不同非釀酒酵母與釀酒酵母順序發(fā)酵對茵紅李果酒風(fēng)味的影響

李 甜，雷 雨，李 東，李靜雅，金 磊

（四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644005）

茵紅李（Prunus salicinaLindl.）是李屬中的一個(gè)優(yōu)良品種，主要分布在中國四川宜賓和臥龍等地，其質(zhì)地嫩脆化渣、口感酸甜適中、營養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)廣受消費(fèi)者青睞[1]。隨著茵紅李的栽培面積擴(kuò)大和產(chǎn)量提高，導(dǎo)致茵紅李不能及時(shí)銷售而造成大量浪費(fèi)。目前，果酒是水果精深加工的主要方向之一，將茵紅李加工生產(chǎn)為果酒，不僅能保留茵紅李的風(fēng)味，而且在發(fā)酵過程中形成多種活性物質(zhì)和風(fēng)味物質(zhì)。有助于提高茵紅李的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2]。然而，由于缺乏專用酵母，李子果酒的風(fēng)味單一且同質(zhì)化嚴(yán)重[3]，降低了其在果酒市場上的競爭力。

香氣化合物在決定果酒的質(zhì)量和可接受性方面起著至關(guān)重要的作用[4]。果酒香氣受不同因素的影響，而微生物發(fā)酵是影響果酒香氣的主要因素之一[5]。在果酒發(fā)酵過程中，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）主要是將糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇，并產(chǎn)生少量的風(fēng)味物質(zhì)。而非釀酒酵母合成一些較高活性的酶類，可將原料中的非揮發(fā)性前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為酯類、高級醇類等香氣化合物[6]，提高揮發(fā)性化合物的氣味活性值[7-8]，改變酸類物質(zhì)含量[9]和降低不良?xì)馕痘钚曰衔锖縖10]。近年來研究表明，不同種類的非釀酒酵母參與果酒混菌發(fā)酵產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)也不相同，克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）與釀酒酵母混菌發(fā)酵有利于異戊丁酸乙酯、乙酸異戊酯等香氣物質(zhì)的合成，使果酒的果香和花香味更加濃郁[11-12]。漢遜酵母屬（Hanseniaspora）與釀酒酵母混菌發(fā)酵產(chǎn)更高水平的果味乙酸酯，如2-苯基乙基乙酸酯和乙酸異戊酯[13]。異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）與釀酒酵母發(fā)酵葡萄酒產(chǎn)更高水平的乙酯和乙酸酯，賦予葡萄酒適宜的果香和花香味[14]。而戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）則會產(chǎn)生更高含量的有益化合物，如2-苯基乙基乙酸酯和乳酸乙酯[15]。此外，果酒混菌發(fā)酵的方式包括同時(shí)發(fā)酵和順序發(fā)酵。相比于同時(shí)發(fā)酵，順序發(fā)酵能延長非釀酒酵母在發(fā)酵體系中的存活時(shí)間，進(jìn)而產(chǎn)生更多的甘油和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[16]，降低脂肪酸含量[17]，進(jìn)而更有效地改善果酒的感官品質(zhì)，并縮短發(fā)酵周期[18]。因此，順序發(fā)酵是非釀酒酵母混菌發(fā)酵的較好接種方式。目前，混合發(fā)酵在葡萄酒領(lǐng)域得到了廣泛研究，但對于李子酒的研究則相對較少[18]。因此，有必要篩選出適宜的非釀酒酵母，用其與釀酒酵母進(jìn)行混合發(fā)酵，以提高茵紅李果酒的品質(zhì)。

