二甲雙胍治療強(qiáng)直性脊柱炎模型小鼠后的骨密度與關(guān)節(jié)炎評(píng)分變化

鄭錦暢 向旻 孫杰聰 林瀚 魏波 吳少科 胡資兵

廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院脊柱微創(chuàng)外科，湛江 524001

強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）主要病理改變及影像學(xué)特征是關(guān)節(jié)及肌腱附著點(diǎn)的慢性炎癥、異位骨化和骨質(zhì)疏松［1-2］。AS 骨代謝異常是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和脆性骨折的直接原因，由多種信號(hào)通路調(diào)控［3-4］。目前，尚無藥物可完全終止AS 疾病的進(jìn)展。因此，尋找有效的藥物治療AS十分必要。

二甲雙胍是經(jīng)典的降糖藥物。有研究顯示，二甲雙胍可通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化過程［5］。McCarthy 等［6］研究，二甲雙胍促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的機(jī)制可能是通過激活ERK 信號(hào)通路和增加e/iNOS 表達(dá)引起的。Pham 等［7］的研究也證實(shí)了上述結(jié)果。Kasai 等［8］的研究發(fā)現(xiàn)大劑量的二甲雙胍導(dǎo)致成骨活性下降，小劑量的二甲雙胍促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化。二甲雙胍除了降糖作用以外，還具有參與糖尿病骨代謝、心血管保護(hù)、腫瘤抑制等作用［9-11］。但以上研究都是基于糖代謝異常的基礎(chǔ)上進(jìn)行的研究，二甲雙胍是否干預(yù)AS 骨代謝尚未清楚。本實(shí)驗(yàn)用二甲雙胍灌胃AS 模型小鼠，探討其外周關(guān)節(jié)炎及骨密度的變化。

資料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

研究時(shí)間為2021年9月至2022年6月。實(shí)驗(yàn)小鼠由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，無特定病原體（SPF）級(jí)，4 周齡健康雌性BALB/c 小鼠［許可證號(hào)SCXK（粵）2018-0002］，體質(zhì)量（14±1）g，共30只，飼養(yǎng)環(huán)境60%～68%的相對(duì)濕度，室溫（23±2）℃，光照周期12∶12，光照強(qiáng)度15～20 Iux。所有小鼠進(jìn)行食物和水的自由飼養(yǎng)。

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣東醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意（GDY2002276），本實(shí)驗(yàn)遵循和符合廣東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用規(guī)范（No.GDY2002276）。

2.實(shí)驗(yàn)器材和試劑

蛋白聚糖（皮爾斯，美國），弗羅因德的完全佐劑（Sigma，美國），弗羅因德的不完全佐劑（Sigma，美國），二甲雙胍（上海麥克林生化科技有限公司），阿佛丁（南京愛貝生物科技有限公司），電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器公司），雙能X光骨密度儀（MEDIX90，法國）。

3.實(shí)驗(yàn)方法

3.1.建模 小鼠喂飼至8 周，體質(zhì)量（25±2）g。隨機(jī)分成3組：二甲雙胍模型組、AS模型對(duì)照組、空白對(duì)照組，每組10只。模型鼠實(shí)驗(yàn)第1周每只腹腔注射100 μg蛋白聚糖加等體積弗氏完全佐劑，每隔3 周腹腔注射1 次，共注射3 次，后續(xù)兩次改蛋白聚糖加等體積弗氏不完全佐劑。觀察小鼠的步態(tài)和攀爬活動(dòng)。

3.2.灌胃 造模成功后，二甲雙胍模型組小鼠用二甲雙胍灌胃，劑量為100 mg/kg，每天灌胃1 次，連續(xù)3 周。模型對(duì)照組和空白對(duì)照組小鼠灌胃等量生理鹽水。

3.3.關(guān)節(jié)病變?cè)u(píng)分 觀察各組小鼠蛋白聚糖誘導(dǎo)和藥物干預(yù)后12 周的活動(dòng)情況及關(guān)節(jié)變化，按紅腫及活動(dòng)情況5 級(jí)評(píng)分［12］。無紅腫：0 分；關(guān)節(jié)紅不腫：1 分；關(guān)節(jié)輕度紅腫：2 分；中度紅腫：3 分；重度紅腫伴有功能障礙：4 分。病變關(guān)節(jié)分?jǐn)?shù)總和最高分16分。

3.4.骨密度測定 即用型麻醉劑阿佛丁麻醉小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5 ml，麻醉滿意后，骨密度儀掃描，分析每組小鼠腰椎、脛骨和股骨骨密度值。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.蛋白聚糖誘導(dǎo)的脊柱關(guān)節(jié)炎模型小鼠外周關(guān)節(jié)炎評(píng)分（表1）

表1 蛋白聚糖誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠的外周關(guān)節(jié)評(píng)分（分，± s）

表1 蛋白聚糖誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠的外周關(guān)節(jié)評(píng)分（分，± s）

