污水中新型冠狀病毒富集方法研究進展

鄭曉雨,魯璽龍,聞 武,楊 帆,趙興春,*

(1.公安部禁毒情報技術中心,北京 100193;2.公安部物證鑒定中心,北京 100038)

新冠疫情暴發(fā)以來,全球公共健康受到嚴重威脅[1]。新冠病毒傳染能力極強,除飛沫傳播和接觸傳播外,還可能通過感染患者的糞便排出體外,隨著醫(yī)院廢水或市政污水等排放后,經(jīng)城市污水管網(wǎng)/道進入污水處理廠,長期存活于污水體系中[2-3]。2020年,荷蘭首次報道污水中檢測到新冠病毒,比首例確診病例早3周時間[4]。法國、美國等的學者[1,5-8]研究表明,采樣時段內(nèi)污水中新冠病毒含量與相應區(qū)域內(nèi)確診人數(shù)變化趨勢呈良好的正相關性,美國和澳大利亞的學者[1,9]還根據(jù)污水中新冠病毒RNA檢測量估算相應區(qū)域感染人數(shù)。這些研究[10]充分證明,污水流行病學可在提供疫情預警信號、動態(tài)監(jiān)測疫情發(fā)展和輔助評估疫情干預方面發(fā)揮重要作用。根據(jù)文獻報道,大多數(shù)污水處理廠的污水中新冠病毒載量僅為1×104～1×106copies/L,提高目標物的檢測靈敏度成為發(fā)揮作用的基礎。同時,雖然溫度、日光以及其他拮抗微生物等都會影響新冠病毒的存活,但由于其極強的傳染性,仍然存在病毒暴露引發(fā)操作人員感染、處理不當造成受納水體污染等風險。因此,快速有效的富集方法成為精確監(jiān)測新冠病毒的關鍵制約因素[11]。

污水流行病學用于監(jiān)測病毒等在人群中的傳播已經(jīng)得到廣泛研究和應用,但大多為針對非包膜病毒。由于新冠病毒為包膜病毒,其與非包膜病毒的富集方法存在不同。由于研究時間、傳播特性等原因,針對新冠病毒富集方法的研究成果還不夠系統(tǒng)、成熟。因此,本文旨在系統(tǒng)梳理現(xiàn)有相關研究文獻,通過比較不同富集方法的優(yōu)缺點,指出當前和未來研究的重點方向,為制定標準化方案提供有益參考。

1 常見富集方法

根據(jù)原理不同,富集方法可分為物理化學方法和物理方法[11]。物理化學方法是在使用聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)與NaCl、MgCl2、葡萄糖或明礬等化學試劑產(chǎn)生聚合絮沉和兩相分離的基礎上進行物理分離提取和富集,如膜吸附-洗脫法、絮凝沉淀法等。物理方法主要應用離心和過濾或超速離心和再懸浮的組合,如超速離心法、超濾法、常規(guī)過濾法等。其中,PEG絮凝沉淀和超濾被世界衛(wèi)生組織推薦用于脊髓灰質(zhì)炎病毒循環(huán)的環(huán)境監(jiān)測,膜吸附脫附被美國環(huán)保局作為檢測水中隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲的標準方法。2022年,國家衛(wèi)健委將PEG絮凝沉淀、鋁鹽絮凝沉淀、離心超濾作為污水中新冠病毒富集的行業(yè)標準發(fā)布實施。本文將重點介紹幾種當前最為常用的富集方法(表1)。

