鹽誘導(dǎo)激酶3基因表達(dá)在人類腫瘤中的預(yù)后與免疫浸潤相關(guān)性分析

陳雅明，蘇慧琳，曾元寧，，王秋紅

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點實驗室·黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040；2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院·廣東省中藥飲片規(guī)范化炮制工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006

鹽誘導(dǎo)激酶3（SIK3）是鹽誘導(dǎo)激酶家族成員之一，屬于5’-AMP 活化蛋白激酶（AMPK）相關(guān)激酶家族［1］。SIK3基因?qū)φ{(diào)節(jié)肝臟糖異生［2］、調(diào)控細(xì)胞周期以及對腫瘤細(xì)胞［3］的生長有重要作用，在人體中各部位均有表達(dá)。有研究［4］表明，SIK3 蛋白在卵巢癌中和三陰性乳腺癌過度表達(dá)，能促進乳腺癌細(xì)胞的G1/S細(xì)胞周期的進程以及特異性趨化因子CXCR4 的釋放以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞增殖，增強mTOR 介導(dǎo)小鼠的有氧糖酵解［5］。此外，SIK3 基因的表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞的生長［6］，能促進急性髓系白血病的發(fā)生［7］。在晚期漿液性卵巢癌中，SIK3在低表達(dá)患者的總生存期（OS）和無進展生存期（PFS）低于高表達(dá)患者，敲除部分SIK3 基因的卵巢癌細(xì)胞能增加對紫杉醇加順鉑治療的化學(xué)抗性［8］。

SIK3基因?qū)Π┌Y的發(fā)生和發(fā)展發(fā)揮著重要作用，可能是癌癥治療和預(yù)后生物標(biāo)志物的潛在重要靶點?；谝延醒芯恐邪┌Y發(fā)生發(fā)展與SIK3基因之間的聯(lián)系，本研究對SIK3基因表達(dá)在人類腫瘤中進行了泛癌化分析，使用TCGA數(shù)據(jù)庫和GEO 數(shù)據(jù)庫等探究SIK3 基因在腫瘤中的基因表達(dá)、生存狀態(tài)以及蛋白質(zhì)磷酸化位點，并進行了SIK3基因與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞浸潤相關(guān)性分析，以研究SIK3基因在不同癌癥中的發(fā)病機制和臨床預(yù)后中的作用。

1 材料與方法

1.1 SIK3基因泛癌分析

分別在TIMER2（http://timer.cistrome.org/）和GEPIA2（http://gepia2.cancer-pku.cn/#index） 中點擊“檢索”“基因”并輸入“SIK3”，檢索出SIK3 基因在腫瘤與正常組織之間的基因表達(dá)差異。

1.2 SIK3蛋白泛癌分析

在 Ualcan （http://ualcan.path.uab.edu/index.html） 和GEPIA2 的“Expression Analysis”模塊中的“Expression DIY”以獲得在TCGA 腫瘤組織不同病理階段（Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期）中SIK3 基因型表達(dá)的小提取圖（P≤0.01）。

1.3 SIK3蛋白質(zhì)磷酸化分析

在Ualcan 數(shù)據(jù)庫中輸入“SIK3”檢索，分析在原發(fā)性腫瘤和正常組織中SIK3細(xì)胞磷酸化位點，包括乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸腺癌、腎透明細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌、肺腺癌。

1.4 泛癌分析SIK3基因的預(yù)后情況

利用在線工具GEPIA2 的“Survival Analysis”模塊中輸入“SIK3”以獲取“Overall Survival”和“Disease Free Survival”生存曲線圖。通過Cutoff-high （50%） and cutoff-low （50%） values作為高表達(dá)和低表達(dá)組的閾值。

1.5 SIK3基因遺傳變異分析

登錄cBioPortal 網(wǎng)站（https://www.cbioportal.org/），選擇“Query”中的“TCGAPanCencer Atlas Studies”，并輸入“SIK3”用于檢索SIK3 基因變異特征。變異的結(jié)果在“Cancer Types Summary”對所有TCGA 腫瘤的頻率、突變類型和CNA（拷貝數(shù)改變）進行展示。