注：二甲雙胍模型組小鼠用二甲雙胍灌胃，模型對(duì)照組和空白對(duì)照組小鼠灌胃等量生理鹽水。與模型對(duì)照組比較，aP＜0.05

小鼠在誘導(dǎo)3次完后未見明顯關(guān)節(jié)紅腫現(xiàn)象，第8周開始出現(xiàn)紅腫，模型組小鼠的關(guān)節(jié)評(píng)分在第12 周達(dá)到峰值。觀察至16 周，免疫鼠均出現(xiàn)不同程度的外周關(guān)節(jié)炎癥。16 周的二甲雙胍模型組小鼠關(guān)節(jié)評(píng)分明顯低于模型對(duì)照組，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.各組小鼠骨密度的變化（表2）

表2 3組小鼠的骨密度測定值（g/cm2，± s）

表2 3組小鼠的骨密度測定值（g/cm2，± s）

注：二甲雙胍模型組小鼠用二甲雙胍灌胃，模型對(duì)照組和空白對(duì)照組小鼠灌胃等量生理鹽水。與模型對(duì)照組比較，aP＜0.01，bP＜0.05；與空白對(duì)照組比較，cP＜0.05

阿佛丁麻醉小鼠，等麻醉平穩(wěn)后，骨密度儀掃描各組小鼠，軟件分析每組小鼠腰椎、脛骨和股骨骨密度值。結(jié)果顯示，二甲雙胍模型組小鼠股骨和脛骨骨密度明顯高于模型對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

討論

AS 是一種慢性進(jìn)展的脊柱關(guān)節(jié)炎癥性疾病，常累及脊柱關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)、雙側(cè)的骶髂關(guān)節(jié)及外周關(guān)節(jié)。早期治療的目的是消炎鎮(zhèn)痛、預(yù)防畸形、控制病理進(jìn)展。目前，常用的藥物有NSAIDs、糖皮質(zhì)激素、抗腫瘤壞死因子生物制劑及免疫抑制劑（柳氮磺吡啶）等。學(xué)者黃雪艷［13］采用二磷酸鹽聯(lián)合碳酸鈣D3來治療強(qiáng)直性脊柱炎，可以改善骨與軟骨代謝，但至今無特效藥能控制進(jìn)展和根治AS。

本實(shí)驗(yàn)用蛋白聚糖誘導(dǎo)免疫雌性BALB/c 小鼠，建造外周關(guān)節(jié)炎的AS 小鼠模型，再給實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托∈蠊辔付纂p胍3 周。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，誘導(dǎo)免疫8 周后小鼠出現(xiàn)外周關(guān)節(jié)炎癥狀，模型鼠在12 周關(guān)節(jié)炎分值達(dá)頂峰。二甲雙胍模型組的小鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分明顯低于模型對(duì)照組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這說明二甲雙胍對(duì)減輕AS 模型小鼠外周關(guān)節(jié)炎癥狀。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行骨密度檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型對(duì)照組小鼠骨密度明顯低于空白對(duì)照組小鼠的骨密度，說明該模型除了顯示外周關(guān)節(jié)炎癥狀外，小鼠骨代謝失去平衡，還出現(xiàn)了骨質(zhì)破壞和骨質(zhì)疏松的改變。本實(shí)驗(yàn)中，二甲雙胍模型組小鼠的骨密度值有明顯改善，與模型對(duì)照組小鼠比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），凸顯了二甲雙胍在增加小鼠成骨性能和抑制破骨作用方面的優(yōu)勢(shì)。

本研究結(jié)果初步表明：蛋白聚糖誘導(dǎo)的AS 模型小鼠成骨與破骨代謝失去平衡，出現(xiàn)骨質(zhì)疏松改變及外周關(guān)節(jié)炎癥狀。二甲雙胍治療AS 模型小鼠，成骨代謝增強(qiáng)，破骨代謝受到抑制。該研究結(jié)果將為日后進(jìn)一步的二甲雙胍治療AS 提供了科學(xué)依據(jù)。然而，本研究是基于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究，所有的動(dòng)物模型都是比較單一的因素制作出來的，人體AS 疾病的發(fā)病機(jī)制遠(yuǎn)比實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型復(fù)雜。只有不斷改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法，制作的動(dòng)物模型與人體AS 疾病的相似性越來越高，實(shí)驗(yàn)的精確度和可靠性就越大，這樣更有利于為日后的臨床研究提供更為豐富的精準(zhǔn)數(shù)據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明無利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明鄭錦暢、向旻、孫杰聰、林瀚：實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)，分析和解釋數(shù)據(jù)；胡資兵：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，文章撰寫，實(shí)驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)；魏波、吳少科：對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容審閱，參考文獻(xiàn)校對(duì)，統(tǒng)計(jì)分析，行政，技術(shù)和材料支持及指導(dǎo)