畜禽糞肥源抗生素抗性基因的生態(tài)風(fēng)險評估

趙敏杏,溫 馨△,陳 濤,王 軍,吳銀寶,2,3*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院,廣東 廣州 510642;2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室,廣東 廣州 510642; 3. 嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室茂名分中心,廣東 茂名525000)

抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)作為環(huán)境中的新型污染物,兼具“可傳播擴散”與“環(huán)境持久”的特性,導(dǎo)致微生物抗生素抗性的快速擴散,對全球公共衛(wèi)生構(gòu)成重大威脅[1]。研究表明,抗生素的發(fā)現(xiàn)和大量使用導(dǎo)致環(huán)境中ARGs豐度呈指數(shù)型上升趨勢,我國畜禽環(huán)境中ARGs污染形勢十分嚴(yán)峻[2]。谷艷茹等[3]研究發(fā)現(xiàn),施用糞肥會使土壤中sul1、sul2和tetO等 ARGs的相對豐度增加14倍,且還會增加土壤中四環(huán)素類、氨基糖苷類、多重耐藥類ARGs污染的多樣性[4]。由于ARGs會通過垂直轉(zhuǎn)移(vertical gene transfer,VGT)和水平轉(zhuǎn)移(Horizontal Gene Transfer,HGT)的方式在相同種屬或不同種屬的微生物之間傳播,并通過食物鏈最終影響人類的健康,因而開展ARGs的生態(tài)風(fēng)險評估對于保障人類健康具有重要意義[5]。近年來,科學(xué)家對于ARGs的暴露評價已開展了許多研究。但由于存在ARGs過程定量數(shù)據(jù)匱乏和HGT等問題[6-7],這些研究只關(guān)注ARGs的環(huán)境暴露污染特征,對其進行生態(tài)風(fēng)險評估鮮有報道,基于畜禽糞肥源ARGs的生態(tài)風(fēng)險評估更為少見。由此,本文總結(jié)了環(huán)境污染物的生態(tài)風(fēng)險評估框架和評估ARGs生態(tài)風(fēng)險所需的ARGs數(shù)據(jù)庫獲取途徑及方法,結(jié)合畜禽糞肥源ARGs生態(tài)風(fēng)險評估的關(guān)鍵點,提出適用于種養(yǎng)結(jié)合模式下畜禽糞肥源ARGs生態(tài)風(fēng)險的評估方法。

1 確定ARGs的生態(tài)風(fēng)險評估方法

1.1 確定ARGs生態(tài)風(fēng)險評估框架

生態(tài)風(fēng)險評估是評價生態(tài)系統(tǒng)暴露于一種或多種脅迫因子時不利效應(yīng)發(fā)生的可能性,是在風(fēng)險管理的框架下發(fā)展起來用于制定環(huán)境管理決策的主要科學(xué)依據(jù)[8]。綜合各個國家和組織的生態(tài)風(fēng)險評估技術(shù)框架和流程,根據(jù)歐盟現(xiàn)有風(fēng)險評價技術(shù)指導(dǎo)文件(Technical Guidance Document on Risk Assessment,TGD),結(jié)合《中華人民共和國2020生態(tài)環(huán)境健康風(fēng)險評估技術(shù)指南總綱》和ARGs的污染特征,可綜合得出ARGs的生態(tài)風(fēng)險評估框架主要包括暴露評估、危害評估和風(fēng)險表征這三個階段。ARGs作為一種新型環(huán)境污染物,對其進行生態(tài)風(fēng)險評估時首先需對其進行暴露評估,根據(jù)其暴露種類、暴露豐度、暴露時間和暴露地點等特點綜合評估不同ARGs的暴露頻率和暴露路徑,完成暴露評估過程。接著,通過明確目標(biāo)ARGs的主要危害特性,如微生物抗性、可移動性、宿主致病性和人類相關(guān)性等[9-10],通過抗性評估和傳播評估的方式綜合評價不同ARGs的危害風(fēng)險值,進而完成危害評估全過程。最后,再根據(jù)暴露評估和危害評估的結(jié)果采用定量或定性的方法,對目標(biāo)ARGs在該環(huán)境中的生態(tài)風(fēng)險進行風(fēng)險表征[6-7](圖1)。