1.6 SIK3與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞浸潤相關(guān)性分析

使用TIMER2數(shù)據(jù)庫的“Immune”模塊來探索SIK3表達(dá)與所有TCGA 腫瘤免疫浸潤之間的關(guān)聯(lián)，免疫細(xì)胞選擇CD8+T 細(xì)胞和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞。根據(jù)CIBERSORT、CIBERSORT-ABS、 QUANTISEQ、 XCELL、 MCPCOUNTER 和EPIC 算法估計免疫浸潤。根據(jù)P 值與偏微分方程相關(guān)性（cor）值調(diào)整純度后的獲得數(shù)據(jù)，以熱圖和散點圖展示。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

使用TIMER 數(shù)據(jù)庫和GTEx 數(shù)據(jù)庫中下載的正常組織和腫瘤組織中的SIK3 mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)，進行Kaplan-Meier生存曲線分析，并采用Log-rank 檢驗。使用SPSS 16.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SIK3基因在不同腫瘤中的表達(dá)

使用TIMER 數(shù)據(jù)庫和GTEx 數(shù)據(jù)庫聯(lián)合分析正常組織和腫瘤樣本中SIK3 mRNA 的表達(dá)水平。如圖1、圖2 所示，相比于正常組織，SIK3 基因在13 種癌癥中低表達(dá)，包括膀胱尿路上皮癌（BLCA）、乳腺癌（BRCA）、結(jié)腸腺癌（COAD）、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）、腎透明細(xì)胞癌（KIRC）、 腎乳頭狀細(xì)胞癌（KIRP）、 肺腺癌（LUAD）、肺鱗狀細(xì)胞癌（LUSC）、前列腺癌（PRAD）、直腸腺癌（READ）、甲狀腺癌（THCA）、子宮內(nèi)膜癌（UCEC）、睪丸生殖細(xì)胞瘤（TGCT），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 TIMER數(shù)據(jù)庫中SIK3基因在不同癌癥中的表達(dá)情況

圖2 GTEx數(shù)據(jù)庫中SIK3基因在不同癌癥中的表達(dá)情況

2.2 SIK3蛋白在不同腫瘤中的表達(dá)

與正常組織相比，SIK3 蛋白在BRCA、KIRC、LUAD中為低表達(dá)，見圖3。使用HEPIA2A 數(shù)據(jù)庫后在病理分期圖中顯示，SIK3 表達(dá)與癌癥病理的不同時期有顯著差異，包括在BLCA、BRCA、KIRC、胰腺癌（PAAD）、THCA，見圖4。

圖3 SIK蛋白在不同癌癥中的表達(dá)情況

圖4 SIK蛋白在不同癌癥時期中的表達(dá)情況

2.3 SIK3生存分析數(shù)據(jù)

使用TGCA和GEO數(shù)據(jù)庫根據(jù)SIK3蛋白表達(dá)水平將腫瘤病例進行分類，并繪制Kaplan-Meier曲線以研究SIK3的表達(dá)與不同腫瘤患者的預(yù)后情況。SIK3的高表達(dá)與腎上腺皮質(zhì)癌（ACC）預(yù)后不良存在相關(guān)性（P=0.014），預(yù)后SIK3 低表達(dá)存活率更高；SIK3 的低表達(dá)與KIRC、腦低級別膠質(zhì)瘤（LGG）、間皮瘤（MESO）、PAAD、膽管癌（CHOL）、THCA 預(yù)后不良存在相關(guān)性，特別在KIRC 中，SIK3低表達(dá)導(dǎo)致生存率顯著降低，見圖5。