1.1 膜吸附-洗脫法

膜吸附-脫附法基本過程是將含有病毒的水體通過吸附性過濾器,利用過濾器與病毒之間的靜電作用使病毒吸附在帶電濾膜上,再用磷酸緩沖鹽等從濾膜上洗脫病毒[12]。濾膜可分為負電膜(如硝酸纖維素膜)和正電膜(如nanoceram膜、1MDS),根據(jù)病毒的帶電荷狀態(tài)選擇合適的濾膜。一般來說,大多數(shù)腸道病毒在接近中性pH的環(huán)境水中具有凈負電荷,因此,使用負電膜富集前需添加陽離子鹽(如MgCl2、AlCl3或NaCl)促進帶負電的病毒通過陽離子鹽橋與膜結合,最后需要用酸將吸附的陽離子洗脫以提高病毒回收率。例如,通過加入低濃度的NaCl和MgCl2實現(xiàn)利用硝酸纖維素微孔膜對病毒進行富集。另外,由于污水中的懸浮物會引起堵塞和基質(zhì)效應,一般應進行預過濾或預離心。使用正電膜富集則無需加鹽或酸化,加鹽或酸化有可能會在帶負電的病毒顆粒周圍形成正雙電層,從而降低正電膜過濾效率。從目前研究來看,相對于負電膜而言,正電膜的成本較高。

通過對比不同負電膜法對腺病毒和小鼠肝炎病毒(MHV)的富集效率發(fā)現(xiàn),對于非包膜病毒腺病毒,水樣預酸化處理后的樣品未見實時熒光定量(qPCR)抑制,且回收率是添加MgCl2方法的10倍[13],而對于與新冠病毒具有相似基因結構和包膜蛋白的MHV[14],添加MgCl2的回收率最高達到65.7%[15],這可能是由于預酸化過程破壞了病毒結構[16]。該課題組還對比了負電膜法與超濾法對污水中新冠病毒的富集效率,發(fā)現(xiàn)兩種方法均未出現(xiàn)qPCR抑制,但對兩個樣品檢測出現(xiàn)相反結果,其含量均低于定量限[1]。一項針對新冠病毒的8種富集方法對比結果表明,添加MgCl2的膜吸附脫附具有最低的回收率[17]。

1.2 絮凝沉淀法

絮凝沉淀法是通過向樣本中加入絮凝劑使病毒與絮凝體結合,然后通過物理方法收集和洗脫實現(xiàn)富集的方法[12]。PEG絮凝沉淀法是分析水樣中新冠病毒載量的常用方法之一,比一般化學絮沉效果更好[18]。

利用絮凝沉淀可回收污水中水相和固體懸浮物中的新冠病毒[19],但回收率并不高[15],可能是因為存在逆轉(zhuǎn)錄抑制[15]或qPCR抑制劑共沉淀[5]。Bar-Or等[20]分別采用PEG和明礬絮凝沉淀法富集新冠病毒,qPCR測定陽性樣本循環(huán)參數(shù)分別為33和33.6。La等[21]通過改進世界衛(wèi)生組織關于脊髓灰質(zhì)炎病毒傳播環(huán)境監(jiān)測指南,在采用PEG沉淀法時略去其中氯仿處理步驟,保證了病毒結構的完整性,從而提高新冠病毒的回收率?！段鬯行滦凸跔畈《靖患瘽饪s和核酸檢測方法標準》(WS/T 799—2022)中PEG沉淀法包括預離心、次級離心和濃縮富集三步,其中次級離心需在12 000g下離心2 h,鋁鹽混凝沉淀法包括預離心、絮凝處理、離心分離和絡合溶解四步,最大離心力為2 500g,且離心時間更短,該標準方法的檢出限為10 copies/mL。

1.3 超速離心法

超速離心法是在預離心去除較大顆粒的基礎上,利用超速離心機強大的離心力使物理特征不同的物質(zhì)分離。一般而言,1 000～3 000g離心15 min足以沉淀全細胞細菌,高速離心(高于5 000g)可沉淀線粒體等大細胞器,而沉淀病毒則需要提供100 000g離心力的超速離心機。通過調(diào)控離心轉(zhuǎn)速和時間,還可對樣品中不同成分進行分離。