本研究以宜賓茵紅李為原料，選用6 株本實(shí)驗(yàn)室篩選出的非釀酒酵母（包括異常威克漢姆酵母1 株Wa3，葡萄汁有孢漢遜酵母（H.uvarum）1 株Hu12，克魯維畢赤酵母3 株P(guān)k2A2、PkW2、PkY2，季也蒙畢赤酵母屬（P.guilliermondii）1 株P(guān)g1），與商業(yè)釀酒酵母FX10進(jìn)行順序混合發(fā)酵，同時(shí)以釀酒酵母FX10發(fā)酵作對照。對不同非釀酒酵母混菌發(fā)酵過程中生長狀況進(jìn)行評估，并對茵紅李果酒的理化性質(zhì)、有機(jī)酸、香氣成分及感官特性進(jìn)行比較分析。研究將有助于篩選出為茵紅李果酒增香的最優(yōu)酵母組合，為提升茵紅李果酒品質(zhì)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茵紅李原料于2022年8月購自中國四川宜賓，挑選成熟、無病害的茵紅李用于果酒發(fā)酵。經(jīng)檢測其pH 3.42，可溶性固形物為11.6 °Brix，總酸（以蘋果酸計(jì)）為5.01 g/L，還原糖為6.07 g/100 mL。

異常威克漢姆酵母（Wa3）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hu12）、克魯維畢赤酵母（Pk2A2、PkW2和PkY2）和季也蒙畢赤酵母（Pg1）為四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院農(nóng)畜產(chǎn)品精深加工實(shí)驗(yàn)室2022年經(jīng)從水果自然發(fā)酵汁中分離、純化得到的自選酵母，使用前均已鑒定。商業(yè)釀酒酵母FX10購自法國LAFFORT公司。

仲辛醇、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、酒石酸（均為色譜純）成都德思特生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉、氯化鈉、無水葡萄糖（均為分析純）成都科隆化學(xué)品有限公司；甘油G K 法檢測試劑盒（70 assays）北京海富達(dá)科技有限公司；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LB80T手持糖度計(jì) 廣東省速為電子科技有限公司；HT512ATC高精度酒精計(jì) 深圳市巴里世紀(jì)貿(mào)易有限公司；N5000PLUS紫外-可見分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；TSQ8000氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國賽默飛公司；1260infinity I高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；UitraScan VIS色差儀 美國Hunter Lab公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)處理

酵母活化與計(jì)數(shù)：將保藏菌株接種于YPD固體培養(yǎng)基上，26 ℃培養(yǎng)24 h，再將YPD固體培養(yǎng)基上的單菌落接種于300 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)液在5 000 r/min離心5 min并用無菌生理鹽水洗滌干凈。將酵母菌懸液為108CFU/mL（顯微鏡觀察）加入發(fā)酵。在發(fā)酵0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 d和10 d分別取樣并涂布在WL培養(yǎng)基上。通過觀察釀酒酵母FX10（淡綠奶油狀凸起）、異常威克漢姆酵母（白色褶皺凸起）、葡萄汁有孢漢遜酵母（深綠色光滑）、克魯維畢赤酵母（白色扁平褶皺）、季也蒙畢赤酵母屬（乳白光滑奶油凸起）在WL培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)的差異，進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)[19]。

對照組：接種量約為106CFU/mL的釀酒酵母FX10。

實(shí)驗(yàn)組：先分別接種106CFU/mL的異常威克漢姆酵母Wa3、葡萄汁有孢漢遜酵母Hu12、克魯維畢赤酵母Pk2A2、克魯維畢赤酵母PkW2、克魯維畢赤酵母PkY2和季也蒙畢赤酵母Pg1，在24 h后以1∶1的接種比例接種106CFU/mL的釀酒酵母FX10，分別簡稱為Wa3-FX10、Hu12-FX10、Pk2A2-FX10、PkW2-FX10、PkY2-FX10、Pg1-FX10。

茵紅李果酒發(fā)酵工藝：茵紅李→清洗去核打漿酶解（加入0.1 g/L焦亞硫酸鉀和0.03 g/L果膠酶酶解2 h）→用白砂糖將糖度調(diào)整到23 °Brix→漿汁分裝于10 L可取樣發(fā)酵罐中→75 ℃水浴巴氏殺菌30 min→冷卻后接種不同處理組酵母→26 ℃下進(jìn)行發(fā)酵直至主發(fā)酵結(jié)束（連續(xù)3 d發(fā)酵罐質(zhì)量減少在1 g以內(nèi)）→放于10 ℃恒溫箱中進(jìn)行后發(fā)酵1 周（促進(jìn)酒體的澄清和成熟）→再將發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min除去酵母細(xì)胞，貯藏在4 ℃冰箱→陳釀1 個(gè)月后對其理化指標(biāo)、有機(jī)酸、香氣成分以及感官特性進(jìn)行分析。所有處理一式三份進(jìn)行。