1.2 確定用于風(fēng)險評估的數(shù)據(jù)庫及測序工具

對ARGs進行生態(tài)風(fēng)險評估時,首先需要確定評估對象,即確定需要評估哪些ARGs的生態(tài)風(fēng)險。目前,用于確定ARGs基本信息的數(shù)據(jù)庫包括Comprehensive Antibiotic Resistance Database(CARD)[11]和Resfinder等[12],具體作用特點如表1所示。通過檢索下述數(shù)據(jù)庫,即可獲得目前已知的ARGs的信息。

圖1 ARGs的生態(tài)風(fēng)險評估框架Fig.1 Framework of ecological risk assessment of ARGs

表1 ARGs的參考數(shù)據(jù)庫Table 1 Reference database of ARGs

獲得ARGs的相關(guān)信息后,即可開展目標(biāo)評估體系中ARGs的檢測工作。常用基于PCR的方法和基于基因組測序的方法確定目標(biāo)評估體系中ARGs的類別?；赑CR的方法,即提取樣品微生物DNA,用特定ARGs的引物進行PCR擴增,對目標(biāo)條帶進行測序,從而鑒定ARGs的類別。該方法的優(yōu)點是比較準(zhǔn)確,缺點是效率低。基于基因組測序的方法可借助基因測序工具實現(xiàn)[15],具體如表2所示,可通過對樣品微生物 DNA 進行高通量測序或宏基因分析的方法,將獲得的基因序列與已知的ARGs數(shù)據(jù)庫(表1)進行比對,即可獲得ARGs類別等信息[16]。該類方法成本較高,大多數(shù)數(shù)據(jù)庫不夠詳盡且不是定期更新,但是靈敏度和特異性強,可極大提高ARGs的檢出效率。評估基于種養(yǎng)結(jié)合模式的畜禽糞肥源ARGs生態(tài)風(fēng)險時,也須采用上述方法確定用于評估的ARGs源數(shù)據(jù)。

2 ARGs的生態(tài)風(fēng)險評估內(nèi)容

2.1 暴露評估

暴露評估是畜禽糞肥源ARGs生態(tài)風(fēng)險評估的第一個關(guān)鍵點,即首先要通過畜禽糞肥源ARGs的暴露種類、暴露豐度、暴露時間和暴露地點等,明確其暴露頻率和暴露路徑。

規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖場四環(huán)素類抗生素在豬糞中的檢出率顯著高于其它類抗生素[22],由此導(dǎo)致四環(huán)素類ARGs在畜禽糞便中的絕對豐度高達1011copies/g,成為畜禽糞肥源主要的ARGs類型[23-24]。不過畜禽糞污通常需經(jīng)無害化處理后才會進入環(huán)境,這就會使其所含ARGs的種類和豐度發(fā)生變化[25]。但通過對畜禽糞便采取好氧堆肥、厭氧消化和氧化塘等處理及資源化利用方式也難以有效削減ARGs的豐度[26]。Diehl等[27]發(fā)現(xiàn),tetA和tetX的相對豐度經(jīng)厭氧消化后增加了30%～150%。Cheng等[28]調(diào)查了中國東部8所養(yǎng)殖場經(jīng)厭氧消化及堆肥處理后糞便中ARGs的豐度,發(fā)現(xiàn)10種四環(huán)素類抗性基因和2種磺胺類抗性基因在各種畜禽糞便中被廣泛檢出,ARGs豐度最高達2.26×1011copies/g。Huang等[29]發(fā)現(xiàn),通過氧化塘貯存的糞水中四環(huán)素類抗性基因被有效降解了69%～99%,但是tetO、tetM和tetX的相對豐度在不同貯存時期較原始糞便顯著上升。

此外,畜禽糞污在進行無害化等處理方式進入到“土壤-植物”系統(tǒng)后,仍會使“土壤-植物”系統(tǒng)中部分畜禽糞肥源ARGs和可移動遺傳元件(Mobile Genetic Element,MGEs)的豐度和種類發(fā)生變化[30]。以tetX基因為例,會通過施肥的方式,從畜禽糞肥源傳播到生菜[31]。研究表明,施用有機肥導(dǎo)致胡蘿卜塊莖增加了12種ARGs和2個MGEs,ARGs和MGEs的相對豐度均較未施肥前顯著上升[32]。但是根際細菌群落穩(wěn)定性較高,對抗生素的刺激有抵抗作用,對ARGs的傳播起到阻遏作用[33]。由于ARGs 無法被降解、稀釋等自然過程完全去除,即使微生物裂解死亡后仍有部分ARGs 通過游離態(tài)的形式轉(zhuǎn)化到其他微生物體內(nèi)進行傳播擴散[34]。因此,即使停止施用糞肥,環(huán)境中的部分ARGs仍會維持在一個較高的水平[35]。