Wurtzer等[22]將11 mL搖勻后的樣品置于離心機中,在4 ℃下200 000g離心1 h,隨后加入到400 μL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液中,取200 μL進行檢測,新冠病毒RNA為1×104～1×107copies/L,但未提供回收率數(shù)據(jù)。Ahmed等[15]利用超速離心法對MHV的平均回收率為33.5%,而Ye等[19]在4 ℃下100 000g離心15 min后平均回收率僅為5%左右,鑒于只檢測活性病毒,推測低回收率與過高離心力造成病毒失活有關,同時部分被吸附在懸浮顆粒上的病毒在除去上清液時損失。

1.4 超濾法

超濾法是利用在一定壓力下,分子大小與濾膜孔徑的關系實現(xiàn)病毒富集的目的。為避免較大雜質(zhì)顆粒堵塞[12],往往需要在超濾之前進行預離心[19]。盡管超濾過程中病毒的富集不是通過靜電相互作用發(fā)生的,但是病毒仍然可以通過范德華力、疏水作用等被吸附到超濾膜上。病毒在超濾膜上的回收需要用甘氨酸溶液、牛肉提取物、0.1 mol/L HNO3和0.1 mol/L NaOH交替溶液或多磷酸鈉等進行反沖洗[23]。

Medema等[4]將樣品以4 654g離心30 min,取100～200 mL上清液通過截留分子量為100 kDa的離心超濾器實現(xiàn)富集,對F-特異性RNA噬菌體回收率達73%±50%。超濾法的回收率較高,但同時不確定度較高,其中超濾筒截留分子量、富集倍數(shù)以及超濾筒是否再生均會對新冠病毒回收率產(chǎn)生影響[17],此外在預過濾步驟病毒也會通過范德華力或疏水鍵被吸附到離心過濾器,損失可高達30%[13]。研究[10]表明,采用雙重超濾法對新冠病毒富集效果更佳?！段鬯行滦凸跔畈《靖患瘽饪s和核酸檢測方法標準》(WS/T 799—2022)中給出一次性超濾杯的截留分子量為30 kDa,方法檢出限為100 copies/mL。

2 討論與分析

由于新冠病毒極強的傳染性等原因,針對其富集方法的研究還較為有限。但在過去幾十年里,根據(jù)污水中不同病毒的分析需求,科學家們對富集方法進行了大量研究。通過對比分析和梳理總結,有望對研究新冠病毒提供有益參考。如表2所示,著重從回收率、耗時、準確性和成本等角度比較了不同富集方法的優(yōu)缺點。值得說明的是,由于試驗中污水樣品(包括污水體積、基質(zhì)、新冠病毒的濃度)、替代病毒的選擇、儀器設備參數(shù)(如負電膜種類、尺寸、洗脫劑,沉淀劑種類、沉淀時間,離心速度、時間及截留分子量)等的區(qū)別,不同研究文獻對各富集方法的評價存在一定差異。

表2 富集方法對比Tab.2 Comparison of Concentration Methods

2.1 回收率

不同富集方法回收率的差異主要來自于處理過程中目標物的損失以及檢測時基質(zhì)等成分對目標物響應的干擾等。大量研究[27]表明,新冠病毒容易被吸附到污水中懸浮顆粒物上,因此,預離心或預過濾步驟有可能導致病毒損失。膜吸附脫附法和超濾法的回收率較高[27-28],但病毒與膜或設備之間的靜電力、范德華力或疏水鍵等會引起病毒損失,使用惰性材料或優(yōu)化洗脫劑會提高回收率[29],不同病毒的生物性差異造成不同洗脫劑洗脫效率的差異[30]。例如,被廣泛應用于回收病毒的甘氨酸在其最佳堿性洗脫pH下會造成病毒失活,牛肉提取物能夠在更溫和的pH下洗脫,但其蛋白質(zhì)成分會引起基質(zhì)效應,造成整體回收率下降。在針對新冠病毒的研究中,大多數(shù)采用磷酸鹽緩沖液洗脫,特別要注意氯仿等有機物可能會造成新冠病毒包膜的破壞[31]。超速離心法無需引入牛肉提取物等干擾物[32],還可以通過離心程序設置等去除樣品中的一些干擾物[33],但預離心步驟仍可能引起病毒損失。

