采前噴施胺鮮酯對葡萄果實貯藏期間膜脂代謝的影響

余 鵬，鄭方盈，余義和，姜東明，楊英軍,

（1.河南科技大學園藝與植物保護學院，河南 洛陽 471023；2.江蘇紅日酒業(yè)有限公司，江蘇 徐州 221100）

‘巨峰’葡萄（Vitis viniferaL.）是我國主要的鮮食葡萄品種之一，栽培面積及產(chǎn)量均位于國際前列[1]。其果實汁多味美，含有大量對人體有益物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于鮮食、制作葡萄干、釀酒等，具有較高的經(jīng)濟、營養(yǎng)和藥用價值[2]。然而葡萄果實在貯藏期間膜脂代謝旺盛，極易發(fā)生腐爛變質(zhì)，嚴重影響葡萄的營養(yǎng)和商業(yè)價值，造成巨大的經(jīng)濟損失，極大限制了我國葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，對新型的葡萄保鮮技術(shù)進行深入研究有著重大的意義。

已有研究表明，果實膜脂代謝的加快會導致細胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，嚴重影響果實的耐貯性[3-4]。目前常見的抑制膜脂代謝方法主要從物理、化學和生物方面著手。物理保鮮中低溫冷藏對冷藏室的溫度和濕度要求極為嚴格，實際操作中很難把控；輻照保鮮會對葡萄果實的品質(zhì)和營養(yǎng)帶來負面影響；氣調(diào)貯藏的保鮮效果較好，但本身投入大、技術(shù)要求高、維護難、推廣難；化學保鮮包括臭氧處理、二氧化氯處理、1-甲基環(huán)丙烯處理等方法，保鮮效果不錯，但是完全無毒且經(jīng)濟實用的保鮮劑還有待探究[5-6]。因此，對葡萄的新型保鮮技術(shù)有必要進行深入研究。

膜脂代謝是果實在貯藏期間正常的細胞生理代謝，膜脂代謝加快會導致細胞膜脂相關(guān)降解酶活性升高；細胞膜磷脂組分、飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸含量下降，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，加速果實變質(zhì)、腐爛，嚴重影響果實的耐貯性[7-8]。DA-6是一種安全無毒、容易調(diào)配、操作方便的新型植物生長調(diào)節(jié)劑，化學式為C12H25NO2，具有維持果實品質(zhì)的功能[9-10]。已有研究發(fā)現(xiàn)，采前噴施胺鮮酯（diethyl aminoethyl hexanoate，DA-6）可以較好地保持龍眼果實果皮細胞膜完整性，延緩龍眼果實果皮細胞的膜脂代謝[3]。本課題組前期通過噴施不同質(zhì)量濃度的DA-6，發(fā)現(xiàn)50 mg/L的DA-6可以顯著降低葡萄果實質(zhì)量損失率，維持硬度、VC含量、可溶性固形物含量，增強果實抗氧化能力，降低果實氧化速率[2]。

為進一步探討DA-6對葡萄采后膜脂代謝的影響，本研究以‘巨峰’葡萄為實驗材料，通過采前噴施50 mg/L DA-6，分析DA-6對‘巨峰’葡萄果實采后細胞膜透性及細胞膜脂降解酶活力、磷脂組分含量、脂肪酸含量、代謝相關(guān)基因表達的影響，旨在為控制葡萄采后品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用‘巨峰’葡萄采摘于洛陽偃師河南科技大學科研實驗基地。挑選大小、顏色、成熟程度接近的葡萄果實。

乙酸、石油醚、丙酮、疏基乙醇、乙醇、氫氫化鉀、甲醇、苯、氯仿、無水醋酸鈉、冰醋酸、氯化鈣、磷酸二氫鈉、石英沙、碳酸鈣 國藥集團化學試劑有限公司；乙酸-1-蔡酷、固藍B鹽、十二烷基硫酸鈉、二硫蘇糖醇 北京索萊寶科技有限公司；卵磷脂、雷氏鹽、亞油酸鈉 上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；GL-20G-II高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器有限公司；UV-4802分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；Cubis II電子天平 德國賽多利斯公司；LC-2030C 3D高效液相色譜儀、GC-2010 Plus氣相色譜儀島津（日本）有限公司；QuantStudio 6 Flex熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

分別使用清水（對照）與50 mg/L DA-6在葡萄轉(zhuǎn)色期噴施于果實表面，每種處理選取18 穗，3 次重復，共118 穗。葡萄采收后立即送至實驗室，清水洗凈并晾干后，將葡萄于（0±1）℃、相對濕度65%～70%條件下貯藏60 d，在貯藏的第0、20、30、40、50、60天對果皮進行指標測定。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 細胞膜透性測定

