新型促排劑NBED對鈾的促排效果及機(jī)制

張夢丹，周文華，龔佳格，李鵬，高潔，李建國

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，山西 晉中 030619；2.中國輻射防護(hù)研究院/藥物毒理與放射損傷藥物山西省重點(diǎn)實驗室/中核放射毒理與放射性藥物臨床前評價重點(diǎn)實驗室，山西 太原 030006）

鈾（uranium，U）存在于巖石、土壤及水、食物和空氣中，是天然存在的重要放射性錒系元素。近年來，大量天然鈾經(jīng)提煉濃縮成富集鈾作為核工業(yè)中的重要核燃料，也被用于紡織業(yè)和制造業(yè)等其他領(lǐng)域［1］。自然界中，鈾有+3，+4，+5 和+6 共4 種價態(tài)，其中難溶性的四價態(tài)和易溶性的六價態(tài)化合物較為穩(wěn)定［2］。鈾主要通過皮膚接觸、呼吸和飲食等途徑進(jìn)入人體［3］。鈾會迅速轉(zhuǎn)移到血液中，以UO22+的形式與血液中的檸檬酸鹽、碳酸氫鹽和蛋白質(zhì)形成絡(luò)合物［4-5］，經(jīng)過血液循環(huán)通過腎小球過濾，結(jié)合在近端小管上皮部位導(dǎo)致近端小管損傷和腎功能衰竭［6-7］。隨著時間延長，鈾會大量附著于骨，影響骨的正常代謝和功能［8］。目前螯合療法被認(rèn)為是減少鈾等錒系元素內(nèi)污染的最有效的方法之一，而臨床除1.4%碳酸氫鈉可用外，僅有美國FDA 批準(zhǔn)的二乙胺五乙酸鹽用于鈾促排，但其與鈾酰的螯合物存在體內(nèi)不穩(wěn)定及無法進(jìn)入細(xì)胞等問題，促排效果均不理想［3，9］。因此，尋找高效、低毒的鈾促排劑一直是研究者努力的目標(biāo)。由中國輻射防護(hù)研究院自主設(shè)計合成的鄰苯二酚類促排劑N1，N2-雙（2，3-二羥基-4，6-二磺酸芐基）亞乙基二胺鈉鹽〔N1，N2-bis（2，3-dihydroxy-4，6-disulfonic acid benzyl）ethylenediamine sodium salt，NBED〕對钚、銅和鉛等具有較好的促排效果［10］。前期研究表明，ICR 小鼠ig 給予NBED能顯著降低腎和骨內(nèi)鈾含量［11］。本研究將從動物水平進(jìn)一步研究iv給予NBED對鈾的促排效果，并從熱力學(xué)水平探討NBED促排鈾的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物、主要試劑和儀器

NBED 由中國輻射防護(hù)研究院合成，相對分子質(zhì)量為712.52，為黃色粉末，相對純度為95%（用蒸餾水稀釋）；二乙烯三胺五乙酸鈣鈉鹽（DTPACaNa3，批號：20190-605）由軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所贈送；醋酸鈾?！睠4H6O6U（H2O）2，批號：U3873101B〕（用蒸餾水稀釋），上海吉至生化科技有限公司；硝酸（優(yōu)級純，批號：20200911），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；H2O2（分析純，批號：20200531），天津歐博凱化工有限公司；KCl（分析純，批號：20180502）和KOH（分析純，批號：20170327），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；HCl（分析純，批號：100620200602），湖南爾康制藥股份有限公司；超純水，Milli-Q超純水處理系統(tǒng)制備。

Milli-Q型超純水處理系統(tǒng)，美國Millipore公司；ZDJ-5B 型全自動電位滴定儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；NexION-5000型電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）儀，英國Perkin Elmer 公司；BSA124S 電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司。

1.2 動物、分組和給藥

48 只SPF 級ICR 雄性小鼠，體重18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，質(zhì)量合格證號：110011210106756516，實驗動物許可證號：SCXK（京）2016-0006。所有小鼠均飼養(yǎng)于中國輻射防護(hù)研究院藥物安全評價中心SPF 級動物房內(nèi)，小鼠自由攝食、飲水。本實驗所用動物及相關(guān)處置符合動物福利的要求，且在實驗開展前通過中國輻射防護(hù)研究院實驗動物管理和使用倫理委員會批準(zhǔn)。

據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將小鼠隨機(jī)分為6 組：正常對照組、鈾染毒組、鈾染毒+DTPA-CaNa3150 mg·kg-1組（劑量與臨床劑量相當(dāng)，配體/鈾摩爾比158∶1）、鈾染毒+NBED 45，90和180 mg·kg-1組（配體/鈾摩爾比分別為26∶1，52∶1 和104∶1）。所有小鼠均于實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。禁食過夜后，于第8 天開始實驗。除正常對照組外，其余各組每只小鼠尾靜脈iv 給予醋酸鈾?！蚕喈?dāng)于U（Ⅵ）0.03 mg〕［11］，隨后立即尾靜脈iv給予相應(yīng)藥物；正常對照組iv給予生理鹽水。給藥2 h后，小鼠可攝食、飲水。

