牛乳外泌體中miRNA的測序與分析

商靜雯，柴玉霞，曹雪妍，岳喜慶，楊 梅

（沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

牛乳是我國常見的乳制品之一，具有極高的營養(yǎng)價值和良好的功能特性。牛乳可作為新生兒的食物滿足其營養(yǎng)需求并促進嬰兒的生長發(fā)育，同時也是成人營養(yǎng)的重要來源[1-2]。牛乳主要由水、脂肪、磷脂、蛋白質(zhì)、乳糖、灰分、非脂肪固體、干物質(zhì)等化學成分組成[3]。牛乳中蛋白質(zhì)含量豐富，甚至高于人乳蛋白質(zhì)[4]，酪蛋白作為牛乳蛋白中含量最高的蛋白質(zhì)具有轉(zhuǎn)運和抗氧化活性，在預防高血壓和提高機體免疫力等方面具有重要意義[5]。牛乳中還含有許多功能活性成分，具有抑菌、調(diào)節(jié)腸道健康、抗癌、提高機體免疫力等作用，且容易被人體吸收利用[6]。因此牛乳作為嬰幼兒配方乳粉與功能性補充劑的來源，應進行深入探究。

外泌體是內(nèi)吞來源的雙層納米囊泡，在生理和病理條件下由多種哺乳動物細胞主動釋放，直徑約30～150 nm，通過攜帶細胞特異性貨物蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNA等進行細胞交流和物質(zhì)傳遞[7-8]。外泌體廣泛存在于生物體液中[9]。microRNA（miRNA）是外泌體的主要成分之一，作為調(diào)節(jié)因子能夠抑制或降解mRNA轉(zhuǎn)錄從而控制基因表達[10]。乳液是外泌體miRNA的潛在豐富來源，包裹在乳外泌體中的miRNA在惡劣條件下穩(wěn)定，乳外泌體為miRNA提供保護環(huán)境使其能免受降解，穿過腸道屏障到達血液循環(huán)以發(fā)揮重要作用[11]。迄今為止通過測序技術(shù)已經(jīng)對多個物種乳源miRNA進行鑒定與分析，如小鼠[12]、牛[13]、熊貓[14]、豬[15]、馬[16]、駱駝[17]、羊[18]等，并且多種miRNA在不同哺乳動物中表達保守[19]。目前對于牛乳的研究多集中在營養(yǎng)價值方面，對牛乳外泌體miRNA的探索仍處于初級階段。

本研究采用密度梯度離心法獲取牛乳外泌體，從形狀、粒徑大小對其進行鑒定。構(gòu)建牛乳外泌體非編碼小RNA（sRNA）基因文庫，利用Illumina測序技術(shù)分析牛乳外泌體miRNA的種類與表達量，在該基礎(chǔ)上篩選出高表達及差異表達的miRNA，并對其進行生物信息學分析，對牛乳miRNA的功能性深入了解，旨在為以牛乳為基料的嬰幼兒配方乳粉和營養(yǎng)補充劑開發(fā)提供更好的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳樣品來源于中國遼寧沈陽輝山牧場的45 頭荷斯坦奶牛，年齡為2～3 歲，均為首次分娩，體質(zhì)量250～350 kg，在采樣期間喂食相同飼料，收集到的牛乳樣品采用干冰進行運輸，最后用超低溫冰箱（-80 ℃）進行貯存。在實驗前將乳汁樣本隨機分為3 組，每組樣本混合均勻，以消除個體差異。

HiSeq X試劑盒、TruseqTMsRNA樣品制備試劑盒美國Illumina公司；6% Novex TBE凝膠、TRIzol試劑美國Invitrogen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FR-1000型凝膠成像分析系統(tǒng) 上海復日科技有限公司；JY600C型通用電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；ND-2000型紫外-可見光分光光度計 上?；蚬?；wonbio-96型高通量研磨儀 上海萬柏生物科技有限公司；2100型生物分析儀 美國安捷倫科技有限公司；5424R型離心機 美國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 乳外泌體的提取

取5 mL乳樣1 500×g、4 ℃離10 min，以該條件重復2 次離心除去大部分脂肪和細胞碎片組織。吸取上清液，12 000×g、4 ℃離心30 min處理，用過濾器去除剩余的細胞碎片。吸取上清液12 000×g、4 ℃離心4 h處理，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）溶解沉淀物，100 000×g、4 ℃再次離心1 h處理，收集沉淀物質(zhì)，使其分散于PBS后用透射電鏡進行觀察。