1.3.2 理化測定

乙醇體積分?jǐn)?shù)、pH 值、揮發(fā)酸測定參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[20]；總酸（以蘋果酸計(jì)）測定參考GB/T 12456—2021《食品中總酸的測定》酸堿指示劑滴定法[21]；總酚測定參考T/AHFIA 005—2018《植物提取物及其制品中總多酚含量的測定》分光光度法[22]；還原糖測定參考GB/T 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》直接滴定法[23]；甘油測定使用甘油GK法檢測試劑盒；色差使用色差儀進(jìn)行測定。

1.3.3 有機(jī)酸

取5 mL原酒液臨用前經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)樣分析。參照段云飛等[24]有機(jī)酸測定方法，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）進(jìn)行有機(jī)酸含量的測定。色譜條件：Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測波長210 nm，流動相為磷酸二氫鉀（pH 2.4）100%，進(jìn)樣量15 μL，流速0.4 mL/min，柱溫25 ℃。

1.3.4 揮發(fā)性風(fēng)味成分測定

參考Liu Chunfeng等[7]的方法，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行測定。吸取5 mL茵紅李果酒于20 mL頂空瓶中，再加入1.4 g氯化鈉和無水乙醇稀釋過的10 mL/L仲辛醇溶液1 μL作為內(nèi)標(biāo)，于45 ℃平衡15 min，再萃取30 min。取出插入氣相色譜柱的進(jìn)樣口解吸附7 min，解吸溫度為210 ℃。

色譜條件：毛細(xì)管柱為DB-WAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm）。載氣為高純氦氣，恒定流速1 mL/min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣模式。柱溫箱采用程序升溫，起始溫度40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升到120 ℃，保持2 min，再以7 ℃/min升到220 ℃，保持5 min，運(yùn)行時(shí)間39 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊能量為70eV；接口溫度220 ℃，離子源溫度250 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描質(zhì)量范圍m/z35～500，掃描頻率3.6 scans/s。

氣味活性值（odor activity value，OAV）是指某種化合物的濃度與該化合物在該試劑中可察覺的閾值之比。

1.3.5 感官評價(jià)

參考張文文等[25]研究略作修改，由8 名經(jīng)驗(yàn)豐富的品評員（4 名女性和4 名男性，年齡在20～36 歲之間）使用定量描述性分析進(jìn)行感官評估。在正式評估之前，舉行了2 次會議。首先，品評員在評估后分別寫下有關(guān)香氣特征的詞匯，并選擇重復(fù)的詞匯（2 次以上）進(jìn)行進(jìn)一步分析。接下來，品評員討論了最終的香氣描述并達(dá)成共識。選擇并量化了6 種感官屬性，包括花果香味、酸味、甜味、乙醇、平衡感和整體可接受性。在正式的感官分析期間，評估員獲得了10 mL單個(gè)樣品，這些樣品在（20±2）℃下分別呈遞在20 mL透明杯中。此外，每個(gè)樣本都用3 個(gè)隨機(jī)數(shù)編碼，并按隨機(jī)順序放在表格上。最后，對指定的茵紅李果酒6 個(gè)等級打分，分別是0～5代表由弱到強(qiáng)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多重比較分析檢驗(yàn)，P＜0.05，差異顯著，數(shù)據(jù)以形式呈現(xiàn)。采用Origin 2021進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）圖、折線圖和雷達(dá)圖的制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母發(fā)酵動力學(xué)與乙醇生成動力學(xué)

