參麥須根多糖顆粒的制備及其免疫功能評價

蔣全興，張 果，韋皓琪，張思睿，龔昱丹，余函芮，殷中瓊，2，鄒元鋒，2*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院天然藥物研究中心，四川 成都 611130；2.四川省動物疾病與人類健康重點實驗室，四川 成都 611130）

“生脈飲”收錄于《中國藥典》，是由人參、麥冬及五味子組成的傳統(tǒng)中藥復(fù)方，有益氣復(fù)脈、養(yǎng)陰生津的功效。生產(chǎn)實踐中，人參的主根和麥冬的塊根被采收，留下的須根并未得到有效合理地利用而遭到浪費。筆者課題組研究發(fā)現(xiàn)須根和主根塊根間的大類成分相似，因此本試驗選用了人參和麥冬的非藥用部位——須根作為原料，提取其中的多糖，制備顆粒并添加至免疫低下小鼠的飼料中，研究參麥須根多糖的免疫活性。

1 材料與方法

1.1 試驗藥材 人參須根購買于成都荷花池中藥材市場，麥冬須根采自四川三臺縣。將人參須根和麥冬須根用蒸餾水洗凈、烘干，再用藥材粉碎機粉碎，過60目篩備用。

1.2 主要試劑和儀器 乙醇、苯酚（5%）、濃硫酸（98%）、淀粉、糊精、無水葡萄糖，藥材粉碎機、恒溫電熱套、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器、iMark酶標儀。

1.3 藥材除雜 參麥須根的除雜：取100 g 人參須根和麥冬須根粉末置于圓底燒瓶中，圓底燒瓶放置于水浴鍋中，通入冷凝水以達到冷凝回流的效果，加入15 倍的無水乙醇溶液，在水浴鍋中加熱1 h為一次除雜，共除雜5次。

1.4 參麥須根多糖提取工藝的優(yōu)化

1.4.1 單因素試驗 采用水提法優(yōu)化提取工藝，首先進行單因素試驗的篩選，考察因素有料液比、提取溫度和提取時間。每個因素設(shè)置5 個水平，料液比設(shè)1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55 g/mL，提取時間設(shè)0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，提取溫度設(shè)80、85、90、95、100℃，每個水平設(shè)3個重復(fù)。按照上述水提條件獲取水提液，并離心5min（3500r/min），小心吸取上清液200 μL轉(zhuǎn)移至潔凈玻璃試管中，采用苯酚-硫酸法測定上清液中的總多糖含量，計算得率。

1.4.2 正交試驗 通過單因素試驗篩選后最終確定每個水平的最優(yōu)條件，在最優(yōu)條件附近取兩個參數(shù)進行正交試驗。用SPSS 25.0 設(shè)計正交試驗表，按照表中的條件組合進行驗證，進而確定參麥須根多糖的最優(yōu)水提工藝。

1.4.3 總多糖含量的測定 精密吸取樣品溶液50 μL 置于容量瓶中，定容至1 mL，再精密量取200 μL于試管中，加入5%苯酚溶液200 μL，迅速加入1 mL 98% H2SO4，搖勻后靜置30 min，吸取200 μL于96孔板中，以蒸餾水作空白對照。在多糖的最大吸收峰490 nm處用酶標儀檢測，按葡萄糖標準曲線計算多糖含量（葡萄糖標準曲線如圖1 所示），每個樣品檢測3 次，計算提取率。計算公式如下：

圖1 葡萄糖標準曲線

1.4.4 參麥須根多糖顆粒的制備 將按最佳工藝得到的參麥須根提取液減壓濃縮至1 g/mL，加入4 倍無水乙醇靜置12 h，然后將下沉沉淀轉(zhuǎn)移至離心機中離心10 min（3 500 r/min），取沉淀物與淀粉-糊精的混合物按1∶1.5 的比例混合均勻至“握之成團、觸之即散”的狀態(tài)，其中淀粉、糊精混合物的比例為2∶1，過篩后放置烘箱中烘干得到。

1.5 參麥須根多糖顆粒對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用

1.5.1 試驗設(shè)計 將60 kg基礎(chǔ)日糧磨制成粉，均分三份，在飼料中以0.25%、0.5%、1%的劑量加入多糖顆粒，拌勻。再用飼料顆粒機制成顆粒飼料，常溫保存。