絮凝沉淀法和超濾法對目標物缺乏特異性選擇使得富集產(chǎn)物的基質(zhì)較為復雜[34]。Ikner等[29]認為,絮凝共沉淀物中的有毒物質(zhì)可能導致細胞培養(yǎng)物中毒,且PEG存在反滲析和污染樣品等情況。Barril等[27]采用類似于新冠病毒的貓杯狀病毒(feline calicivirus,FCV)作為替代病毒,對比了包括絮凝沉淀、膜吸附脫附等在內(nèi)的11種富集方法。結果表明,PEG沉淀的平均回收率較高,而膜吸附脫附法對FCV病毒無效。這與Ahmed等[15]以MHV為替代病毒的研究結果不一致。Barril等[27]認為除樣品體積、污水雜質(zhì)對濾孔堵塞以及基質(zhì)效應外,病毒結構不同是造成回收率差異的主要原因。Zheng等[17]采用單因素方差分析法系統(tǒng)比對8種不同富集方法的Ct值平均值和回收率。其中超速離心法的回收率(25.4%±5.9%)明顯高于其他方法,因此,適于快速靈敏地監(jiān)測污水中新冠病毒。之后依次是絮凝沉淀法、超濾法和膜吸附脫附法。其中,絮凝沉淀法中不同沉淀劑(AlCl3、MgCl2和PEG)的平均回收率也有顯著差異,AlCl3的可變性最低。因此,盡管回收率較低(11.0%±4.36%),但考慮到所需特殊設備較少,認為AlCl3沉淀為最優(yōu)富集方法。

2.2 耗時

不同富集方法的機理決定其耗時存在顯著差異,一般來說,超濾法和超速離心法的耗時明顯短于膜吸附脫附法,特別是許多新型超濾的平均耗時僅有10～15 min[29],絮凝沉淀法耗時最長。但必須說明的是,同一方法也存在巨大差異,這不僅與資源配置或樣品等存在密切關系,而且有時直接影響了回收率和靈敏度等。超濾法和超速離心法不需要洗脫或次級富集,還可以不調(diào)整pH或者添加陽離子[29],大大減少了處理步驟,但不同設備最大離心速度差異對耗時和離心效果具有顯著影響。在膜吸附脫附法和超濾法中,由于樣品基質(zhì)和進樣體積的不同、濾孔堵塞等問題,不可避免地影響方法耗時。為保證絮凝劑充分反應,絮凝沉淀法往往需要在加入絮凝劑后低速攪拌過夜,耗時長(長達15 h以上[11])。Laturner等[12]認為沉淀時間縮短至4 h不降低回收率,甚至可進一步縮短沉淀時間,但對牛冠狀病毒(BCoV)僅有0.09%的回收率,確實低于其他一些報道。

2.3 成本

本文的成本主要考慮富集方法所需要的設備耗材等,而不包括與耗時相關的人力成本等。昂貴的離心機是富集成本的重要組成部分,膜吸附脫附法是唯一可不需要離心步驟的方法,但在過濾之前通過離心去除固體雜質(zhì)可大大提高方法通量,且對定量結果無明顯影響[35],因此,也被多個課題組采用。就單個樣品的耗材成本而言,目前最昂貴的方法是超濾,主要在于其過濾器價格昂貴且不可重復使用[12,29]。出于類似的原因,PEG絮凝沉淀法的成本也相對較高。將0.22 μm過濾器用于過濾裝置有可能降低成本,但代價是潛在的裝置污染風險或增加耗時以徹底清洗。采用膜吸附脫附法時,不同的濾膜價格成本也存在較大差異。報道稱,正電膜Virosorb 1MDS 和NanoCeram的售價分別為250美元和50美元,而負電膜則相對便宜得多[29]。盡管超速離心設備較為昂貴,但由于容器可以重復使用,每個樣品的材料成本較低[29]。