在果酒發(fā)酵過程中，酵母的數(shù)量和種群動態(tài)變化與風(fēng)味的形成和變化密切相關(guān)[26]。不同酵母組合和釀酒酵母發(fā)酵過程中酵母生長情況和乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化如圖1所示。在對照組中，酵母生物量在發(fā)酵2～5 d維持在較高水平，約為7.5（lg（CFU/mL）），隨后菌體量緩慢下降，在10 d酵母的生物量為6.04（lg（CFU/mL））。然而，在混菌發(fā)酵中，盡管釀酒酵母以相同的初始接種濃度進(jìn)行發(fā)酵，但其最大生物量下降了4.4%～9.1%。這一結(jié)果與Liu Chunfeng等[7]發(fā)現(xiàn)混菌發(fā)酵中釀酒酵母的最大生物量會下降保持一致。此外，在混菌發(fā)酵中，非釀酒酵母主要在發(fā)酵前期發(fā)揮作用，6 d未檢測到Hu12的活細(xì)胞，7 d未檢測到Wa3、PkY2和Pg1的活細(xì)胞，8 d未檢測到PkW2和Pk2A2的活細(xì)胞。表明在混合發(fā)酵中，非釀酒酵母和釀酒酵母的生長均受到一定程度的抑制。這種抑制可能是由于乙醇含量逐漸增加、溶氧量逐漸降低以及酵母菌之間的相互作用等多種因素導(dǎo)致[27]。通過對乙醇體積分?jǐn)?shù)的監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母FX10在發(fā)酵前5 d乙醇體積分?jǐn)?shù)的增長速率最快，在5～10 d乙醇體積分?jǐn)?shù)基本維持穩(wěn)定，在10 d乙醇體積分?jǐn)?shù)為11.85%。然而，在混合發(fā)酵中，乙醇體積分?jǐn)?shù)的增長速度相對較慢，在發(fā)酵10 d乙醇體積分?jǐn)?shù)為9.89%～10.94%?？赡苁欠轻劸平湍讣尤牖炀l(fā)酵，降低了釀酒酵母最大生物量，進(jìn)而使產(chǎn)生的乙醇體積分?jǐn)?shù)降低。

圖1 非釀酒酵母和釀酒酵母的生物量與乙醇生成量動態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes in yeast biomass and alcohol production of non-Saccharomyces and S.cerevisiae during plum wine fermentation

2.2 基本理化指標(biāo)

如表1所示，混菌發(fā)酵的茵紅李果酒乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍為10.93%～11.66%，顯著低于釀酒酵母FX10發(fā)酵果酒中的乙醇體積分?jǐn)?shù)12.2%。而混菌發(fā)酵果酒中還原糖質(zhì)量濃度范圍為1.95～2.75 g/L，高于釀酒酵母FX10發(fā)酵果酒中的還原糖1.88 g/L。甘油可以使果酒的口感更加圓潤，同時(shí)帶有微甜的味道。各混菌發(fā)酵酒中的甘油質(zhì)量濃度范圍為6.85～7.22 g/L，均高于釀酒酵母FX10發(fā)酵6.65 g/L，其中PkY2-FX10發(fā)酵酒中甘油含量最多，這與Benito等[16]報(bào)道克魯維畢赤酵母參與順序發(fā)酵可以增加甘油含量的結(jié)果一致?？梢酝茰y，混菌發(fā)酵中乙醇含量減少的原因可能是酵母菌株受到抑制導(dǎo)致糖代謝受阻，也可能是糖代謝過程中使更多的糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為甘油等其他物質(zhì)[28]。

表1 不同酵母組合發(fā)酵茵紅李果酒的理化特性Table 1 Physicochemical properties of Yinhong plum wines producing using different fermentation strategies

在長時(shí)間的貯藏過程中，果酒的pH值可能會影響其色澤。較低的pH值會導(dǎo)致游離花青素含量減少，而較高的pH值將導(dǎo)致果酒發(fā)生褐變[29]。本實(shí)驗(yàn)測得的果酒pH值介于3.16～3.35之間。果酒的酸度是評估其獨(dú)特純凈和清爽特性的重要參數(shù)[30]。Pk2A2-FX10、PkW2-FX10和PkY2-FX10發(fā)酵酒中總酸含量顯著高于其他發(fā)酵酒，與張文靜等[11]報(bào)道克魯維畢赤酵母具有增加總酸含量的結(jié)果一致。Wa3-FX10發(fā)酵酒中產(chǎn)生的揮發(fā)酸最高為0.76 g/L，其次是Pk2A2-FX10、PkW2-FX10和PkY2-FX10。然而，揮發(fā)酸含量過高可能會給果酒帶來負(fù)面影響[31]，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果均在GB 15037—2006規(guī)定范圍內(nèi)（揮發(fā)酸＜1.2 g/L）。