1.3.2 總RNA的提取、文庫構(gòu)建以及測序

在研磨儀中放入200 μL外泌體樣品，使用液氮在50 Hz、10 s條件下研磨樣品，添加1 000 μL預冷TRIzol試劑與樣品混合均勻，再添加200 μL氯仿混勻，13 000×g、4 ℃離心15 min處理，使用移液槍將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管里面，添加1.2 倍無水乙醇，靜置在-20 ℃條件下2～4 h，13 000×g、4 ℃離心5 min，吸出上清液，沉淀用1 000 μL體積分數(shù)75%乙醇溶液洗凈，13 000×g、4 ℃離心5 min，收集沉淀物質(zhì)即為RNA。

在測序前對提取的RNA進行質(zhì)量評估，包括RNA濃度、純度以及完整性。RNA濃度通過紫外-可見光分光光度計進行測量，RNA純度與所受污染情況通過1%瓊脂糖凝膠評估，最后使用Agilent 2100生物分析儀評估RNA完整性，符合高質(zhì)量（OD260nm/OD280nm=1.8～2.2，OD260nm/OD230nm≥2.0，RNA完整值≥8，28S/18S≥1.0，＞3 μg）標準的RNA樣品才能被使用，然后構(gòu)建測序文庫[20-21]。

取3 μg RNA構(gòu)建基因文庫。用TruSeq sRNA樣本制備試劑盒連接3′接頭，使過量的3′端隨機接頭與隨機引物雜交。連接5′末端，加入M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成第1鏈。隨后進行聚合酶鏈式反應擴增，使用8%聚丙烯酰胺凝膠純化擴增產(chǎn)物，篩選出長度在140～160 bp范圍內(nèi)片段用于后續(xù)研究。評估RNA文庫質(zhì)量，聚類生成后，通過Illumina技術(shù)對樣品進行測序。

Illumina測序完成后，統(tǒng)計sRNA片段的質(zhì)量波動與堿基分布情況，分析堿基質(zhì)量與堿基錯誤率。使用Fastp軟件篩選出純凈序列，分析時去除低質(zhì)量sRNA序列，統(tǒng)計剩余的sRNA序列數(shù)量、堿基分布情況，分析sRNA序列不同位點對堿基的偏好性。

1.3.3 sRNA的注釋及序列特征分析

利用Rfam數(shù)據(jù)庫（http://rfam.xfam.org/）對sRNA進行注釋，統(tǒng)計比對成功sRNA序列的種類與數(shù)量，去除注釋后的rRNA、小核RNA（snRNA）、轉(zhuǎn)運RNA（tRNA）等非已知miRNA序列。利用bowtie（http://bowtiebio.sourceforge.net/index.shtml）對照參考基因數(shù)據(jù)庫，比對mirBaSe（http://www.mirbase.org/），完全匹配的序列用于已知miRNA的鑒定與分析。

1.3.4 已知miRNA鑒定和新miRNA預測

在注釋后的sRNA序列中篩選出已知miRNA。選取未成功注釋的sRNA序列，使用miRDeep2軟件探索其二級結(jié)構(gòu)、Dicer酶裂解位點信息、最小自由能等特征，從而預測出新的miRNA。

1.4 統(tǒng)計與生物信息學分析

預測牛乳外泌體miRNA靶基因，對miRNA靶基因進行基因本體論（Gene Ontology，GO）功能注釋分析，統(tǒng)計miRNA靶基因在細胞組成、分子功能、生物過程層面的功能注釋情況。參考京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫，對miRNA靶基因參與通路進行富集分析，統(tǒng)計靶基因顯著富集通路及富集數(shù)量。采用Fisher檢驗統(tǒng)計通路富集的顯著性，并通過Holm、Sidak、Bonferroni等方法降低假陽性率。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛乳外泌體的表征

如圖1所示，使用透射電子顯微鏡觀察外泌體，牛乳外泌體是呈橢圓形的囊泡，其大小均勻、形態(tài)一致，直徑約為100 nm，從前人[22-23]的研究結(jié)果可知，本研究的提取物符合外泌體的標準。

2.2 sRNA測序數(shù)據(jù)及長度分布

為了鑒定牛乳外泌體中miRNA，利用Illumina技術(shù)對牛乳外泌體中的sRNA進行測序，結(jié)果如表1所示，在牛乳外泌體中共鑒定到12 187 058 條原始序列，堿基數(shù)量為914 029 350 bp，Phred數(shù)值大于20的堿基占總體堿基的91.19%，Phred數(shù)值大于30的堿基占總體堿基的83.68%。對原始序列進行質(zhì)量控制，除去含有帶接頭、低質(zhì)量的序列，結(jié)果如表2所示，在牛乳中共鑒定到3 899 629 條純凈序列，占原始序列的32.00%，堿基數(shù)量為95 184 252 bp，占原始序列的10.41%，含N序列為460 條，鑒定到長度小于18 nt、大于32 nt的序列共有7 374 585 條。