圖5 SIK3基因表達(dá)水平與不同癌癥預(yù)后關(guān)聯(lián)性分析

2.4 SIK3基因突變頻率在多種癌癥中的表達(dá)

使用cBioportal 工具研究SIK3 基因在各種腫瘤中的變異情況，見圖6。其中，子宮肌瘤中的SIK3 突變率為9.07%，其中突變頻率為8.51%（45/529），擴增頻率為0.19%（1/529），基因缺失頻率為0.38%（2/529）。

圖6 多種癌癥中SIK3突變頻率

2.5 SIK3蛋白在各種癌癥中的磷酸化位點及表達(dá)水平

使用Ualcan工具比較正常人與患者的組織和腫瘤之間SIK3蛋白磷酸化水平差異。使用CPTAC數(shù)據(jù)集，對6種類型腫瘤進行分析，包括BRCA、腎細(xì)胞癌（RCC）、COAD、LUAD、卵巢癌（OV）、UCEC。在乳腺癌中SIK3磷酸化水平降低，在RCC 中SIK3 磷酸化水平升高，在COAD 中SIK3 磷酸化水平降低，在LUAD 中SIK3 磷酸化水平降低，在OV 中SIK3 磷酸化水平降低，在UCEC 中SIK3 磷酸化水平降低，見圖7。

圖7 SIK3蛋白在不同癌癥中的磷酸化位點和表達(dá)水平

2.6 SIK3與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞浸潤的相關(guān)性分析

使用TIMER2 工具并根據(jù)EPIC、 MCPCOUNTER、TIDE算法用于研究在TGCA中SIK3與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞浸潤相關(guān)性分析，生成腫瘤的散點圖數(shù)據(jù)。SIK3在免疫浸潤T 細(xì)胞表達(dá)中，與COAD、頭頸鱗狀細(xì)胞癌（HNSC）、HPV 感染的頭頸部鱗癌（HNSC-HPV +）、 PAAD、READ、胃癌（STAD）、TGCT、胸腺癌（THYM）呈正相關(guān)，與LGG 呈負(fù)相關(guān)。例如，基于MCPCOUNTER 算法，COAD 中SIK3 表達(dá)水平與癌相關(guān)成纖維細(xì)胞浸潤水平呈正相關(guān)（RHO=0.421，P=2.88e-13），見圖8。

圖8 SIK3與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞浸潤的相關(guān)性分析

3 討論

本研究通過對SIK3基因在人類腫瘤進行泛癌分析，探究了SIK3基因的表達(dá)情況、預(yù)后情況、基因變異、蛋白磷酸化位點及表達(dá)水平，最后對SIK3與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞浸潤的相關(guān)性進行分析。結(jié)果表明，SIK3在多種癌癥中異常表達(dá)，與正常組織相比，SIK3 基因在13 種癌癥中低表達(dá)，在不同癌癥的不同病理階段中SIK3蛋白的表達(dá)也有顯著差異，揭示了SIK3 基因的表達(dá)可能影響了BLCA、BRCA、 COAD、 GBM、 KIRC、 KIRP、 LUAD、 LUSC、PRAD、READ、THCA、UCEC 和TGCT 等多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展。已有研究表明，SIK3 基因可參與小鼠的生命過程，調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)的穩(wěn)態(tài)［9］，經(jīng)敲除后能導(dǎo)致小鼠骨骼嚴(yán)重畸形，大多數(shù)在出生時死亡［10］。此外，SIK3 基因敲除后可導(dǎo)致小鼠發(fā)育過程中出現(xiàn)衰老［11］，同時還會出現(xiàn)糖異生缺陷［12］和內(nèi)毒素休克的超敏反應(yīng)［13］。Armouti 等［14］研究表明，16 周齡雌性小鼠SIK3 基因經(jīng)敲除后，卵巢缺乏排卵前泡和黃體，并含有大量出血性卵泡，并內(nèi)有均勻、無細(xì)胞、嗜酸性物質(zhì)的沉積物。