酚類化合物是果酒中的天然抗氧化劑，對色澤、香氣、澀味和苦味等感官品質(zhì)起關(guān)鍵作用[32]。本研究發(fā)現(xiàn)Wa3-FX10和PkW2-FX10發(fā)酵的茵紅李果酒中總酚含量顯著高于釀酒酵母FX10發(fā)酵的茵紅李酒。此外，之前報(bào)道也指出，異常威克漢姆酵母和釀酒酵母發(fā)酵能顯著增加果酒中的多酚產(chǎn)量[30]。在混菌發(fā)酵中，除Pk2A2-FX10和PkW2-FX10發(fā)酵酒外，其他酒的ΔE*值高于釀酒酵母FX10發(fā)酵的茵紅李酒。

2.3 有機(jī)酸

有機(jī)酸對果酒的感官特性和品質(zhì)起著十分重要的作用[33]。如表2所示，茵紅李果酒中蘋果酸占有機(jī)酸中的比例最高，發(fā)酵茵紅李果酒中蘋果酸質(zhì)量濃度在3.16～4.99 g/L之間，顯著低于茵紅李果汁（6.84 g/L）。特別是Hu12-FX10發(fā)酵后的茵紅李果酒中蘋果酸含量最低，表明葡萄汁有孢漢遜酵母可能具有降解蘋果酸的能力，這結(jié)果與白玉峰等[34]發(fā)現(xiàn)葡萄汁有孢漢遜酵母能降低蘋果酸含量的結(jié)果一致。而Wa3-FX10發(fā)酵酒中乙酸和琥珀酸的含量最高，大量的乙酸具有醋酸味，而琥珀酸具有“鹽-苦-酸”的味道，可能給果酒帶來令人不愉悅的味道。與對照相比，混菌發(fā)酵的乳酸質(zhì)量濃度降低了0.12～1.07 g/L，但乙酸質(zhì)量濃度增加了0.14～0.91 g/L。其中Wa3-FX10發(fā)酵茵紅李果酒中乙酸質(zhì)量濃度最高1.16 g/L，為釀酒酵母FX10的4.64 倍。乙酸含量的增加可能是不同種類酵母混合在一起進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，它們之間會相互抑制對方的生長和代謝，從而導(dǎo)致了不利條件的形成，促使了乙酸的產(chǎn)生增加[30]。

表2 茵紅李果酒和果汁中有機(jī)酸質(zhì)量濃度Table 2 Organic acid concentrations in Yinhong plum wines and juice g/L

2.4 揮發(fā)性風(fēng)味分析

香氣是影響果酒品質(zhì)的重要特征之一，尤其是酯類、高級醇和揮發(fā)性脂肪酸等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對果酒的次級香氣具有顯著影響[35]。本研究采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，在茵紅李果酒和果汁中共檢測到43 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括酯類18 種、高級醇類12 種、揮發(fā)性脂肪酸類5 種和其他類物質(zhì)8 種，結(jié)果如表3所示。不同發(fā)酵酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成和含量存在差異，在Wa3-FX10、Hu12-FX10、Pk2A2-FX10、PkW2-FX10、PkY2-FX10、Pg1-FX10和FX10發(fā)酵酒中分別檢測到32、31、35、35、34、34 種和33 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。其總量分別為5.683、5.715、6.033、7.734、7.961、3.790 mg/L和3.775 mg/L。而茵紅李果汁中檢測到28 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，總量為0.733 mg/L。果汁中含有較多的醛類香味物質(zhì)，而經(jīng)過發(fā)酵后，酯類、高級醇類及揮發(fā)性脂肪酸化合物的含量顯著提高，表明發(fā)酵過程增加了揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量。

表3 茵紅李果酒和果汁中揮發(fā)性化合物濃度Table 3 Concentrations of volatile compounds in Yinhong plum wine and juice

