Protamex酶水解對玉米谷蛋白泡沫性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特性的影響

范廣琦，王俊彤,2,，李 丹,2，崔素萍,3，李 晶，鄭喜群,3,

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319；3.糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程研究中心，黑龍江 大慶 163319）

2021年，全國玉米產(chǎn)量約27 255萬 t，玉米加工副產(chǎn)物總量可達(dá)7 000萬 t左右。玉米蛋白粉（corn gluten meal，CGM）是濕法生產(chǎn)玉米淀粉的主要副產(chǎn)物之一，其蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%～65%，是一種豐富的植物蛋白質(zhì)資源[1-2]。玉米蛋白質(zhì)由68%醇溶蛋白、22%谷蛋白及少量白蛋白和球蛋白等組成，水溶性差，不適宜直接在食品行業(yè)中的應(yīng)用，而通常是作為飼料或直接廢棄[3]。玉米谷蛋白主要由谷氨酰胺、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸及結(jié)氨酸等氨基酸組成，酰胺基氨基酸比例較高，是天然表面活性劑的良好來源。但玉米谷蛋白是由大約20多種分子質(zhì)量在11～127 ku的不同蛋白質(zhì)亞基以二硫鍵為主要相互作用力而緊密連接的巨大、復(fù)雜的大分子蛋白質(zhì)[4]，且僅能溶于稀堿溶液。這導(dǎo)致其很難在食品體系中發(fā)揮起泡或乳化作用。因此，本研究希望通過適度修飾玉米谷蛋白結(jié)構(gòu)，增強谷蛋白在氣/水界面吸附的能力，從而改善其起泡性質(zhì)，拓寬玉米谷蛋白在蛋糕、啤酒、冰淇淋以及攪打稀奶油等制品中的應(yīng)用[5-6]。

已有研究表明物理和化學(xué)方法能夠提高谷蛋白的功能性質(zhì)。Zhao Meng等[7]發(fā)現(xiàn)通過堿熱處理大米谷蛋白可提升其起泡性及泡沫穩(wěn)定性；Wang Yang等[8]采用低功率密度超聲法對CGM進(jìn)行改性發(fā)現(xiàn)CGM局部的氨基酸序列相互作用發(fā)生改變，此外，劉金玲[9]和Wang Yaru[10]等分別采用糖基化以及磷酸化等化學(xué)修飾法對玉米谷蛋白和大米谷蛋白樣品進(jìn)行改性，結(jié)果表明玉米谷蛋白和大米谷蛋白的功能性質(zhì)顯著提高。酶水解法也是蛋白質(zhì)改性的有效方法，具有反應(yīng)條件溫和、毒副作用小等優(yōu)點，在食品蛋白質(zhì)深加工中應(yīng)用廣泛。Wang Yonghui等[11]采用Alcalase酶水解CGM并與單寧酸復(fù)合，其混合物的起泡性及氣/水界面行為均顯著優(yōu)于玉米蛋白；Klost等[12]則利用胰蛋白酶對豌豆分離蛋白進(jìn)行水解，發(fā)現(xiàn)水解可有效提高蛋白質(zhì)的溶解性、乳化性等功能性質(zhì)并且對豌豆分離蛋白的界面性質(zhì)也產(chǎn)生了積極的影響。但有報道稱過度水解會導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)遭到劇烈破壞反而使其功能性質(zhì)降低，由于過小的肽段會失去某些形成幾種功能特性所需的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的能力，從而影響其功能性質(zhì)[13]。因此，對玉米谷蛋白進(jìn)行適度的水解必不可少。Protamex是經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵而制得，屬于內(nèi)切蛋白酶，具有廣泛的酶切位點，使具有緊密空間結(jié)構(gòu)的大分子質(zhì)量玉米谷蛋白的肽鍵斷裂。

本研究在前期研究結(jié)果基礎(chǔ)上[4]，采用Protamex酶解玉米谷蛋白，以不同酶解時間表示水解進(jìn)程，探討不同酶解時間條件下玉米谷蛋白的起泡性、泡沫微觀形態(tài)、表面張力、靜態(tài)流變學(xué)特性、粒徑分布及結(jié)構(gòu)性質(zhì)的變化情況，以期為蛋白酶適度修飾技術(shù)在玉米蛋白質(zhì)上的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)，從而促進(jìn)玉米蛋白質(zhì)的高值化應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CGM購自黑龍江龍鳳玉米開發(fā)有限公司，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65%（以干基計算）。