以種養(yǎng)結(jié)合模式為例,對畜禽糞肥源ARGs的暴露特征進行綜合分析,可初步推斷出畜禽糞肥源ARGs在不同暴露路徑下的暴露頻率,該暴露路徑主要包括直接路徑和間接路徑(圖2)。直接路徑指養(yǎng)殖場中部分畜禽糞肥源ARGs可通過環(huán)境接觸和呼吸等途徑直接擴散到人體內(nèi);間接路徑包括5個階段,“階段Ⅰ-Ⅴ”指的是不同種類畜禽糞肥源ARGs在“畜禽-糞便-糞肥-土壤-植物-人類”這幾個階段均有檢出,表明可能存在部分畜禽糞肥源ARGs通過該途徑擴散到人體內(nèi),進而對人類健康造成威脅。

圖2 種養(yǎng)結(jié)合模式下抗生素抗性基因的暴露路徑Fig.2 Exposure pathways of antibiotic resistance genes in planting-cultivation combination model

導(dǎo)致ARGs在各個傳播路徑豐度增加的主次因素很多[36],加之固有方法等因素的限制,解析ARGs在不同傳播階段暴露頻率增加的來源及傳播趨勢仍面臨著許多挑戰(zhàn)[37]。目前,國內(nèi)外對于ARGs的溯源已經(jīng)開展了許多研究。在建立抗生素與ARGs的關(guān)聯(lián)上,Duarte等[38]整合大量文獻中抗生素和 ARGs 相關(guān)性的數(shù)據(jù),使用線性混合模型將ARGs豐度與抗生素壓力相關(guān)聯(lián)。在建立其他因素與ARGs的關(guān)聯(lián)上,可采用模型評估方法對ARGs進行溯源分析,量化不同影響因素對評估體系中 ARGs的潛在貢獻[39]。

畜禽糞肥源ARGs作為生態(tài)風(fēng)險評估的對象,部分畜禽糞肥源ARGs會通過直接或間接的暴露路徑通過污染農(nóng)作物等方式危害人類健康[40]。因此,建立適用于不同畜禽糞肥源ARGs的暴露評估分析方法,通過篩選出在不同暴露路徑下暴露頻率較高的畜禽糞肥源ARGs類別,對于構(gòu)建畜禽糞肥源ARGs生態(tài)風(fēng)險評估框架具有重要意義[41]。

2.2 危害評估

危害評估是畜禽糞肥源ARGs生態(tài)風(fēng)險評估的第二個關(guān)鍵點,在該階段首先應(yīng)該明確需要開展危害評估的畜禽糞肥源AGRs的關(guān)鍵危害點,根據(jù)不同類別畜禽糞肥源AGRs危害特性的不同,結(jié)合抗性評估和傳播評估的手段,完成危害評估的過程。

2006年,ARGs被世界衛(wèi)生組織(WHO)作為下個世紀(jì)威脅人類健康的最重大挑戰(zhàn),其主要原因在于攜帶ARGs的微生物會對抗生素產(chǎn)生耐藥性[42]。一項對204個國家所有地區(qū)抗生素耐藥性影響的數(shù)據(jù)進行分析的研究表明,抗生素耐藥性現(xiàn)在是全球的主要死因,2019年有127萬人直接死于抗生素耐藥性,495萬人的死亡與抗生素耐藥性感染有關(guān),目前全球迫切需要解決抗生素耐藥性問題[43],而要解決抗生素殘留帶來的微生物的耐藥性問題就需要特別關(guān)注微生物抗生素耐藥性產(chǎn)生的根源——ARGs[44]。因此,評估畜禽糞肥源ARGs是否會導(dǎo)致微生物產(chǎn)生抗生素耐藥性,特別是人類和畜禽常用抗生素的耐藥性,是對暴露評估階段篩選出的畜禽糞肥源ARGs進行危害評估的第一個關(guān)鍵評估點。根據(jù)攜帶不同畜禽糞肥源ARGs的微生物對不同抗生素最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)的不同,可把抗生素的類別以及人類常用抗生素的相關(guān)程度和重要性等作為劃分依據(jù),對不同畜禽糞肥源ARGs的耐藥性危害等級做定性的歸類和劃分。