酯類化合物是果酒中的重要香氣化合物之一，主要包括乙酯和乙酸酯類，對果酒的主體香氣具有重要影響[36]。在檢測到的18 種酯類化合物中，Wa3-FX10、Hu12-FX10、Pk2A2-FX10、PkW2-FX10、PkY2-FX10、Pg1-FX10和FX10發(fā)酵茵紅李果酒中分別有6、5、8、7、8、5 種和6 種為氣味活性化合物（OAV＞1）。其中辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、正己酸乙酯、乙酸己酯是7 種發(fā)酵酒中共有的氣味活性化合物（OAV＞1），這些化合物是茵紅李果酒的特征風(fēng)味物質(zhì)?；炀l(fā)酵茵紅李果酒中酯類化合物的總量（1.293～4.842 mg/L）顯著高于對照組FX10（1.026 mg/L）。尤其是乙酸苯乙酯、乙酸己酯和乙酸異戊酯的含量顯著提高，表明混菌發(fā)酵有利于乙酸酯的形成。這與之前的研究結(jié)果一致[37]。另外，PkY2-FX10發(fā)酵的茵紅李果酒中酯類化合物總量最高，為對照菌株FX10的4.72 倍。其次是Pk2A2-FX10和PkW2-FX10發(fā)酵的茵紅李果酒，它們的酯類含量分別為對照組的4.09 倍和3.04 倍。這可能與克魯維畢赤酵母具有較高的酯酶活性有關(guān)[38]。在PkY2-FX10、Pk2A2-FX10和PkW2-FX10發(fā)酵的茵紅李果酒中，乙酸苯乙酯、乙酸己酯、乙酸異戊酯和乙酸順式-3-己烯酯質(zhì)量濃度顯著高于其他混菌發(fā)酵組合。乙酸順式-3-己烯酯僅在克魯維畢赤酵母參與發(fā)酵的酒中檢測到，這可為茵紅李果酒帶來梨樣的水果香。乙酸苯乙酯的OAV在12.14～20.29之間，可為茵紅李果酒帶來玫瑰花香和蘋果果香[39]。此外，乙酸己酯具有較高的OAV，在30.11～44.89之間，可賦予茵紅李果帶來蘋果、梨等水果香味[40]。Wa3-FX10產(chǎn)水楊酸甲酯質(zhì)量濃度最高，為0.079 mg/L，超過了其閾值0.071 mg/L，可賦予果酒淡淡的薄荷清香味[41]。乙酸乙酯是果酒中最重要的酯類化合物，由乙醇和乙酸脫水反應(yīng)而成。在較低質(zhì)量濃度水平（＜50 mg/L）下，它具有令人愉悅的果香[42]。Hu12-FX10發(fā)酵的茵紅李果酒中乙酸乙酯質(zhì)量濃度最高，為1.82 mg/L，也有研究報(bào)道，葡萄汁有孢漢遜酵母與釀酒酵母混菌發(fā)酵會產(chǎn)生較多的乙酸乙酯[43]。

高級醇是由微生物通過Ehrlich途徑將相應(yīng)氨基酸轉(zhuǎn)化或?qū)⑻穷愇镔|(zhì)分解產(chǎn)生的一類化合物[44]。高級醇是愉悅酯類化合物的前體物，當(dāng)高級醇總質(zhì)量濃度低于300 mg/L時(shí)，可以促進(jìn)果酒的風(fēng)味復(fù)雜性[7]。在本實(shí)驗(yàn)中，除Pg1-FX10發(fā)酵酒中高級醇總量（2.160 mg/L）低于對照FX10（2.408 mg/L）外，其余混菌發(fā)酵酒樣中高級醇總量均高于對照。特別是Wa3-FX10質(zhì)量濃度（3.478 mg/L）最高。高級醇中1-壬醇、苯乙醇和苯甲醇在果汁含量較少，經(jīng)發(fā)酵成果酒后，它們的含量顯著增加。均在Hu12-FX10發(fā)酵酒中含量最高，其中1-壬醇和苯乙醇可以為茵紅李果酒帶來蜂蜜、玫瑰等宜人香氣，而苯甲醇會給果酒帶來苦杏仁味。葉醇具有青香、藥草香、綠葉香香氣[40]。葉醇在果汁中質(zhì)量濃度（0.047 mg/L）顯著高于其他發(fā)酵酒（0.012～0.032 mg/L），說明經(jīng)發(fā)酵后的酒樣能明顯降低果汁中的青草香氣。