Protamex酶（食品級）丹麥諾維信公司；α-淀粉酶（食品級）北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-(phenylamino)naphthylamine-1-sulfonic acid，ANS）美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T25高速分散機 德國IKA公司；ZEN3700納米激光粒度電位測定儀、kinexusPro＋高級旋轉(zhuǎn)流變儀英國Malvern公司；BX53F熒光顯微鏡 日本奧林巴斯公司；U-2910紫外-可見分光光度計 日本Hitachi公司；RF-6000熒光分光光度計 日本島津公司；MacroRAM拉曼光譜儀 堀場（中國）貿(mào)易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米谷蛋白的制備

參考許瑞雪等[14]的方法，先對CGM進(jìn)行去淀粉、去醇溶蛋白處理，再采用堿提酸沉法提取谷蛋白。去淀粉：CGM分散于pH 6.5水溶液中，料液比1∶10（g/mL），置于65 ℃恒溫水浴磁力攪拌器中，加入1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的α-淀粉酶反應(yīng)2 h，滅酶15 min后于4 000 r/min離心15 min，所得沉淀用純水洗滌3 次，晾干、粉碎。去醇溶蛋白：去淀粉后樣品分散于70%乙醇溶液中，料液比1∶10（g/mL），置于60 ℃水浴中抽提醇溶蛋白，2 h后于4 000 r/min離心15 min，重復(fù)抽提2 次，將沉淀晾干、粉碎。提取谷蛋白：將預(yù)處理后樣品以料液比1∶10分散于0.1 mol/L NaOH溶液，置于60 ℃恒溫水浴磁力攪拌器中提取2 h，于4 000 r/min離心15 min；取上清液用HCl（4 mol/L）溶液調(diào)節(jié)pH值至等電點，于4 000 r/min離心15 min，將沉淀用70%乙醇溶液和蒸餾水分別洗滌3 次，并將pH值調(diào)回至7.0，將所得谷蛋白冷凍干燥、粉碎后過80 目篩備用。

1.3.2 Protamex酶水解玉米谷蛋白

將1.3.1節(jié)所得玉米谷蛋白分散于蒸餾水中，底物質(zhì)量濃度5 g/100 mL，按酶與底物之比0.81%加入Protamex酶，在pH 7.0、60 ℃條件下進(jìn)行水解，期間以0.1 mol/L NaOH溶液維持pH值恒定，并采用pH-stat法[15]測定水解度。水解反應(yīng)分別進(jìn)行10、30、60、120 min和150 min后，煮沸30 min滅酶，水解液于4 500 r/min離心15 min，所得上清液冷凍干燥后為水解物，待測。

1.3.3 溶解性的測定

參考Surówka等[16]的質(zhì)量差法稍作修改，將2 mL離心管標(biāo)記、稱量記為m1，稱取樣品0.1 g置于離心管中，再向離心管中加入1 mL的蒸餾水，旋渦振蕩10 min，后10 000 r/min離心10 min，棄去上清液，將沉淀物于80 ℃干燥8 h，最后將帶有沉淀物的離心管稱量記為m2。按照式（1）計算：

1.3.4 泡沫性質(zhì)的測定

參照Zheng Xiqun等[4]所述攪打法測定，并稍作修改。樣品分散于蒸餾水中制成質(zhì)量濃度為1 g/100 mL的蛋白溶液。取20 mL樣品溶液放置于50 mL燒杯中，記錄初始高度（H0），以13 500 r/min高速間歇攪打2 min，立刻記錄此時泡沫高度H1，室溫下靜置30 min后的記錄泡沫高度H2。起泡性和泡沫穩(wěn)定性按照式（2）、（3）計算：

1.3.5 泡沫宏觀和微觀形態(tài)觀察

按照1.3.4節(jié)方法將樣品溶液攪打起泡，用相機拍照記錄泡沫產(chǎn)生0、10、20 min和30 min的宏觀形態(tài)變化。同時取部分泡沫置于載玻片上，并于顯微鏡下觀察并記錄相應(yīng)的微觀形態(tài)變化。