2.4 通量

污水中病毒并非均勻分布,因此,樣品體積會影響到富集方法的靈敏度、重復性和可變性。比如,隨著污水樣品體積的增加,所得濃縮物中病毒RNA的濃度液也會增加。通常來說,受儀器設備體積的限制,超速離心法和超濾法只能處理少量樣品,更多應用于次級富集。相對而言,膜吸附脫附法和絮凝沉淀法可處理大體積的樣品,因此,更適合于初級富集。但處理更大體積的樣品也存在弊端,比如耗時相應增加。此外,以膜吸附脫附法為例,處理過程中濾膜的孔可能會被堵塞,或者吸附活性位點被占據(jù),從而導致吸附效率降低,因此,樣品體積也存在極限和最佳平衡值。事實上,濾孔被堵塞的問題也存在于超濾法中,使其通量同樣受到限制。在PEG絮凝沉淀法中,增加樣品體積則意味著需要更大體積容量和更高效率的離心機,從而增加方法成本。

3 存在的主要問題

污水中新冠病毒富集方法的選擇,需要從回收率、資源配置、成本、耗時以及試驗目的等方面統(tǒng)籌考慮。當前有關研究報道缺乏可比性,尚不能形成完全令人信服的理論性指導方法,在富集方法的比較分析與選擇以及實踐應用上還存在不少問題。

3.1 替代病毒的選擇

由于新冠病毒的高傳染性,科學研究中經(jīng)常采用替代病毒。目前,研究中常用的替代病毒種類繁多不利于梳理比較,且由于病毒之間結構差異等原因,各項評價結果并不能真實反映對新冠病毒的富集效率。比如辣椒輕斑駁病毒(PMMoV)和MHV被廣泛作為新冠病毒的替代病毒,其回收率經(jīng)常被用于評估污水富集效率,但其與新冠病毒RNA衰減率不同。這表明其作為新冠病毒在環(huán)境中存活率的替代標記物作用有限,而不同病毒的富集效率直接影響分析結果。Tanimoto等[38]對污水的原液、固體和PEG沉淀樣品中PMMoV和新冠病毒分別進行分析。就PMMoV的RNA拷貝數(shù)和回收率而言,PEG沉淀部分明顯高于固體部分,但固體部分的新冠病毒RNA陽性率卻明顯高于PEG沉淀部分,許多最新研究也都證明了固相沉淀物對病毒,特別是對包膜病毒的吸附作用。高達26%的鼠肝炎病毒等包覆病毒存在于固相部分,而6%的MS2等未包覆病毒存在于廢水樣品中[19]。Kitamura等[28]發(fā)現(xiàn)在富集脊髓灰質(zhì)炎病毒中有效的負電膜濾法、PEG沉淀法和超濾法,回收樣品都來自于上清液,因此,對新冠病毒富集效率差強人意。用新冠病毒直接摻入更能代表新型冠狀病毒污水監(jiān)測中病毒富集方法的性能。然而,用于評價的加標滅活病毒同樣不能完全反映新冠病毒在污水樣品中的實際行為,這可能影響病毒富集方法在實際應用中的性能。

3.2 污水樣品的多變性

關于新冠病毒在污水中的存活時間、增殖和消亡規(guī)律等問題,相關研究還不夠深入。事實上,溫度、pH和拮抗微生物等環(huán)境因子不僅影響新冠病毒的存活,也會影響新冠病毒的檢測[39]。研究發(fā)現(xiàn),新冠病毒在污水中的衰減具有較強溫度依賴性,其結構完整性差且衰減較快[40],長期儲存在4 ℃或冷凍下平均含量可下降60%[28]。當pH值>6時,RNA更容易發(fā)生堿性水解[41]。Kitamura等[28]認為負電膜濾法中酸性環(huán)境可能會破壞包覆病毒的完整性,從而降低回收率。污水中存在環(huán)境PCR抑制劑,在富集、檢測過程中有可能導致抑制劑的共純化和富集,從而影響qPCR檢測。也有研究[17]表明,增加樣品體積并不能顯著提高檢測靈敏度,這可能是污水基質(zhì)干擾了病毒RNA的提取與檢測。目前許多研究并未考慮富集操作過程中污水基質(zhì)、污水體積、污水中目標物濃度、富集環(huán)境條件等對富集效率的影響。事實上,不同污水樣品的富集效率在同樣富集方法下也存在較大變動,因此,需要不同采樣點的污水在選擇合適富集方法時需要重新考慮和評估。需要注意的是,由于污泥固體等對新冠病毒的吸附作用[28,32,42],在采用污水進行疫情監(jiān)測時,要特別注意污泥中病毒的檢測,但污泥中的蛋白質(zhì)、重金屬等各種有機物和無機物,可能造成病毒失活或者對病毒檢測造成基質(zhì)干擾,而且新冠病毒在污泥中的穩(wěn)定性尚未開展足夠的研究[18]。