揮發(fā)性脂肪酸是果酒香氣復(fù)雜性和香氣平衡性的重要揮發(fā)性化合物[45]。然而，當(dāng)揮發(fā)性脂肪酸的總質(zhì)量濃度低于20 mg/L時(shí)，可賦予果酒豐富的果味[43]。在本研究中，發(fā)酵的茵紅李果酒中共有5 種揮發(fā)性酸類化合物，包括乙酸、丁酸、己酸、癸酸和辛酸。這些化合物的總量范圍為0.102～0.181 mg/L，均未超過于20 mg/L。在混菌發(fā)酵酒中，除Pg1-FX10和Pk2A2-FX10發(fā)酵酒中揮發(fā)性酸類物質(zhì)總量略低于對照FX10外，其余混菌發(fā)酵酒樣中揮發(fā)性酸類物質(zhì)總量范圍為0.136～0.181 mg/L，均高于對照（0.082 mg/L）。值得注意的是，乙酸、丁酸和辛酸是李子中本身存在的揮發(fā)性酸，經(jīng)發(fā)酵后，各種揮發(fā)性脂肪酸類化合物的含量均顯著提高。乙酸具有尖銳的酸味，而辛酸、己酸和癸酸均有不愉快的氣味，如山羊臭、奶酪香和脂肪臭。然而，由于這些酸類化合物均具有極高的閾值[46]，它們不會給果酒帶來不良影響。另外，與釀酒酵母FX10相比，混菌發(fā)酵酒中辛酸的含量有所降低。這與張曼[40]在其研究中所得到的混菌發(fā)酵脆紅李果酒中辛酸含量降低的結(jié)果一致。

除了主要的酯類、高級醇類和揮發(fā)性脂肪酸類化合物外，部分醛、酮和萜烯類化合物對果酒的香氣產(chǎn)生一定的影響。在混菌發(fā)酵茵紅李果酒中，2-辛酮質(zhì)量濃度（0.017～0.106 mg/L）顯著高于釀酒酵母發(fā)酵0.015 mg/L?；炀l(fā)酵酒中苯甲醛質(zhì)量濃度（0.123～0.264 mg/L）也高于對照0.117 mg/L。2-辛酮具有花香和草香香氣，苯甲醛具有花香和香草等特殊氣味，有利于提高果酒風(fēng)味的復(fù)雜性。另外，僅在茵紅李果汁中檢測到了4-乙基苯甲醛、芳樟醇、壬醛和正己醛，這表明它們是茵紅李獨(dú)特的品種香氣成分。

2.5 PCA

一般認(rèn)為OAV＞1的化合物對果酒的香氣貢獻(xiàn)較為顯著，而OAV＞0.1的化合物可能表現(xiàn)出協(xié)同作用，有助于果酒的風(fēng)味[49]。因此，本實(shí)驗(yàn)對OAV＞0.1的20 種香氣化合物進(jìn)行PCA，結(jié)果如圖2所示。PCA解釋了累計(jì)貢獻(xiàn)率的67.6%，PC1和PC2分別占總差異的48.7%和18.9%。可以看出，發(fā)酵過程中不同酵母組合可以產(chǎn)生獨(dú)特的氣味活性化合物，從而在茵紅李果酒中產(chǎn)生不同的風(fēng)味特征。Pk2A2-FX10、PkW2-FX10和PkY2-FX10與乙酸己酯、乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯、辛酸乙酯、肉桂酸乙酯、乙酸異丁酯和乙酸順式-3-己烯酯7 種香氣化合物聚集在右上角。這些酵母組合與對照組差異顯著，表明克魯維畢赤酵母與釀酒酵母的混菌發(fā)可以顯著影響茵紅李果酒的風(fēng)味。Wa3-FX10位于PC2負(fù)軸上，F(xiàn)X10位于左下角，而Pg1-FX10和Hu12-FX10則位于右下角，這4 種酵母組合距離較近，說明這3株非釀酒酵母與釀酒酵母混菌發(fā)酵對果酒的風(fēng)味影響不顯著。另外，果汁樣品的位置位于PC1的左上角，與壬醛、甲基戊酸乙酯和芳樟醇密切相關(guān)。