1.3.6 表面張力的測定

將樣品配制為質(zhì)量濃度1 g/100 mL的分散液，采用DCAT21自動表面張力儀按照GB/T 27842—2011《化學(xué)品 動態(tài)表面張力的測定 快速氣泡法》的方法測定其表面張力[17]。

1.3.7 粒徑及Zeta電位的測定

參照Sharan等[18]的方法，將樣品制為質(zhì)量濃度1 mg/mL分散液并過0.22 μm水系膜，設(shè)置溫度為25 ℃，蛋白折射率1.46，吸收參數(shù)1.33，溶劑為水，采用馬爾文納米激光粒度電位測定儀進(jìn)行測定。

1.3.8 內(nèi)源熒光光譜的測定

參照Tao Xia等[19]的方法，將樣品制為質(zhì)量濃度0.1 mg/mL的分散液，室溫下通過熒光分光光度計掃描其內(nèi)源熒光強度。設(shè)定激發(fā)波長為290 nm，發(fā)射波長范圍300～400 nm，狹縫寬度5 nm。

1.3.9 表面疏水性的測定

參照Zheng Xiqun等[4]的ANS探針法并稍作修改，將樣品溶解并稀釋至蛋白質(zhì)量濃度0.01～0.20 mg/mL之間。取5 mL樣品溶液加入25 μL ANS試劑（濃度為8 mmol/L，溶于0.01 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液）在室溫條件下反應(yīng)15 min。設(shè)定熒光分光光度計的激發(fā)波長為390 nm，發(fā)射波長為470 nm，狹縫5 nm，分別測定樣品的熒光強度（FI0）和樣品加入ANS試劑后的熒光強度（FI1），F(xiàn)I1和FI0的差值記為FI，以蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，F(xiàn)I為縱坐標(biāo)作圖，曲線初始斜率即為樣品的表面疏水性指數(shù)。

（2）經(jīng)濟管理。長期以來，由于水資源伸手即來，人們對水資源的價值缺乏進(jìn)一步的更深的認(rèn)識。所以在彌補行政手段不足的同時，我們每一個個體都應(yīng)重新確立水的意義和價值，與此同時政府建立以水權(quán)為操作的核心、以水價為操作的通用手段、有償使用水資源的社會主義市場機制。所以水權(quán)的初始分配必須通過政府機構(gòu)進(jìn)行并建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.10 拉曼光譜的測定

參照Chang Cuihua等[20]的方法，將樣品平鋪在載玻片上進(jìn)行拉曼光譜的測定，設(shè)置波長532 nm，掃描范圍400～2 000 cm-1，掃描10 次，每個樣品3 次累加，以苯丙氨酸（1 003±1）cm-1的譜峰強度作為歸一化因子并運用LabSpec6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.3.11 靜態(tài)流變學(xué)的測定

參考李弓中等[21]的方法并略有修改。樣品制為質(zhì)量濃度為10 mg/mL的分散液，將樣品分散液緩慢傾注于于高級旋轉(zhuǎn)流變儀的樣品臺上。設(shè)定剪切速率為0.1～100 s-1，測試夾具為60 mm的錐板。將表觀黏度與剪切速率按照式（4）的冪律方程進(jìn)行擬合：

式中：η為黏度/（Pa · s ）；K為黏稠系數(shù)/（Pa·sn）；ε為剪切速率/s-1；n為流動指數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 Protamex酶水解對玉米谷蛋白泡沫性質(zhì)的影響

由圖1可知，經(jīng)Protamex酶水解的玉米谷蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性均顯著高于原玉米谷蛋白（起泡性（124.46±3.85）%、泡沫穩(wěn)定性（102.96±3.51）%，P＜0.05），且隨著水解時間延長，呈先增加后減小的變化趨勢。在水解120 min時，水解物的起泡性和泡沫穩(wěn)定性都為最高，即（350.57±2.83）%和（228.39±2.90）%，分別是原玉米谷蛋白的2.8 倍和2.2 倍左右。Patino[22]和Ren[23]等水解向日葵蛋白分離物時得到了相似的結(jié)果，水解可以提高蛋白質(zhì)的起泡力和泡沫穩(wěn)定性，但過度水解對其起泡性和泡沫穩(wěn)定性產(chǎn)生了不利影響。

圖1 水解時間對玉米谷蛋白起泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on foaming capacity and foam stability of corn glutelin