表1 牛乳sRNA原始測序結(jié)果統(tǒng)計Table 1 Statistical analysis of original sequencing results of bovine milk sRNAs

表2 牛乳sRNA序列質(zhì)量控制后信息統(tǒng)計Table 2 Statistical analysis of information after quality control of bovine milk sRNA sequences

明確sRNA長度分布情況有助于識別sRNA種類，如miRNA長度主要是21～22 nt，siRNA長度主要是24 nt。本研究在質(zhì)量控制后對sRNA長度分布進行統(tǒng)計，結(jié)果如圖2所示，牛乳純凈sRNA序列長度分布在18～29 nt之間，長度為28 nt的sRNA序列數(shù)量最多，占比為12.85%，牛乳外泌體中sRNA序列長度分布較為均勻。

圖2 牛乳中sRNA序列長度分布Fig.2 sRNA sequence length distribution in bovine milk

當前體發(fā)育為成熟的miRNA時，miRNA會被Dicer酶特異性切割，因此成熟miRNA序列的堿基具有偏好性。miRNA的堿基偏好會影響miRNA的加工和作用機制，并能準確評估樣品質(zhì)量、基因文庫構(gòu)建情況與測序結(jié)果，因此本研究對sRNA序列堿基分布進行統(tǒng)計分析。如圖3所示，不同sRNA的首位堿基顯著偏好堿基G，其2、4、28、31、32號位點也顯著偏好堿基G，其25、26、27號位點顯著偏好堿基C。

2.3 sRNA序列的分類注釋

使用最新的Rfam數(shù)據(jù)庫對sRNA分類注釋。如表3所示，在牛乳外泌體3 899 629 條純凈sRNA序列中，2 814 816 條序列與數(shù)據(jù)庫比對成功，對比成功比例為72.18%。牛乳中sRNA序列包括rRNA、miRNA、核仁小RNA（snoRNAs）、snRNA、tRNA等，rRNA數(shù)量是2 459 893 條，所占比例最大，為63.08%。

表3 牛乳外泌體中sRNA序列比對結(jié)果Table 3 Comparison of sRNA sequences of exosomes in bovine milk

去除rRNA、snRNA、tRNA等非已知miRNA序列后，剩余的sRNA序列與參考數(shù)據(jù)庫進行比對，將相同序列合并，共有367 822 條能夠繪制到染色體上，192 375 條序列比對成功，占比為52.3%。

2.4 已知miRNA的鑒定及新miRNA預測

測序得到的sRNA序列映射到?；蚪M，參考已有的基因組序列和數(shù)據(jù)庫，將注釋后的牛乳miRNA與miRBase數(shù)據(jù)庫（http://www.mirbase.org/）中牛miRNA前體及成熟體序列進行比對，對牛乳外泌體miRNA進行鑒定。在牛乳外泌體中共鑒定到61 種成熟miRNA，總數(shù)量達2 037 條。由表4可知，牛乳外泌體中表達量大于5 000的已知miRNA共有27 種。雖然已知miRNA種類與總數(shù)量較高，但一些miRNA占據(jù)了miRNA庫的主導地位，3 種表達最豐富的miRNA（let-7a、let-7b、miR-1246）數(shù)量占總數(shù)量的61.46%。

表4 牛乳外泌體中表達量大于5 000的已知miRNA序列統(tǒng)計Table 4 Statistics of known miRNA sequences with expression levels greater than 5 000 in bovine milk exosomes

在已知miRNA中l(wèi)et-7家族顯著表達，let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g均被檢測出，特別是let-7a與let-7b，數(shù)量分別為641 條與329 條，表達量分別為323 900.96、166 245.58。同一家族成員的差異表達可能歸因于其前體的調(diào)節(jié)[24]。let-7基因是一種高度保守的miRNA，功能與多種動物的細胞命運和發(fā)育進程有關(guān)[25-26]。Yun等[27]利用Illumina技術(shù)對人、牛、羊初乳與成熟乳miRNA進行分析，發(fā)現(xiàn)bta-let-7a-5p與bta-let-7f在牛初乳與成熟乳中共有且顯著表達。通過對羊乳外泌體中miRNA測序發(fā)現(xiàn)let-7家族也顯著表達[18]，由此得出let-7家族可能與乳的基本功能、生理作用有關(guān)。

miRNA來源于具有標志性發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體，利用此特點預測新miRNA種類與數(shù)量。將未比對上的sRNA與參考數(shù)據(jù)庫比對，新miRNA序列鑒定出346 種，總數(shù)量為41 319 條，總表達量為1 422 233.67，有56 種miRNA序列數(shù)量超過100 個，新miRNA的預測豐富了牛miRNA序列基因庫數(shù)據(jù)。這些新miRNA可能參與了與哺乳和免疫系統(tǒng)相關(guān)的途徑，并能協(xié)助闡釋這些途徑，新miRNA生物學功能還需要進一步研究。

