3 固相萃取和樣品堆積耦聯(lián)MEKC富集分離BPA的方法評(píng)價(jià)

采用固相萃取CDS裝柱量為30 mg，用含10%乙腈的0.05 mol/L 1-金剛烷酸溶液作為洗脫溶劑，洗脫流速控制在2 mL/min，置換塞進(jìn)樣時(shí)間為6 s，樣品溶液進(jìn)樣時(shí)間為60 s，進(jìn)行MEKC分析。圖1曲線B是BPA、4-OP和4-NP樣品混合溶液(各20 μg/L)固相萃取和樣品堆積耦聯(lián)MEKC富集分離電泳譜圖。圖1曲線A 是BPA、4-OP和4-NP樣品混合溶液(各2.0 mg/L)直接進(jìn)樣未經(jīng)固相萃取和在線富集的MEKC譜圖。從圖1曲線B中未能觀察到4-OP和4-NP，說(shuō)明此方法不適用于4-OP和4-NP富集，可能是在SPE過(guò)程中采用3 mL的洗脫液未能洗脫4-OP和4-NP的結(jié)果，圖1說(shuō)明固相萃取和樣品堆積耦聯(lián)MEKC方法不但可以對(duì)BPA進(jìn)行富集，還可以對(duì)分析樣品進(jìn)行凈化。試驗(yàn)結(jié)果可知，對(duì)BPA可以實(shí)現(xiàn)300倍左右的富集效果(以峰高計(jì))。

圖1 固相萃取和樣品堆積耦聯(lián)MEKC富集分離譜圖Fig.1 Electropherograms obtained in the MEKC

取配制好的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用此富集方法進(jìn)行分析，以BPA的濃度(x)為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，在0.005～0.08 mg/L濃度范圍內(nèi)，BPA的濃度與色譜峰面積之間存在良好的線性關(guān)系，線性方程為y=187.71x-0.008 9，線性相關(guān)系數(shù)為0.996 4，檢出限為2 μg/L(S/N>3)。

2.4 實(shí)際水樣加標(biāo)實(shí)驗(yàn)

將取自偉長(zhǎng)湖的水經(jīng)過(guò)0.45 μm的微孔濾頭過(guò)濾后分為三部分，一部分水樣直接進(jìn)行膠束電動(dòng)色譜分析檢測(cè)；還有一部分水樣經(jīng)固相萃取和樣品堆積耦聯(lián)MEKC富集分離檢測(cè)分析，最后一部分加入BPA標(biāo)樣配制成濃度為2 μg/L的樣品溶液，采用同樣的固相萃取和樣品堆積耦聯(lián)MEKC富集分離檢測(cè)分析。 從圖2可見(jiàn)在實(shí)際湖水樣加標(biāo)分析檢測(cè)時(shí)，可以檢測(cè)到2 μg/L的BPA峰和一個(gè)很高的實(shí)際湖水樣未知物峰，在偉長(zhǎng)湖中沒(méi)有檢測(cè)到BPA。采用此聯(lián)用方法對(duì)BPA做了實(shí)際水樣的加標(biāo)回收與精密度實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)濃度水平平行測(cè)定6次，結(jié)果見(jiàn)表3。

圖2 實(shí)際湖水固相萃取和樣品堆積耦聯(lián)MEKC富集檢測(cè)電泳譜圖Fig.2 Electropherograms of a real lake water sample obtained in the SPE-stacking MEKC

表3 BPA的實(shí)際水樣加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Recoveries of BPA in the spiked real water samples

3 結(jié) 論

實(shí)現(xiàn)了離線富集技術(shù)固相萃取和在線富集技術(shù)改進(jìn)的樣品堆積與MEKC的耦聯(lián)。采用此固相萃取和樣品堆積耦聯(lián)MEKC富集檢測(cè)分析方法，進(jìn)一步改善了MEKC對(duì)BPA的濃度檢出限，最低檢出限為2 μg/L，實(shí)現(xiàn)了約300倍的富集效果(以峰高計(jì))，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為10%(n=6)。體現(xiàn)了SPE和MEKC技術(shù)結(jié)合的優(yōu)點(diǎn)，顯示出固相萃取和樣品堆積耦聯(lián)MEKC方法不但可以起到對(duì)BPA進(jìn)行富集的目的還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)分析樣品進(jìn)行凈化的作用。此方法有望用于環(huán)境水樣中某些痕量污染物的分析檢測(cè)。