圖2a、b分別為玉米谷蛋白及其水解物經(jīng)攪打產(chǎn)生泡沫的宏觀和微觀圖像。玉米谷蛋白分散液中懸浮有明顯的大顆粒，產(chǎn)生的泡沫量少且稀疏、形狀不規(guī)則，隨放置時間的延長泡沫幾乎消失。微觀形貌顯示玉米谷蛋白膜在泡沫形成10 min時已經(jīng)發(fā)生崩塌。玉米谷蛋白經(jīng)過Protamex酶水解后，其水解物的溶解性顯著增加（P＜0.05）（表1），因此在泡沫中未見明顯顆粒，泡沫量明顯增加且較為綿密，微觀形貌顯示氣泡數(shù)量增多、近似圓形且大小趨于一致、平均氣泡面積變小，分布致密有序。水解120 min樣品所形成的泡沫最細(xì)小均勻，且在泡沫形成后的30 min內(nèi)，與其他水解時間的樣品相比，其氣泡數(shù)量最多，平均氣泡面積最小，蛋白膜的厚度較厚。有報道稱平均氣泡面積越小，分布越均勻致密越有利于其穩(wěn)定[24]。但隨著酶解時間的延長，水解物的起泡性和泡沫穩(wěn)定性都顯著降低（P＜0.05）。蛋白質(zhì)的起泡性與蛋白質(zhì)溶解性、分子尺寸、疏水性和分子柔性等性質(zhì)有關(guān)，泡沫穩(wěn)定性則由蛋白質(zhì)的黏度、膜的厚度、分子間相互作用等性質(zhì)決定[25]。因此，通過對以上性質(zhì)的研究解析水解后玉米谷蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的變化原因。

表1 水解時間對玉米谷蛋白溶解性、水解度、表面張力和表面疏水性的影響Table 1 Effect of hydrolysis time on solubility,hydrolysis degree,surface tension and surface hydrophobicity of corn glutelin

2.2 Protamex酶水解對玉米谷蛋白溶解性和表面張力的影響

由表1 可知，原玉米谷蛋白的溶解性僅為（20.90±0.17）%，經(jīng)Protamex酶水解后，水解物的溶解性顯著提高，在水解60 min后均可達(dá)到90%以上。這說明Protamex酶水解能夠改善谷蛋白的溶解性，其水解物中蛋白質(zhì)/多肽能夠更好地分散在水中，形成膠體態(tài)溶液。研究過程中發(fā)現(xiàn)水解物分散液并非透明澄清的溶液，而是可以看到少量膠體物質(zhì)懸浮于溶液中，并且在溶解性測定方法的離心力下，這些懸浮的蛋白質(zhì)也不能夠完全被沉淀，而是較穩(wěn)定的存在于上清液中。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液被攪打時，只有分散在溶液中的蛋白質(zhì)才能夠快速在氣/水界面吸附[26]。因此，水解物溶解性的提高使可以吸附到氣/水界面上的蛋白質(zhì)含量增加，這對玉米谷蛋白起泡力的改善具有積極意義。隨著水解時間的延長，玉米谷蛋白的水解度在反應(yīng)前30 min中快速增加，之后持續(xù)升高并在120 min后趨于平穩(wěn)，所有水解物的蛋白質(zhì)含量在74%～85%之間。原玉米谷蛋白的表面張力為（71.83±0.50）mN/m，經(jīng)Protamex酶水解后，其水解物的表面張力均顯著降低，且隨水解時間的延長呈先降低后升高趨勢。當(dāng)水解時間在120 min時表面張力達(dá)最低（60.40±0.72）mN/m，這與其起泡性的變化趨勢一致。這是由于適度的水解有利于增強蛋白質(zhì)的分子柔性，暴露出更多疏水基團，更有利于水解物中蛋白質(zhì)/多肽的疏水性基團和親水性基團分別伸展至氣相和水相，從而在界面處發(fā)生吸附，導(dǎo)致表面張力的降低[27]。表面張力反映蛋白質(zhì)分子在氣/水界面的吸附和展開的速度。表面張力越低，蛋白能夠越快速的完成在氣水界面上的吸附，形成有一定黏彈性的保護(hù)層，促進(jìn)泡沫的形成以及維持泡沫體系的穩(wěn)定[28]。過度的水解使蛋白質(zhì)分子持續(xù)減小，低分子質(zhì)量多肽由于肽段過短而失去分子柔性，不能在界面處發(fā)生吸附，導(dǎo)致水解時間為150 min水解物的表面張力增加。