3.3 RNA提取方法選擇

回收率是對富集效率評價的一項重要指標,而這與新冠病毒RNA提取方法和基因靶的選擇有著直接關聯(lián),如檢出率和Ct值的差異可能來自于不同試劑盒的提取效率。Zheng等[17]發(fā)現(xiàn),尤其是在處理相對無顆粒的樣品時,研究中所用的兩種試劑盒病毒提取有著顯著差異。

3.4 硬件設備

一方面,新冠病毒極強的傳染性要求富集過程必須充分考慮安全性。一般地,直接處理新冠病毒樣本至少需要在生物安全二級實驗室環(huán)境下進行,同時采用不低于生物安全三級實驗室的個人防護。另一方面,污水中的低載量使得對其分析檢測限要求很高。一般而言,100 mL的污水足夠大多數(shù)腸道病毒檢測,但對于檢測新冠病毒往往需要200 mL以上,對于病例少的地區(qū)需要的污水量則更多。當富集污水量不夠時,會導致樣品低于分析檢測限[43],這在一定程度上限制了超濾法和超離心法等方法的應用。

4 結論與展望

目前,研究工作者已開發(fā)了多種方法應用于污水中新冠病毒的富集。相對而言,膜吸附脫附法和絮凝沉淀法成本低、耗時長,適用于大體積樣品初級富集;超速離心法和超濾法成本高、耗時短,適用于小體積樣品次級富集。通過優(yōu)化過濾膜種類尺寸、陽離子、絮沉劑、離心速度和截留分子量等可進一步提高回收率等富集效果。

由于前期關于污水中新冠病毒富集的研究缺乏統(tǒng)一的實踐規(guī)范,存在不同富集方法處理后檢測結果不一致以及不同研究對富集方法效率的評價和解釋矛盾等情況。為此,應組織有關權威部門和研究機構,建立統(tǒng)一的富集操作規(guī)范。例如,為解決基于污水分析的毒品濫用監(jiān)測技術中不同方法所得結果無法系統(tǒng)比較的問題,經(jīng)過近二十年發(fā)展,我國及歐盟等均建立了統(tǒng)一的操作規(guī)范,從而使該技術真正推向?qū)崙?zhàn)應用。目前,國家衛(wèi)健委發(fā)布了《污水中新型冠狀病毒富集濃縮和核酸檢測方法標準》(WS/T 799—2022),有望首先將絮凝沉淀法與超濾法在污水中新冠病毒富集工作中推向?qū)嵱谩?/p>

不同的富集方法各有優(yōu)缺,在實際工作中,要結合各實驗室和污水樣品的具體情況進行選擇。另外,可將多種方法同時應用于富集過程,充分發(fā)揮各富集方法的優(yōu)點,從而保證試驗更加高效、準確。例如,將通過膜吸附脫附法進行初級富集的污水樣品,用較大體積洗脫劑進行洗脫后,再利用超速離心法進行次級富集,可有效提高回收率,同時解決超速離心不適用于大體積污水樣品分析的問題。

除進一步優(yōu)化富集方法之外,采用同位素內(nèi)標、被動采樣器、無需試劑盒的RNA提取方法、無需預處理的超快檢測方法、生物傳感器等也可以有效提高污水中新冠病毒的分析水平。