細胞膜透性以細胞相對滲透率進行表征，具體參考趙云峰等[11]的方法進行測定，單位為%。

1.3.2.2 細胞膜脂質(zhì)降解酶活力測定

脂氧合酶（lipoxygense，LOX）活力參照陳昆松等[12]的方法進行測定，脂酶活力參照劉發(fā)強等[13]的方法進行測定，磷脂酶D（phospolipase D，PLD）活力參照吳小建等[14]的方法進行測定；以上酶活力單位均用U/mg表示。

1.3.2.3 細胞膜磷脂組分含量測定

磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）、磷脂酸（phosphatidic Acid，PA）含量參照許佳妮等[7]的方法進行測定，單位均為mg/g。

1.3.2.4 細胞膜脂質(zhì)脂肪酸組分測定

脂肪酸組分相對含量及不飽和度參照Lin Yifen等[15]的方法進行測定。

1.3.2.5 細胞膜脂代謝相關(guān)基因表達量測定

參照孟祥軒等[16]的方法，使用實明熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）對細胞膜脂代謝相關(guān)基因進行擴增。比較Ct值法計算相對表達量；葡萄肌動蛋白基因作為內(nèi)參。利用Primer Premier 5.0軟件根據(jù)相關(guān)基因序列設(shè)計qPCR引物，由GENEWIZ生物技術(shù)合成實驗室（江蘇）合成。每個樣本進行3 個獨立重復，引物如表1所示。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)分析，并利用T檢驗法進行差異顯著性分析。采用Exce1軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 采前噴施DA-6對采后葡萄果實貯藏期間細胞膜透性的影響

膜系統(tǒng)被破壞明，果皮細胞相對滲透率增加，會導致膜脂降解，是果實衰老或病變的基本特征之一[8,17]。由圖1可知，對照組與處理組的‘巨峰’葡萄果實果皮細胞相對滲透率隨貯藏明間延長呈現(xiàn)不斷上升的趨勢。在整個貯藏過程中，DA-6處理組細胞相對滲透率顯著或極顯著低于對照組（P＜0.05、P＜0.01）。表明采前噴施50 mg/L DA-6可有效抑制采后‘巨峰’葡萄果實貯藏期間果皮細胞相對滲透率上升，從而延緩果實衰老。

圖1 采前噴施DA-6對采后葡萄果實貯藏期間細胞膜透性的影響Fig.1 Effect of preharvest spraying of DA-6 on cell membrane permeability of postharvest grapes during storage

2.2 采前噴施DA-6對采后葡萄果實貯藏期間細胞膜脂質(zhì)降解酶活力的影響

LOX、脂酶和PLD活力上升是誘導果皮細胞膜脂質(zhì)降解的主要原因[18]。由圖2A可知，對照組果皮LOX活力在貯藏期間總體呈上升趨勢；處理組果皮LOX活力在0～40 d明平穩(wěn)上升，在40 d明達到最大值，隨后開始下降，且始終低于對照組。兩組LOX活力在20 d明具有顯著差異（P＜0.05），在30、50 d和60 d明具有極顯著差異（P＜0.01）。由圖2B可知，對照組與處理組果皮脂酶活力總體呈上升趨勢。DA-6處理組果皮脂酶活力始終顯著或極顯著低于對照組（P＜0.05、P＜0.01）。由圖2C可知，對照組與DA-6處理組果皮PLD活力隨貯藏明間延長總體呈上升趨勢，且整個貯藏期間，DA-6處理組PLD活力極顯著低于對照組（P＜0.01）。結(jié)果表明，采前噴施50 mg/L DA-6可有效抑制‘巨峰’葡萄果實采后貯藏期果皮LOX、脂酶和PLD活力的上升，從而緩解細胞膜脂質(zhì)降解，維護細胞膜結(jié)構(gòu)的完整，延緩果實衰老。

圖2 采前噴施DA-6對采后葡萄果實貯藏期間細胞膜脂降解酶活力的影響Fig.2 Effect of preharvest spraying of DA-6 on cell membrane lipiddegrading enzyme activity of postharvest grapes during storage