2.3 Protamex酶水解對玉米谷蛋白粒徑分布及Zeta電位的影響

蛋白質(zhì)受到酶和熱的作用，使得蛋白質(zhì)分子發(fā)生解離和聚集的動態(tài)變化，通過測量粒徑及Zeta電位可對其水解過程中蛋白質(zhì)分子大小、聚集和靜電相互作用情況進(jìn)行表征。由圖3a可知，玉米谷蛋白的粒徑分布圖中出現(xiàn)3 個明顯粒徑峰，P1（＜68 nm）、P2（68～825、900 nm）和P3（＞3 000 nm）。隨著Protamex酶水解時間的延長，水解物的粒徑逐漸向小粒徑方向移動，其中P2峰逐漸向左移動與P1峰重合，在水解60 min后的酶解物中P1峰完全消失，同時粒徑較大的P3峰也在水解60 min后消失。這說明著Protamex酶水解作用不僅使玉米谷蛋白的粒徑降低，同時使粒徑均一度增加。由圖3b可知，水解30 min后酶解物平均粒徑顯著降低（P＜0.05），并隨著水解時間延長而持續(xù)降低。這可能是由于水解作用切斷了玉米谷蛋白分子內(nèi)肽鍵，大分子質(zhì)量聚集體發(fā)生降解，低分子質(zhì)量二聚體/亞基或者多肽逐步釋放，使粒徑降低。而水解反應(yīng)過程中水熱環(huán)境的作用可能引起暴露巰基的氧化交聯(lián)等共價作用使部分蛋白質(zhì)/多肽發(fā)生聚集，因此水解60 min和120 min樣品的平均粒徑差異不顯著（P＞0.05）。楊曉釩等[29]在酶水解處理扁桃仁蛋白質(zhì)的研究中也發(fā)現(xiàn)了水解時間超過60 min后，水解物的粒徑反而逐漸增大。值得注意的是，本研究采用馬爾文納米激光粒度儀測定的樣品粒徑為納米級別，對玉米谷蛋白中部分粒徑較大的大分子質(zhì)量天然聚集體未能測出。

圖3 水解時間對玉米谷蛋白的粒徑分布（a）和平均粒徑及Zeta電位（b）的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on particle size distribution (a),mean particle size and zeta potential (b) of corn glutelin

由圖3b可以看出，與原谷蛋白相比，Protamex酶水解物的Zeta電位絕對值顯著降低（P＜0.05），在水解120 min時達(dá)到最低，為（16.30±0.50）mV，而酶解150 min時回升至（19.47±0.31）mV。玉米谷蛋白的Zeta電位為負(fù)值，說明其分子表面帶有負(fù)電荷，絕對值降低說明了水解蛋白質(zhì)分子表面凈電荷減少。這是由于水解過程中脫氨基作用和帶正電荷氨基酸暴露，使得蛋白質(zhì)/多肽所帶正電荷增加，從而中和部分負(fù)電荷所致。當(dāng)水解時間延長至150 min，可能是由于反應(yīng)進(jìn)程中蛋白質(zhì)/多肽的解聚與聚集動態(tài)變化導(dǎo)致部分帶正電荷氨基酸重新被包埋而使絕對值增加，也可能是帶負(fù)電荷氨基酸暴露增加所致。表面凈電荷的減少對蛋白質(zhì)/多肽在膜界面的吸附和擴散有利，促進(jìn)泡沫的形成。同時還能夠降低它們在界面的靜電斥力，有利于形成黏彈性較好的界面膜而增強泡沫穩(wěn)定性[30]。Xiong Wenfei等[31]研究也指出較小的粒徑與表面電荷可加速蛋白質(zhì)分子的擴散速度，提升其在氣/水界面的吸附速率，并有利于蛋白質(zhì)分子在界面上的展開和重排，從而提高起泡性。