此外,ARGs還具有“可移動性”,該特性加劇了醫(yī)用或畜禽用抗生素治療失敗的可能性,同樣是對人類和動物健康造成重大威脅的關(guān)鍵危害點。研究表明,ARGs的傳播方式包括HGT和VGT。HGT 是指攜帶 ARGs 的菌株通過接合、轉(zhuǎn)化和傳導(dǎo)等方式將遺傳物質(zhì)傳遞給其他微生物而非其子代的過程[45-46],使其在同種或不同種細菌間進行傳播擴散成為可能,較VGT的傳播危害性更大[47]。其中,整合子、轉(zhuǎn)座子及質(zhì)粒等MGEs是HGT的重要載體[48]。系統(tǒng)發(fā)育距離、共享生態(tài)和基因組約束常被認(rèn)為是控制HGT的關(guān)鍵因素[49]。因此,通過與數(shù)據(jù)庫進行比對[50-51]等手段對畜禽糞肥源ARGs是否具有潛在“可移動性”進行評估判斷,是對暴露評估階段篩選出的畜禽糞肥源ARGs進行危害評估的第二個關(guān)鍵評估點。

“宿主致病性”是危害評估階段的第三個關(guān)鍵評估點?！八拗鳌敝傅氖菙y帶畜禽糞肥源ARGs的潛在宿主和畜禽糞肥源ARGs發(fā)生HGT后可能傳播到的新宿主,攜帶或可能通過HGT攜帶ARGs的微生物是否擁有“致病性”,是臨床抗生素治療失敗和“超級細菌”產(chǎn)生的關(guān)鍵因素。在此評估階段,可通過宏基因組學(xué)的方法對ARGs進行源追蹤[52],對其存在的宿主是否存在致病性進行評估;或可通過機器學(xué)習(xí)[53]、微流體技術(shù)[54]和熒光標(biāo)記等[55]方式對畜禽糞肥源ARGs發(fā)生HGT的潛在可能性和潛在宿主進行預(yù)測。通過判斷其潛在宿主和畜禽糞肥源ARGs可能通過HGT傳播到的微生物是否是致病菌,以及該致病菌與人類相關(guān)性的高低對不同畜禽糞肥源ARGs的危害性進行評估。

微生物抗性、可移動性和宿主致病性是對畜禽糞肥源ARGs進行危害評估的評估關(guān)鍵點,此外,畜禽糞肥源ARGs與人類和畜禽以及各類抗生素使用等的相關(guān)性對于危害評估的開展也有重要影響。在此階段,根據(jù)不同類別畜禽糞肥源ARGs的危害特性,理清關(guān)鍵危害評估點的主次順序,對不同類別畜禽糞肥源ARGs的抗性能力和傳播能力進行綜合評價,進而完成危害評估過程,對于構(gòu)建畜禽糞肥源 ARGs生態(tài)風(fēng)險評估框架具有重要作用。

2.3 風(fēng)險表征

風(fēng)險表征是生態(tài)風(fēng)險評估的最后一個階段,需要綜合暴露評估和危害評估的結(jié)果,通過定量或定性的方式對不同類別畜禽糞肥源ARGs的生態(tài)風(fēng)險進行描述。

在定性表征方面,最為典型的是Ellabaan等[10]構(gòu)建的ARGs生態(tài)風(fēng)險評估框架,該框架以ARGs作為暴露評估的對象,著重識別具有嚴(yán)重危害公共健康的 ARGs;以“宏基因組學(xué)”作為主要的數(shù)據(jù)分析方法,將“人類相關(guān)富集、基因遷移和宿主致病性”作為危害評估的三大要素,最后基于是否符合三大要素及符合哪些要素,將ARGs劃分為四個風(fēng)險等級。具體劃分依據(jù)如下:三大要素均符合的ARGs被認(rèn)定為風(fēng)險等級一;符合要素一和要素二的ARGs被認(rèn)定為風(fēng)險等級二;只符合要素一的ARGs被認(rèn)定為風(fēng)險等級三;三大要素均不符合的ARGs被認(rèn)定為風(fēng)險等級四。