1.3 lCP-MS測定小鼠組織中鈾含量

給藥24 h 后，脫臼處死小鼠，取兩腎、股骨、脾、肝和股骨外側(cè)肌肉，于80 ℃恒溫干燥至恒重；研磨均勻后，分別取0.02 g于燒杯中（因肝、脾和肌肉中鈾蓄積量較少，將三者合并為一組樣本處理），加入硝酸5 mL，于電加熱板150 ℃下消解至澄清；加入1 mL H2O2繼續(xù)消解至無色透明。當(dāng)溶液剩0.5～1.0 mL時停止加熱，經(jīng)稀硝酸0.5 mol·L-1稀釋后，采用ICP-MS法［1］測定腎、股骨和肝+脾+肌肉中的鈾含量（以每克干組織計）。ICP測定條件為：射頻入射功率為1600 W，霧化氣流速為1.03 L·min-1，輔助氣流速為1.3 L·min-1，等離子氣流速為16.25 L·min-1，溶液穩(wěn)定時間為50 s。每種樣品平行測定3次。

1.4 電位滴定法測定不同pH 條件下NBED 的解離常數(shù)

取71.2 mg NBED（0.1 mmol）加入電位滴定儀樣品池中，用移液管取0.1 mol·L-1KCl 溶液25 mL加入樣品池中并不斷攪拌，待NBED 溶解后滴加0.1 mol·L-1HCl 溶液2 mL。利用動態(tài)滴定模式滴定，即根據(jù)所測電動勢的變化決定加入KOH溶液的體積，共滴加4 mL KOH 溶液后停止實驗。得到1 組滴加體積與相應(yīng)電動勢的數(shù)據(jù)，用Hyperquad 2013 軟件擬合得到累積形成常數(shù)lgβ0lh［12］值，并根據(jù)式①～⑤計算得到NBED 的解離常數(shù)pKas［12］。實驗平行進(jìn)行3次，取平均值。

式中，n為NBED 數(shù)，S為配體NBED（表示為L）結(jié)合的H+數(shù)，K為平衡常數(shù)，β為累積形成常數(shù)。

1.5 電位滴定法測定NBED與鈾酰的絡(luò)合常數(shù)

取14.24 mg NBED（20 μmol·L-1）和4.24 mg醋酸鈾酰（10 μmol·L-1）加入樣品池中，用移液管取25 mL 0.1 mol·L-1KCl 加入樣品池中攪拌至溶解后，手動控制加入2 mL 0.1 mol·L-1HCl 溶液。后續(xù)同1.4 處理，根據(jù)式⑥～⑦計算得到NBED 與鈾酰的絡(luò)合常數(shù)［12］。實驗平行進(jìn)行3 次，取平均值。然后，基于計算結(jié)果利用Hyss 軟件得到不同pH 條件下UO22+配體不同絡(luò)合形式的分布曲線圖。

式中，m，l和n分別為溶液中UO22+，NBED和H+比率。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NBED降低鈾染毒小鼠組織中鈾含量

表1 結(jié)果表明，與鈾染毒組相比，DTPA-CaNa3（150 mg·kg-1）及各劑量NBED均可顯著降低腎內(nèi)鈾含量（P＜0.01），且NBED 180 mg·kg-1效果最佳；DTPA-CaNa3150 mg·kg-1（P＜0.05）和NBED 90，180 mg·kg-1（P＜0.01）顯著降低骨鈾含量，NBED 45 mg·kg-1無明顯作用；DTPA-CaNa3和NBED 180 mg·kg-1顯著降低肝+脾+肌肉內(nèi)鈾含量（P＜0.01），其余劑量NBED 無明顯作用；與陽性對照相比，鈾染毒+NBED 180 mg·kg-1組腎、骨、肝+脾+肌肉鈾含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.1 Efficacy of uranium removal from mice by N1，N2-bis（2，3-dihydroxy-4，6-disulfonic acid benzyl）ethylenediamine sodium salt（NBED）

2.2 不同pH條件下NBED的解離常數(shù)

NBED 的解離常數(shù)pKas，pKa1，pKa2，pKa3，pKa4，pKa5和pKa6分別為10.09，9.68，9.70，8.21，7.26 和4.84。表明NBED 在pH 10.09 時達(dá)到解離平衡；在低pH 條件下會被質(zhì)子化，pH 4.84 時達(dá)到質(zhì)子化平衡。由圖1 可知，在生理pH 條件下（pH 7.4），約有22.3% LH5（L 表示配體NBED），59.8% LH4和17.85% LH3存在于0.1 mol·L-1KCl 溶液中，LH4為主要存在形式。表明在生理環(huán)境下，NBED 主要進(jìn)行二級解離。

Fig.1 Species distribution of NBED at different pH determined by potentiometric titration.The solution contains 1×10-3 mol·L-1 NBED.L：deprotonated NBED ligand.