2.4 Protamex酶水解對玉米谷蛋白內(nèi)源熒光光譜的影響

玉米谷蛋白中的芳香族氨基酸，即苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸殘基在激發(fā)波長290 nm處可產(chǎn)生熒光，即內(nèi)源性熒光。內(nèi)源熒光光譜變化反映了谷蛋白及其水解物中芳香族氨基酸所處的微環(huán)境極性的變化情況，是對Protamex酶水解過程中蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)變化的表征[32]。由圖4可知，與原玉米谷蛋白相比，Protamex酶水解物的內(nèi)源性熒光光譜峰位發(fā)生明顯的紅移現(xiàn)象，且內(nèi)源性熒光強度水解時間的延長而顯著增強。這表明水解使玉米谷蛋白的芳香族氨基酸特別是色氨酸的極性環(huán)境增強，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)伸展。Zheng Zhaojun等[33]通過Bromelain和Alcalase分別水解黑豆蛋白時也獲得了相似結(jié)果，水解產(chǎn)物的熒光強度均高于原蛋白樣品。Protamex屬于絲氨酸蛋白酶，酶水解過程中以絲氨酸殘基作為活性中心主要促使玉米谷蛋白中酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸及亮氨酸等的羧基端多肽鏈裂解，導(dǎo)致芳香族氨基酸殘基和疏水性氨基酸的暴露，增強了玉米谷蛋白的分子柔性，這有利于玉米谷蛋白質(zhì)能發(fā)揮良好的起泡力和泡沫穩(wěn)定性。但是在水解150 min盡管有更多的芳香族氨基酸殘基暴露，卻不能使水解物的起泡力和泡沫穩(wěn)定性持續(xù)增加，這是因為影響玉米谷蛋白水解物起泡性質(zhì)變化是多種因素相互作用的結(jié)果。

圖4 水解時間對玉米谷蛋白內(nèi)源熒光強度的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on endogenous fluorescent intensity of corn glutelin

2.5 Protamex酶水解對玉米谷蛋白表面疏水性的影響

蛋白質(zhì)表面疏水性是維持其空間結(jié)構(gòu)、界面性質(zhì)及分子間相互作用力的重要因素[4]。由表1可知，Protamex酶水解物的表面疏水性顯著升高（P＜0.05），隨著水解時間的延長，表面疏水性指數(shù)持續(xù)增加。在蛋白質(zhì)天然構(gòu)像中，一部分疏水性氨基酸會埋藏在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，而經(jīng)過水解后谷蛋白分子結(jié)構(gòu)變得松散、舒展，使原本包埋于分子內(nèi)部的疏水基團暴露于表面，疏水基團暴露的增多使得疏水性增強，分子柔性增大，這有利于蛋白質(zhì)在界面上吸附速率的升高從而提高起泡性[34]。與內(nèi)源熒光光譜的結(jié)果一致，150 min水解物的表面疏水性顯著高于其他樣品，但其起泡力和泡沫穩(wěn)定性均降低，這可能是由于此時谷蛋白分子的其他性質(zhì)因素變化對其泡沫性質(zhì)的消極作用更顯著。

2.6 Protamex酶水解對玉米谷蛋白拉曼光譜的影響分析

由圖5可知，玉米谷蛋白及其Protamex酶水解物的拉曼光譜在酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）和酰胺III帶（1 230～1 350 cm-1）均有屬于肽鍵（—CO—NH—）的振動模式，酰胺I帶振動模式主要源于肽基平面內(nèi)C＝O伸縮振動和較小程度的N—H彎曲振動，并且水解物的在1 650 cm-1附近和1 290 cm-1附近的譜峰的強度與玉米谷蛋白相比有所減弱，反映了水解后蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。波數(shù)1 004 cm-1歸屬于苯丙氨酸苯環(huán)伸縮振動，由于該譜峰受外界環(huán)境影響小而被作為歸一化因子。850 cm-1和830 cm-1附近的譜帶為酪氨酸雙峰帶，760 cm-1附近的譜帶為色氨酸吲哚環(huán)的振動，其譜峰強弱反映了其所處微環(huán)境的變化情況[35]。

圖5 不同水解時間玉米谷蛋白的拉曼光譜Fig.5 Raman spectra of corn glutelin at different hydrolysis times