通過Kaplan-Meier 生存分析發(fā)現(xiàn)，SIK3 的高表達(dá)與ACC 預(yù)后不良存在相關(guān)性，預(yù)后SIK3 低表達(dá)存活率更高，揭示了SIK3 基因可能在ACC 中起促癌基因的作用。SIK3的低表達(dá)與KIRC、LGG、MESO、PAAD、CHOL、THCA預(yù)后不良存在相關(guān)性，特別在KIRC 中，SIK3 低表達(dá)導(dǎo)致生存率顯著降低，揭示SIK3基因可能在KIRC、LGG、MESO、PAAD、CHOL、THCA 中起抑癌基因的作用。此外在子宮肌瘤中SIK3 基因突變概率較高。進一步分析發(fā)現(xiàn)，SIK3 蛋白在RCC 中磷酸化水平升高，在BRCA、COAD、LUAD、OV和UCEC 5種癌癥中磷酸化水平降低。

已有研究［15］表明，SIK3 基因表達(dá)促進組蛋白乙?；噶姿峄竽苷T導(dǎo)細(xì)胞增殖和惡性腫瘤的發(fā)生，SIK3過表達(dá)能促進細(xì)胞周期的進程并通過激活cSrc-磷酸肌醇3-激酶通道誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，隨后p21 Waf/Cip1 下調(diào)，增加小鼠腫瘤的發(fā)生［14］。SIK3 能誘導(dǎo)促炎精氨酸代謝，通過MMP-9 激活誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移性蛋白CXCR4 的表達(dá)。三陰性乳腺癌細(xì)胞經(jīng)高鹽和IL-17 共同刺激多種乳腺癌細(xì)胞后，SIK3蛋白表達(dá)特異性上調(diào)，協(xié)同誘導(dǎo)癌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和增殖［16］。

腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，與癌癥的發(fā)生、發(fā)展或轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。據(jù)報道［17］，腫瘤微環(huán)境基質(zhì)中的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞參與調(diào)節(jié)各種腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的功能。根據(jù)EPIC、MCPCOUNTER、TIDE算法研究在TGCA 中SIK3 基因在免疫浸潤T 細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SIK3 基因與COAD、HNSC、HNSC-HPV+、PAAD、READ、STAD、TGCT、THYM 呈正相關(guān)，與LGG呈負(fù)相關(guān)，顯示了SIK3基因表達(dá)的預(yù)后價值。腫瘤微環(huán)境具有多種炎性細(xì)胞因子和趨化因子，已被證明可介導(dǎo)癌癥的進展和增殖。在腫瘤微環(huán)境中，雖然腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗炎活性氧和活性氮增加，但腫瘤細(xì)胞周圍存在相反的抗炎巨噬細(xì)胞表型，以抑制癌細(xì)胞的免疫消除，SIK3可能會根據(jù)細(xì)胞類型和單個細(xì)胞表型的細(xì)胞分化狀態(tài)發(fā)揮不同作用，這些細(xì)胞表型積累作用以促進腫瘤生長。有研究［18］表明，SIK3在多發(fā)性骨髓瘤和急性髓系白血病細(xì)胞系表達(dá)居較高水平。而實驗［19］表明，大黃素和小檗堿聯(lián)合用藥能顯著降低SIK3活性，抑制乳腺癌細(xì)胞的生長、阻滯細(xì)胞周期和凋亡。

綜上所述，SIK3基因的表達(dá)與人類多種腫瘤進程密切相關(guān)，SIK3在多種腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞間存在顯著的差異表達(dá)，與ACC 等癌癥的預(yù)后和多種免疫浸潤T 細(xì)胞的表達(dá)存在相關(guān)性，表明SIK3 在腫瘤免疫微環(huán)境中起重要作用，可能作為腫瘤潛在診斷標(biāo)志物以及癌癥治療新靶標(biāo)。后續(xù)可研究SIK3 基因在癌癥細(xì)胞和正常細(xì)胞中的蛋白表達(dá)差異，進一步研究其在癌癥中的作用機制及相關(guān)通路分析。