試驗一共選取50 只昆明小鼠，分為5 組，分別為空白對照組、模型組、低劑量組（0.25%）、中劑量組（0.5%）和高劑量組（1%）?？瞻捉M小鼠腹腔注射生理鹽水，其余組別的小鼠以每天60 mg/kg 的劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺（CY），連續(xù)3 d，至小鼠出現(xiàn)精神萎靡和被毛逆立為造模成功。模型建立后，飼喂上述添加了參麥須根多糖的飼料10 d，每天關(guān)注小鼠的采食、體重等基礎(chǔ)指標。

1.5.2 對臟器指數(shù)的影響 試驗結(jié)束當(dāng)天，采集小鼠眼球血1.5 mL 于EP 管中，然后脫頸處死小鼠，小心摘除脾臟和胸腺，用濾紙吸干表面的血液，然后用電子天平（感量0.1 mg）稱重。

1.5.3 對血清中抗體及細胞因子分泌的影響 眼球血采集后先靜置30～60 min，使大部分纖維蛋白沉淀，然后以4 000 r/min 于4 ℃條件下離心15 min，小心吸取上清，分裝，-20 ℃冰箱保存。采用小鼠專用的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒檢測小鼠血清中分泌抗體IgG 及細胞因子IL-2、IL-10、IFN-γ的含量。

1.6 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行單因數(shù)方差分析（ANOVA），采用LSD法進行組間多重比較。當(dāng)P＜0.05時，表示差異顯著；P＜0.01時，表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 參麥須根多糖的提取工藝

2.1.1 單因素試驗結(jié)果 由圖2 可知，多糖提取率隨溫度增加而增加，當(dāng)達到100 ℃時多糖提取率最高，達到19.89%。因此，選擇提取溫度100 ℃為中心值，并選取90 ℃和95 ℃2個水平再進行后續(xù)的正交試驗。

圖2 提取溫度對多糖得率的影響

由圖3 可知，多糖提取率隨著提取時間的增加而增加，在2.0h時提取率最高（24.44%），在2.5h后提取率下降。因此，將2.0 h 設(shè)定為中間值，在兩邊取1.5 h 和2.5 h 兩個水平再進行后續(xù)的正交試驗。

圖3 提取時間對多糖得率的影響

由圖4可知，提取料液比在1∶25g/mL時提取率達到最高（25.14%），隨著料液比的增加，其提取率有降低的趨勢。因此，將料液比1∶25 g/mL 設(shè)為中心值，在兩邊取1∶20 和1∶35 g/mL 兩個水平再進行后續(xù)的正交試驗。

圖4 提取料液比對多糖得率的影響

2.1.2 正交試驗結(jié)果 利用SPSS 25.0 軟件設(shè)計出9 組組合進行正交試驗（見表1），通過軟件分析可知，對多糖提取含量的影響因素中，提取溫度＞提取時間＞料液比，其中提取溫度和提取時間都對多糖得率有顯著性影響。通過單因素試驗和正交試驗最終分析出最優(yōu)提取工藝如下：提取溫度100℃，提取時間為2.5h，料液比為1∶35g/mL。

表1 正交試驗表

按照正交分析得出最優(yōu)組合的條件進行驗證試驗，測得多糖提取率為（29.62±0.95）%，大于正交試驗中最大組合的多糖含量，符合試驗預(yù)期。

2.2 參麥須根多糖顆粒對免疫低下小鼠的臟器指數(shù)的影響 由表2 可知，當(dāng)對環(huán)磷酰胺造成的免疫低下小鼠使用參麥須根多糖顆粒后，所有組別的脾臟指數(shù)都顯著高于模型組（P＜0.05），且低、中、高劑量組呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。對胸腺指數(shù)而言，各個組別間無顯著差異（P＞0.05），但是各劑量組之間也呈現(xiàn)出劑量依賴性。