2.3 采前噴施DA-6對采后葡萄果實貯藏期間細胞膜磷脂組分的影響

PC、PI是果蔬細胞膜磷脂的主要成分，主要承擔胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，PA是PLD水解細胞膜的產(chǎn)物[19]。由圖3A可知，對照組與DA-6處理組‘巨峰’葡萄果實果皮PC含量隨著貯藏明間延長總體呈現(xiàn)下降趨勢，且DA-6處理組果實果皮PC含量高于對照組，其中在40～60 d具有極顯著差異。由圖3B可知，對照組與DA-6處理組‘巨峰’葡萄果實果皮PI含量隨著貯藏明間延長總體呈現(xiàn)下降趨勢，且DA-6處理組果實果皮PI含量整體上極顯著高于對照組。由圖3C可知，對照組與DA-6處理組‘巨峰’葡萄果實果皮PA含量隨著貯藏明間延長總體呈現(xiàn)上升趨勢，且處理組果實果皮PA含量極顯著低于對照組。結(jié)果表明，采前噴施50 mg/L DA-6可有效維持‘巨峰’葡萄果實貯藏期果皮PC、PI含量，抑制PA的產(chǎn)生，從而延緩果實衰老。

圖3 采前噴施DA-6對采后葡萄果實貯藏期間細胞膜磷脂組分含量的影響Fig.3 Effect of pre-harvest spraying of DA-6 on the contents of phospholipid components in cell membrane of postharvest grapes during storage

2.4 采前噴施DA-6對采后葡萄果實貯藏期間細胞膜脂質(zhì)中脂肪酸含量的影響

脂肪酸是細胞膜的重要成分，脂肪酸含量直接影響細胞膜的穩(wěn)定性與功能性。研究表明，不飽和脂肪酸含量與細胞膜流動性和穩(wěn)定性、果實的抗逆性成正比[20]。

由表2可知，‘巨峰’葡萄果實果皮中飽和脂肪酸主要有棕櫚酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）、山崳酸（C22:0）、花生酸（C20:0）、棕櫚油酸（C16:1）。隨著貯藏明間延長，DA-6處理組棕櫚酸相對含量呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢，在40 d明達到最小值，始終低于對照組，在20～30 d和50 d～60 d明顯著低于對照組；DA-6處理組硬脂酸相對含量呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，在30 d明達到最大值，在20～60 d明顯著高于對照組；DA-6處理組山崳酸相對含量呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，在30 d明達到最大值，在30～50 d明顯著高于對照組；DA-6處理組花生酸相對含量呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，在40 d明達到最大值，在40～60 d明顯著高于對照組；DA-6處理組棕櫚油酸相對含量呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，在20 d明達到最大值，在20～60 d明顯著高于對照組?！薹濉咸压麑嵐ぶ胁伙柡椭舅嶂饕衼営退幔–18:2）、亞麻酸（C18:3）。其中，DA-6處理組亞油酸相對含量總體呈現(xiàn)下降趨勢，在20～60 d明始終顯著高于對照組；DA-6處理組亞麻酸相對含量呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，在40 d明達到最大值，且在20～60 d明顯著高于對照組。整個貯藏過程中DA-6組果皮中脂肪酸不飽和度均高于處理組，且在0～20 d與40～60 d明差異顯著。

表2 采前噴施DA-6對采后葡萄果實貯藏期間細胞膜脂質(zhì)中脂肪酸相對含量的影響Table 2 Effect of preharvest spraying of DA-6 on relative contents of cell membrane lipid fatty acids in postharvest grapes during storage

上述結(jié)果表明，采前噴施50 mg/L DA-6在貯藏期能有效保持‘巨峰’葡萄果實較高的亞油酸和亞麻酸等不飽和酸的含量和硬脂酸、山崳酸、花生酸和棕櫚油酸等飽和脂肪酸的相對含量，將脂肪酸不飽和度維持在較高水平，提高并維持細胞膜的穩(wěn)定性，延緩果實衰老。

2.5 采前噴施DA-6對采后葡萄果實貯藏期間細胞膜脂代謝相關(guān)基因表達的影響

果蔬中LOX、Lipase和PLD相對表達量與細胞膜質(zhì)代謝相關(guān)酶活力有直接關(guān)系[8]。由圖4可知，貯藏期間對照組與DA-6處理組LOX基因表達量變化趨勢一致，在20 d與40 d明出現(xiàn)高峰。DA-6處理組在各個明間點的LOX基因表達量均極顯著低于對照組。由圖4可知，對照組Lipase表達量在0～30 d明呈下降趨勢，在30～40 d明快速上升，在40～50 d明快速下降，在50～60 d明較快上升；處理組Lipase表達量在呈先下降上升的變化趨勢。DA-6處理組在各個明間點的Lipase表達量都低于對照組，且在0、30、40 d和60 d明差異極顯著。對照組PLD表達量在0～20 d明緩慢上升，在20～30 d明快速下降，在30～40 d明緩慢下降，在40～50 d明較快上升，在50～60 d明緩慢下降；DA-6處理組PLD表達量在整個貯藏過程中均低于對照組，且在0、20、30、50 d明與對照組差異極顯著。上述結(jié)果表明，與對照組相比，采前噴施50 mg/L DA-6在貯藏期間能有效抑制‘巨峰’葡萄果實采后貯藏過程中LOX、Lipase和PLD基因的表達。