2.5 靶基因GO功能性分析

對miRNA靶基因進行GO功能顯著性富集分析，可以明確miRNA靶基因的功能富集情況，進一步了解這些miRNA的功能作用。如圖4所示，在生物過程層面已知miRNA與新miRNA均參與細胞過程、單一生物體過程、代謝過程、生物調(diào)節(jié)等條目，且這些條目占比排序一致，不同miRNA靶基因注釋到GO條目所占比例也很相似。二者均在細胞過程條目占比最多，4 428 條已知miRNA注釋到細胞過程條目，所占比例為16.8%，6 764 條新miRNA注釋到細胞過程條目，所占比例為16.9%。

圖4 牛乳miRNA靶基因在生物過程層面注釋條目統(tǒng)計Fig.4 Statistics of annotation entries of milk miRNA target genes at the biological process level

如圖5所示，在分子功能層面已知miRNA與新miRNA均注釋到結(jié)合、催化活性、轉(zhuǎn)運蛋白活性、信號傳感器活性、分子傳感器活性等條目。二者均在結(jié)合條目占比最多，3 693 條已知miRNA注釋到結(jié)合條目，所占比例為47.72%，5 610 條新miRNA注釋到結(jié)合條目，所占比例為47.35%。如圖6所示，在細胞組成層面已知miRNA與新miRNA均注釋到細胞、細胞部分、細胞器、膜、細胞器部分、大分子復合物等條目。二者均在細胞條目顯著富集，4 639 條已知miRNA 注釋到細胞條目，所占比例為20.42%，7 036 條新miRNA條注釋到細胞條目，所占比例為20.3%。柴玉霞等[28]利用GO功能注釋對驢乳與人乳miRNA進行分析，發(fā)現(xiàn)驢乳與人乳miRNA主要參與細胞、結(jié)合、催化活性、細胞代謝等過程。深入了解乳miRNA的功能可以為日后乳制品的深度研發(fā)提供技術(shù)支持。

圖5 牛乳miRNA靶基因在分子功能層面注釋條目統(tǒng)計Fig.5 Statistics of annotation entries of milk miRNA target genes at the molecular function level

圖6 牛乳miRNA靶基因在細胞組成層面注釋條目統(tǒng)計Fig.6 Statistics of annotation entries of milk miRNA target genes at the level of cell composition

2.6 靶基因通路富集分析

對牛乳外泌體mi RNA 靶基因進行通路富集分析，已知miRNA中共有10 341 個靶基因被注釋到310 條通路中，17 條通路獲得顯著富集（P＜0.05）（圖7），為內(nèi)吞作用（KEGG編號ko04144）、百日咳（ko05133）、溶酶體（ko04142）、MAPK信號通路（ko04010）、趨化因子信號通路（ko04062）、弓形體病（ko05145）、胰島素抵抗（ko04931）、氨基酸的生物合成（ko01230）、幽門螺桿菌感染中的上皮細胞信號（ko05120）、志賀氏菌病（ko05131）、突觸囊泡周期（ko04721）、TNF信號通路（ko04668）、精氨酸生物合成（ko00220）、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路（ko04933）、囊泡運輸中的SNARE相互作用（ko04130）、PI3K-Akt信號通路（ko04151）、2-氧代羧酸代謝（ko01210）。有141 條miRNA靶基因富集到內(nèi)吞作用通路，且該通路獲得極顯著富集（P＜0.001）。內(nèi)吞作用主要介導細胞外蛋白、微量營養(yǎng)素和跨膜細胞表面蛋白的攝取[29]。通過產(chǎn)生不同大小的膜結(jié)合載體（直徑約5～60 nm），與早期內(nèi)體融合控制細胞表面受體、通道和轉(zhuǎn)運蛋白的數(shù)量，不僅能調(diào)節(jié)細胞對細胞外環(huán)境的敏感性，還可以介導突觸傳遞后的突觸囊泡循環(huán)[30-31]。已知miRNA序列的靶基因富集最多的通路是PI3K-Akt信號通路（ko04151），171 個miRNA序列靶基因富集到該通路。Rani等[32]對水牛乳外泌體miRNA進行KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)豐富的水牛乳miRNA靶基因參與PI3K-Akt信號通路。