圖2 發(fā)酵結(jié)束后茵紅李果酒中OAV＞0.1的香氣化合物PCAFig.2 PCA plot of aroma compounds with OAV >0.1 in Yinghong plum wines and juice

2.6 感官分析

采用定量描述性分析對茵紅李果酒樣品進(jìn)行感官評定，結(jié)果如圖3所示。與對照組相比，混菌發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇味相對較弱，這與混菌發(fā)酵降低了其乙醇體積分?jǐn)?shù)相關(guān)。此外，最突出的花果香味主要在PkY2-FX10發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)，其次是Pk2A2-FX10和PkW2-FX10，這主要與它們產(chǎn)生大量酯類氣味活性化合物相關(guān)。Wa3-FX10和Hu12-FX10發(fā)酵酒中酸味比較明顯，可能與它們產(chǎn)生較多的乙酸相關(guān)。此外，雖然PkY2-FX10、Pk2A2-FX10和PkW2-FX10的總酸含量高于其他發(fā)酵組，但它們的酸味強(qiáng)度顯著降低（P＜0.05）。這可能是因?yàn)楦叩奶鹞逗王ヮ惢衔镅谏w了尖銳的乙酸酸味?？傮w而言，PkY2-FX10、Pk2A2-FX10和PkW2-FX10發(fā)酵的茵紅李果酒在花果香味、整體可接受性和平衡感方面均具有較高的評分，這表明克魯維畢赤酵母與釀酒酵母混菌發(fā)酵對茵紅李果酒香氣和品質(zhì)具有積極影響。

圖3 采用定量描述性分析對茵紅李果酒樣品進(jìn)行感官評定結(jié)果Fig.3 Sensory evaluation results of Yinhong plum wine samples by quantitative descriptive analysis

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)分析了不同非釀酒酵母與釀酒酵母順序發(fā)酵對茵紅李果酒風(fēng)味品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，混菌發(fā)酵中，釀酒酵母與非釀酒酵母均受到了一定程度的抑制作用，而非釀酒酵母主要在發(fā)酵初期發(fā)揮作用，6～8 d出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。發(fā)酵組中茵紅李果酒中的各項(xiàng)理化指標(biāo)存在差異。與釀酒酵母FX10相比，混菌發(fā)酵的茵紅李果酒中甘油產(chǎn)量提高，乳酸含量、乙醇含量和對還原糖的消耗降低。在風(fēng)味成分方面，通過氣相色譜-質(zhì)譜共檢測到43 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，茵紅李果酒中主要以酯類和高級醇類化合物為主。其中辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、正己酸乙酯、乙酸己酯被確認(rèn)為茵紅李果酒的特征風(fēng)味物質(zhì)。與釀酒酵母FX10相比，混菌發(fā)酵的酯類化合物含量均顯著提高。其中，PkY2-FX10發(fā)酵的茵紅李果酒中酯類含量最高，為對照組的4.72 倍。其次是Pk2A2-FX10和PkW2-FX10發(fā)酵，酯類含量分別為對照組的4.09 倍和3.04 倍。PCA顯示，Pk2A2-FX10、PkW2-FX10和PkY2-FX10與辛酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、乙酸己酯、肉桂酸乙酯、乙酸順式-3-己烯酯和乙酸異戊酯7 種香氣化合物緊密相關(guān)，這些化合物顯著提升了茵紅李果酒中的花果香味。綜上，將克魯維畢赤酵母和釀酒酵母順序發(fā)酵是提高茵紅李果酒香氣成分的最佳酵母組合，但其增加茵紅李果酒香氣成分的機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。