在定量表征方面,最具代表性的是Zhang等[9]提出的風(fēng)險評估框架,該框架以ARGs作為暴露評估的對象,把“人類可及性、移動性、致病性和臨床可用性” 作為危害評估的四大要素。依據(jù)ARGs危害評估的要素特征,運用宏基因數(shù)據(jù)分析的方法,將每個要素的危害評估值量化。其中,“人類可及性”是通過計算AGRs在人類相關(guān)棲息地平均豐度和流行率的乘積來進行表示;“移動性”則是通過統(tǒng)計所有完整基因組中檢測到ARGs上游和下游5 kb以內(nèi)的MGEs數(shù)量總和來進行表示;“致病性”是通過計算攜帶ARGs病原體占總宿主的比例來進行表示;“臨床可用性”則通過計算ARGs與臨床可用抗生素相關(guān)的數(shù)量總和進行表示。接著,通過計算四個評估要素的乘積,將不同要素的危害評估值歸一化,進而得出不同ARGs的人類健康風(fēng)險指數(shù)。最后,依據(jù)不同ARGs人類健康風(fēng)險指數(shù)的數(shù)值大小,將指數(shù)排名前 25%的 ARGs被劃為風(fēng)險等級一級;排名在25%～50% 的ARGs被劃為風(fēng)險等級二級;排名在50%～75% 的ARGs被劃為風(fēng)險等級三級;剩余的則為風(fēng)險等級四級。由此可見,采用定量評估的方法對ARGs進行風(fēng)險表征不僅可以將ARGs劃分為不同的風(fēng)險級別,還可比較同一級別不同ARGs風(fēng)險值的大小和每一個危害要素對人類健康風(fēng)險指數(shù)的影響大小,相較于定性評估而言其獲得的結(jié)果更為豐富且準(zhǔn)確。

綜上可知,在對ARGs進行風(fēng)險表征時,定量評估的方法更優(yōu)于定性評估,因而在對畜禽糞肥源ARGs進行生態(tài)風(fēng)險評估時,可首先根據(jù)畜禽糞肥源ARGs的數(shù)據(jù)庫,采用宏基因組等方法通過對不同暴露特征和路徑等進行暴露評估,進而篩選出需進行危害評估的目標(biāo)ARGs。接著,基于不同種類畜禽糞肥源ARGs的危害特性,明確危害評估關(guān)鍵點對不同類別ARGs的主次效應(yīng),將其在單個暴露路徑的多個關(guān)鍵點進行綜合評估,完成單個暴露路徑目標(biāo)ARGs的危害評估過程。最后,可選用合適的定量或定性評估方法得出ARGs在各個暴露路徑的風(fēng)險總值,根據(jù)風(fēng)險總值的大小劃分畜禽糞肥源ARGs的風(fēng)險等級,以此作為畜禽糞肥源ARGs的生態(tài)風(fēng)險評估模型。

3 小 結(jié)

ARGs作為環(huán)境中的新型污染物,已對全球公共衛(wèi)生構(gòu)成重大威脅。建立畜禽糞肥源ARGs的生態(tài)風(fēng)險評估框架,闡明其在不同暴露路徑中的源匯機制和關(guān)鍵危害意義重大。國內(nèi)外學(xué)者圍繞畜禽糞肥源中ARGs的主要來源、轉(zhuǎn)移機制及抗生素抗性與微生物群落的互作機制開展了一系列的評估研究,但對于畜禽糞肥源ARGs和微生物功能群落之間的關(guān)系、傳播途徑中的影響因素以及造成的各種人類健康后果仍不明確。如何預(yù)測這幾個因素在不同暴露路徑下對畜禽糞肥源ARGs的影響,以及如何根據(jù)畜禽糞肥源ARGs關(guān)鍵危害點選擇適用的危害評估方法,提高畜禽糞肥源ARGs風(fēng)險表征的可信度,仍是畜禽糞肥源ARGs生態(tài)風(fēng)險評估中亟待解決的問題。