2.3 NBED與鈾酰的絡(luò)合常數(shù)

由圖2 可知，在pH 為3～11 范圍內(nèi)，NBED 與鈾酰絡(luò)合物存在4 種形式，分別是logβ111（12.5）和logβ101（9.8），logβ102（15.3），logβ1-12（6.5）。在pH 7.4時，該體系下溶液中游離鈾酰離子濃度為2.693×10-10mol·L-1，pUO2為9.57；大約有75.3%（UO2）L22-，21.7%（UO2）L 和2.956%（UO2）L2H-13-存在于0.1 mol·L-1KCl溶液中。表明NBED對鈾酰具有較強(qiáng)的親和力，且在人體生理環(huán)境下主要以2∶1的形式形成（UO2）L22-復(fù)合物，并排出體外。

Fig.2 Species distribution of UO22+/NBED systems at different pH determined by potentiometric titration.The solution contains 1×10-4 mol·L-1 UO22+and 1×10-3 mol·L-1 NBED.

3 討論

本研究結(jié)果表明，NBED可顯著降低腎、骨、肝、脾和肌肉內(nèi)鈾蓄積量，且優(yōu)于DTPA-CaNa3。以NBED 口服劑量300 mg·kg-1折算得靜脈給藥劑量為180 mg·kg-1，該劑量NBED 能分別減少腎、骨、肝+脾+肌肉中66.5%，54.8%，38.2%的鈾蓄積量，促排效果優(yōu)于口服給藥，ICR 小鼠ig 給予NBED 300 mg·kg-1可使腎和骨內(nèi)鈾含量分別降低44.3%和18.8%［11］。DTPA-CaNa3臨床折算劑量為150 mg·kg-1，其促排效果與NBED 90 mg·kg-1相當(dāng)。連有磺酸基的鄰苯二酚類促排劑（CAMS）被認(rèn)為是對骨鈾促排最有效的配體［13］。Durbin 等［13］篩選出的對鈾有較好促排效果的CAMS 類促排劑5-LICAM（S），當(dāng)配體/鈾摩爾比為91∶1 時，立即ip給藥，24 h可顯著降低腎鈾62%、骨鈾49%。HOPO類配體是目前報道的促排鈾效果最強(qiáng)的一類化合物，其中5-LI-1-Cm-3，2-HOPO（配體/鈾摩爾比92∶1）立即ip 給藥后，24h 可顯著降低腎鈾82.7%、骨鈾39.0%［13］。表明NBED是較佳的骨鈾促排劑。

鈾的電子層構(gòu)型是［Rn］5f36d17s2，因5f 和6d雜化軌道的影響，U與O形成雙鍵，使其具有較強(qiáng)的惰性［14］。因此，螯合劑只能從空間位阻最小的赤道平面提供電子進(jìn)入5f 和6d 的空軌道進(jìn)行配位［15］。UO22+可以與O，N，S，I 等多種原子配位，但本質(zhì)上屬于硬酸，更容易與O 配位，如羧基、羥基、磷酸基等［16］。本研究所自主設(shè)計合成的NBED 是由線性氨基烷鏈連接2 個鄰苯二酚結(jié)構(gòu)單元組成，空間結(jié)構(gòu)上提供的H和O原子可使NBED更好的與U（Ⅵ）配位。熱力學(xué)水平研究NBED的解離常數(shù)和NBED與鈾酰的絡(luò)合常數(shù)發(fā)現(xiàn)，在生理條件下，NBED主要以LH5，LH4和LH3形式存在，其比例分別為22.3%，59.8%和17.85%，主要以失去2 個氫的LH4形式存在；在生理條件下，NBED 與鈾主要有3 種絡(luò)合形式，分別為75.3%（UO2）L22-，21.7%（UO2）L 和2.956%（UO2）L2H-13-，NBED 與鈾酰主要以2∶1 螯合存在。即在生理條件下，2 個NBED 分子鄰苯二酚上的酚羥基共失去4個氫原子，從而產(chǎn)生4個O原子占據(jù)鈾酰的5f和6 d的空軌道進(jìn)行配位。

綜上所述，新型促排劑NBED 在體內(nèi)主要以失去2 個氫的LH4 形式存在，與鈾酰主要以2∶1 的螯合形式形成NBED-鈾酰復(fù)合物排出體外，且NBED靜脈給藥能顯著降低腎、骨、肝、脾和肌肉內(nèi)鈾含量，促排效果優(yōu)于DTPA-CaNa3，與目前正在研究的其他促排藥相比，對骨鈾的促排效果更顯著。由此可見，NBED是一種有前景的新型促排劑，對鈾具有較好的促排效果。后續(xù)可基于其對骨較好的促排效果進(jìn)行進(jìn)一步機(jī)制和結(jié)構(gòu)優(yōu)化研究。