圖7 牛乳外泌體中已知miRNA顯著富集通路Fig.7 Known miRNA enrichment pathways in bovine milk exosomes

15 991 個新miRNA靶基因被注釋到311 條通路中，有8 條通路顯著富集（P＜0.05）（圖8），為幽門螺桿菌感染的上皮細胞信號轉(zhuǎn)導通路（ko05120）、趨化因子信號通路（ko04062）、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路（ko04933）、過氧化物酶體（ko04146）、溶酶體（ko04142）、內(nèi)吞作用（ko04144）、沙門氏菌感染（ko04151）、百日咳（ko05133）。其中最顯著富集的通路是幽門螺桿菌感染的上皮細胞信號轉(zhuǎn)導通路（ko05120），61 個靶基因富集到該通路，幽門螺桿菌不僅能引起胃炎、腺體增生，還與癌癥有關(guān)。癌癥通路（ko05200）是新miRNA序列靶基因富集最多的通路，249 個miRNA序列靶基因富集到該通路。

圖8 牛乳外泌體中新miRNA顯著富集通路Fig.8 Novel miRNA enrichment pathways in bovine milk exosomes

牛乳外泌體已知miRNA與新miRNA靶基因主要與疾病、免疫通路、代謝、信號轉(zhuǎn)導等通路相關(guān)。本研究已知miRNA與新miRNA靶基因均顯著富集在百日咳（ko05133）、趨化因子信號通路（ko04062）、溶酶體（ko04142）、內(nèi)吞作用（ko04144）等通路。百日咳是一種由百日咳桿菌引起的急性呼吸道疾病，傳染速度快且恢復期長[33]。趨化因子是沿著濃度梯度觸發(fā)細胞趨化的小細胞因子，可以由內(nèi)皮細胞、心肌細胞、炎癥細胞等細胞類型表達。它們可以在損傷組織中被檢測到，通過調(diào)節(jié)白細胞向炎癥部位的轉(zhuǎn)移控制組織穩(wěn)態(tài)[34-35]。溶酶體是具有酸性和降解管腔的末端細胞器，可以消化內(nèi)吞、吞噬和自噬接收的大分子，主要通過與目標細胞器融合、與目標細胞器交換這兩種途徑發(fā)揮作用[36]。這些通路的發(fā)現(xiàn)表明牛乳外泌體miRNA在特定信號通路中發(fā)揮重要作用，不僅與牛自身生理狀態(tài)息息相關(guān)，還可能在子代生長中具有重要意義。本研究結(jié)果為牛外泌體中miRNA的功能提供了新的見解，為以牛乳為基料開發(fā)嬰兒配方乳粉和功能性乳制品提供了新的思路和理論基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

采用密度梯度離心法從牛乳中提取外泌體，通過透射電子顯微鏡觀察到牛乳外泌體呈經(jīng)典橢圓形。提取外泌體中的RNA并進行質(zhì)量評價，利用Illumina測序技術(shù)對sRNA進行測序，共獲得3 899 629 條純凈序列，分類注釋后得出sRNA序列中含有rRNA、miRNA、snRNA、tRNA等，rRNA所占比例最大，為63.08%。sRNA序列的長度分布于18～32 nt，在28 nt長度處集中。統(tǒng)計sRNA堿基偏好性發(fā)現(xiàn)序列首位顯著偏好堿基G，sRNA的2、4、28、31、32號位點也顯著偏好堿基G。去除非miRNA之外的全部序列后，在牛外泌體中比對出61 種已知miRNA，預測到346 種新miRNA序列，已知miRNA中表達量占比前3的miRNA（let-7a、let-7b、miR-1246）數(shù)量占總數(shù)量的61.46%。生物信息學分析表明牛乳外泌體miRNA主要在細胞過程、單一生物體過程、代謝過程等生物過程發(fā)揮作用，主要構(gòu)成細胞、細胞部分、細胞器等細胞組成，主要參與結(jié)合、催化活性、轉(zhuǎn)運蛋白活性等分子功能。對miRNA靶基因進行KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)已知miRNA與新miRNA靶基因主要富集在百日咳、溶酶體、趨化因子信號通路、內(nèi)吞作用等通路。本研究對牛乳外泌體中的miRNA種類和功能進行了深入研究，為以牛乳為基料的嬰幼兒乳粉及功能性乳制品開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。