2.6.1 Protamex酶水解對玉米谷蛋白主鏈構(gòu)象分析

通常利用酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）對各蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量分析。酰胺I帶拉曼光譜峰的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋（1 650～1 660 cm-1）、無規(guī)卷曲（1 661～1 665 cm-1）、β-折疊（1 666～1 680 cm-1）及β-轉(zhuǎn)角（1 681～1 690 cm-1）附近等構(gòu)成[35]。由圖6可知，玉米谷蛋白中α-螺旋結(jié)構(gòu)含量最高（39.56%），β-折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量相似（21%左右），無規(guī)卷曲含量最低（17.99%）。Protamex酶水解物中α-螺旋結(jié)構(gòu)含量顯著降低，在酶解120 min時達(dá)到最低（26.07%）。隨著水解時間的延長，β-折疊結(jié)構(gòu)含量無明顯變化，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量逐漸增加，β-轉(zhuǎn)角含量顯著增加（除150 min酶解物）。這說明Protamex酶水解使玉米谷蛋白的有序結(jié)構(gòu)向無序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，分子柔性增加。Yong Yehui等[36]在PG酶處理麥谷蛋白后發(fā)現(xiàn)其的二級結(jié)構(gòu)更加靈活，同時也伴隨著β-轉(zhuǎn)角含量增加的現(xiàn)象。α-螺旋結(jié)構(gòu)含有較多氫鍵，而玉米谷蛋白水解物中蛋白質(zhì)/多肽表面所帶同種電荷增多也會導(dǎo)致氫鍵斷裂使得α-螺旋結(jié)構(gòu)減少[21]。本研究中玉米谷蛋白質(zhì)分子無序結(jié)構(gòu)增加，分子柔性增強，利于分子內(nèi)部的疏水性氨基酸暴露，提高蛋白質(zhì)的疏水性，從而達(dá)到改變起泡性和泡沫穩(wěn)定性的目的。但水解時間延長至150 min無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量顯著高于β-折疊結(jié)構(gòu)，此時玉米谷蛋白水解物的起泡性和泡沫穩(wěn)定性均有降低，這可能說明高比例的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)不利于玉米谷蛋白在界面形成穩(wěn)定的界面膜。

圖6 水解時間對玉米谷蛋白二級結(jié)構(gòu)含量的影響Fig.6 Effect of hydrolysis time on secondary structure content of corn glutelin

2.6.2 Protamex酶水解對玉米谷蛋白側(cè)鏈構(gòu)象分析

酪氨酸雙峰帶位于850 cm-1和830 cm-1附近的譜帶，是酚羥基的氫鍵的良好指標(biāo)。通常用酪氨酸雙峰的羥苯基環(huán)的呼吸振動和環(huán)平面外彎曲振動倍頻之間費米共振譜線的相對強度比（I850/I830）反映氫鍵狀態(tài)和酪氨酸側(cè)鏈中酚羥基的電離狀態(tài)，判定蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基的暴露或者埋藏情況[35]。當(dāng)I850/I830＞1.0時，表明酪氨酸殘基暴露于水相環(huán)境，能夠參與溫和的或者微弱的氫鍵作用，而I850/I830＜1.0時，表明酪氨酸殘基埋藏在疏水環(huán)境，傾向于充當(dāng)氫鍵供體，起到增強氫鍵的作用。如圖7所示，本研究中玉米谷蛋白的I850/I830為0.58，表明酪氨酸殘基埋藏于分子內(nèi)部。當(dāng)Protamex酶水解60 min以后，I850/I830均＞1.0，此時酶解物中酪氨酸殘基呈“暴露”態(tài)。這與本研究中疏水相互作用的結(jié)果相符（表1）。

圖7 水解時間對玉米谷蛋白I850/I830和I760的影響Fig.7 Effect of hydrolysis time on I850/I830 and I760 of corn glutelin

色氨酸殘基的吲哚環(huán)伸縮振動會在760 cm-1附近產(chǎn)生光譜，代表色氨酸芳香基的局部環(huán)境的變化，埋藏殘基比暴露在極性環(huán)境中的殘基表現(xiàn)出更強的760 cm-1帶強度[35]。由圖7可知，隨水解時間延長，水解物的I760強度逐漸降低。這說明酶解使色氨酸殘基逐漸趨向于“暴露”態(tài)，疏水相互作用增強提高了蛋白質(zhì)的表面疏水性，這與內(nèi)源熒光光譜和表面疏水性的結(jié)果一致。江連洲等[37]利用Protex6L酶制劑水解大豆蛋白得到了相似結(jié)論，水解可使大豆蛋白分子表面色氨酸、酪氨酸殘基等暴露增多。