表2 各組的臟器指數(shù)比較

2.3 參麥須根多糖顆粒對血清免疫因子含量的影響 為了進一步說明參麥須根多糖顆粒的免疫調(diào)節(jié)作用，本研究通過ELISA 試劑盒測定了小鼠血清中免疫球蛋白細胞因子的分泌變化。結(jié)果顯示：添加參麥須根多糖顆粒后，除低劑量組外，其余組別小鼠血清中的免疫球蛋白IgG和IL-2含量與模型組之間都有顯著性差異（P＜0.05），且趨勢相同，其中中劑量組顯著低于空白組（P＜0.05），又顯著高于模型組（P＜0.05），高劑量組極顯著的高于模型組（P＜0.01）；對細胞因子IL-10含量的影響則是，高劑量組和空白組血清中的IL-10 含量顯著高于模型組（P＜0.05），其余組別無顯著性差異；空白組血清中的IFN-γ含量顯著高于模型組。

3 討論

3.1 提取因素對多糖提取率的影響 人參和麥冬均為我國傳統(tǒng)的中藥材，多糖是其中發(fā)揮效果的最主要活性物質(zhì)之一，是研究的重點。然而，本試驗提取的是人參須根和麥冬須根中的多糖，目前鮮有研究報道。張國榮等［1］以料液比、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)4個因素考察了紅參多糖的最佳提取工藝。結(jié)果如下：料液比1∶8，溫度為100 ℃，次數(shù)為3 次，時間為3 h；對提取率的影響依次為提取溫度＞提取時間＞料液比。李晶等［2］研究表明，麥冬多糖最優(yōu)水提工藝中對提取率的影響因素依次為提取時間＞提取溫度＞料液比。本研究中對參麥須根多糖提取率的影響因素依次為提取溫度＞提取時間＞料液比，這與本課題組之前的研究結(jié)論一致［3］，原因是參麥須根和主根的大類成分相似，因此對提取率的影響因素也相同。

3.2 參麥須根多糖對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié) 多糖作為主要的活性大分子，是有提高免疫力、提高抗氧化能力、抗炎抗腫瘤等多種藥理活性，多糖對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，主要表現(xiàn)為免疫增強或免疫刺激［4］。本試驗發(fā)現(xiàn)，添加參麥須根多糖顆粒后可以改善環(huán)磷酰胺對小鼠引起的免疫抑制，從而提高免疫器官的重量，這與伍芳芳［5］的研究結(jié)果一致。此外，本試驗分別檢測了環(huán)磷酰胺造模引起的免疫低下小鼠血清中的IgG、IL-2、IL-10、IFN-γ含量，作為評價機體免疫水平的指標，以綜合判斷小鼠的免疫性能。IgG 作為機體中免疫球蛋白的主成分，其含量的多少與機體免疫力的高低直接相關(guān)，本試驗中采食了參麥須根多糖日糧的小鼠體內(nèi)的IgG含量顯著提高。IL-2能刺激T 細胞進入細胞分裂周期，增強T 細胞的殺傷活性，本試驗中中、高劑量組的參麥須根多糖均能提高血清中IL-2的含量，這與之前的研究結(jié)果一致［6］。IL-10 是機體內(nèi)重要的抗炎因子之一，它的表達水平與炎癥反應(yīng)呈負相關(guān)，在維持正常免疫調(diào)節(jié)中作用顯著，本研究發(fā)現(xiàn)高劑量的多糖增加了血清中IL-10 的含量，與林?。?］的研究結(jié)果一致。IFN-γ也能激活免疫細胞，控制細胞增殖，從而調(diào)節(jié)機體免疫功能，本研究結(jié)果表明添加參麥須根多糖能顯著增加IFN-γ的含量。

4 結(jié)論

本研究表明，參麥須根多糖的最優(yōu)提取工藝為：提取溫度100 ℃，提取時間2.5 h，料液比1∶35 g/mL，其多糖提取率為（29.62±0.95）%。將參麥須根多糖飼喂免疫低下小鼠后，與模型組相比能顯著增加脾臟指數(shù)，同時能顯著增加血清中的IgG和IL-2含量，對IL-10和IFN-γ的含量也有一定提升作用；且以添加量為1%時效果最佳，幾乎能完全消除來自環(huán)磷酰胺造成的免疫抑制。因此，把參麥須根多糖顆粒作為一種潛在的免疫調(diào)節(jié)藥物添加至飼料中，將會有廣闊的應(yīng)用前景。