2.7 Protamex酶水解對玉米谷蛋白靜態(tài)流變學(xué)性質(zhì)的影響

蛋白溶液的流變學(xué)特性是評價蛋白質(zhì)氣/水界面性質(zhì)的重要指標(biāo)。由圖8可知，玉米谷蛋白及其水解物分散液的表觀黏度隨著掃描頻率的增加而逐漸減小，表現(xiàn)為剪切稀釋的流變特性，所有樣品均為非牛頓假塑性流體[22]。這說明水解作用沒有改變谷蛋白分散液的流變行為。同時，樣品分散液的表觀黏度與剪切速率能夠較好地擬合牛頓冪律方程，即R2＞0.95（表2）。

表2 不同水解時間的玉米谷蛋白水解物流變學(xué)擬合參數(shù)Table 2 Rheological parameters of corn glutelin at different hydrolysis times

根據(jù)牛頓冪律方程，K值為黏度系數(shù)，代表了流體的黏稠程度，K值越大代表流體越黏稠。由表2可知，K值的變化趨勢與圖8表觀黏度一致，呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，水解120 min樣品的K值達(dá)到最大，比玉米谷蛋白增加了67%。這一方面是由于酶水解使玉米谷蛋白的粒徑減小、溶解性顯著提高。另一方面，與天然玉米谷蛋白相比，水解物中的蛋白質(zhì)/多肽的結(jié)構(gòu)趨于無序、分子柔性更大、表面凈電荷降低。這都有了利于增強蛋白質(zhì)的水合能力，使得復(fù)水后蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用增強，表現(xiàn)為表觀黏度增強。因此，Protamex酶對玉米谷蛋白的適當(dāng)水解提高了其水解物中可溶性蛋白質(zhì)分子定向吸附能力，是其起泡性改善的關(guān)鍵因素。但水解150 min，酶解物的表觀黏度下降，這是由于過度水解導(dǎo)致水解物中蛋白質(zhì)/多肽的粒徑持續(xù)降低、無序結(jié)構(gòu)增加、靜電斥力增大等導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶液流動性增強，分子間相互作用減弱。N為流動指數(shù)，代表液體的流動性能，表2中水解150 min樣品的n顯著高于其他樣品，這也表明了此時分散液的流動性最大。

3 結(jié)論

采用Protamex酶水解玉米谷蛋白，通過控制水解時間能夠顯著提高玉米谷蛋白的泡沫性質(zhì)。當(dāng)水解時間120 min，水解物的起泡性和泡沫穩(wěn)定性最高，分別為（350.57±2.83）%和（228.39±2.90）%，且氣泡細(xì)小均勻、蛋白膜較厚。此時水解物的溶解性較佳、表觀黏度值最高。適當(dāng)?shù)乃庖环矫媸褂衩坠鹊鞍兹芙庑蕴岣?、表面張力降低、分子尺寸減?。涣硪环矫媸构鹊鞍椎摩?螺旋含量降低、無規(guī)卷曲與β-轉(zhuǎn)角含量增加、疏水性氨基酸殘基暴露，進(jìn)而使分子柔性增強、表面凈電荷減少、表面疏水性增強。這有利于玉米谷蛋白水解物中蛋白質(zhì)分子/多肽持續(xù)吸附在界面之上，在氣泡之間可形成有一定黏彈性的保護(hù)層，促進(jìn)泡沫的形成以及維持泡沫體系的穩(wěn)定。然而持續(xù)水解至150 min導(dǎo)致水解物中蛋白質(zhì)/多肽分子尺寸持續(xù)降低、結(jié)構(gòu)過度變形即無規(guī)卷曲含量顯著高于β-轉(zhuǎn)角含量及表面凈電荷增加，這導(dǎo)致水解物的氣泡間的蛋白膜出現(xiàn)流體排水現(xiàn)象，使得界面膜破裂，氣泡將逐漸靠近聚合，即起泡性和穩(wěn)定性下降。本研究對蛋白酶水解改善玉米谷蛋白和其他植物蛋白起泡性等功能性質(zhì)的應(yīng)用和研究提供了一定的理論依據(jù)，為玉米蛋白的高值化利用提供參考。