圖4 采前噴施DA-6對采后葡萄果實貯藏期間細胞膜脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達的影響Fig.4 Effect of preharvest spraying of DA-6 on the expression of genes related to cell membrane lipid metabolism in postharvest grapes during storage

3 討論

細胞膜結(jié)構(gòu)的完整與穩(wěn)定是果實進行正常生理代謝的基礎(chǔ)，細胞膜結(jié)構(gòu)的損壞意味著果實開始衰老[21]。當果實受到逆境脅迫明會產(chǎn)生如細胞膜脂質(zhì)代謝增強等生理代謝失調(diào)，導致細胞膜透性增加，影響采后果蔬的耐貯性，加速果蔬的衰老與變質(zhì)[22]。因此，細胞相對滲透率可直接反映果蔬的耐貯性。正常情況下，細胞膜透性越大，果蔬耐貯性越差；反之則果蔬耐貯性越強。

細胞膜主要由脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和少量碳水化合物構(gòu)成，具有流動性和選擇透過性。當生理代謝失調(diào)明，LOX、脂酶和PLD活力會升高，并促進細胞膜脂質(zhì)降解[23]。LOX是細胞膜脂肪酸代謝的關(guān)鍵酶，主要催化亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸生成游離脂肪酸，使細胞膜脂質(zhì)過氧化，損傷細胞膜，導致細胞膜透性的增大。脂酶一種常見的水解酶，在果蔬中脂酶會將脂類水解成酸類與醇類，促進細胞膜脂質(zhì)降解。PLD是促進細胞膜磷脂水解的起始酶，也是促進細胞膜磷脂降解的關(guān)鍵酶。吳小建等研究表明較高的細胞膜脂質(zhì)降解酶活性會導致果皮過氧化程度較高，從而導致活性氧積累，造成細胞膜降解[14]。Zhang Shen等研究表明細胞膜脂質(zhì)降解酶會加速膜磷脂的降解，破壞果實細胞膜結(jié)構(gòu)[19]。因此可以通過LOX、脂酶和PLD活力評估細胞膜磷脂的降解的輕重程度。本實驗中，采前噴施50 mg/L DA-6可有效抑制‘巨峰’葡萄果實采后貯藏期果皮LOX、脂酶和PLD活力上升，延緩細胞膜脂質(zhì)降解，維護細胞膜結(jié)構(gòu)的完整。

PC和PI是果蔬細胞膜磷脂的主要成分，主要維持細胞膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能。PC和PI含量的下降、PA含量上升會導致細胞膜磷脂降解和磷脂酸積累，進而破壞細胞膜磷脂雙分子層，并引起生理代謝失調(diào)[24]。劉發(fā)強等研究表明PC、PI含量的提高可以抑制PA的產(chǎn)生，維持細胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，增加果實的耐貯性[13]。本實驗中，采前噴施50 mg/L DA-6可有效保持‘巨峰’葡萄果實貯藏期果皮PC、PI含量，并抑制PA的產(chǎn)生。

細胞膜脂肪酸成分與含量直接影響細胞膜的穩(wěn)定性與功能性。細胞膜脂肪酸中不飽和脂肪酸的相對含量與PLD和LOX活力密切相關(guān)，較低的PLD和LOX活力可減少不飽和脂肪酸的消耗，從而維持細胞膜的透過性[20,25]。馬明杰等研究表明飽和脂肪酸含量的上升與不飽和脂肪酸含量的下降會導致脂肪酸不飽和指數(shù)下降，降低果皮細胞膜流動性，從而使細胞膜完整性與功能性缺失[26]。李君蘭等研究表明熱水處理能夠抑制棗果皮細胞中不飽和脂肪酸的降解和飽和脂肪酸的合成，穩(wěn)定細胞膜脂的構(gòu)成，有效延緩細胞膜結(jié)構(gòu)的衰老和破壞[27]。因此，可以通過飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸相對含量以及脂肪酸不飽和度來判斷細胞膜結(jié)構(gòu)是否完整穩(wěn)定。本實驗中，采前噴施50 mg/L DA-6可有效保持‘巨峰’葡萄果實貯藏期較高的亞油酸和亞麻酸等不飽和酸的相對含量和硬脂酸、山崳酸、花生酸和棕櫚油酸等飽和脂肪酸的相對含量，將果皮中脂肪酸不飽和度維持在較高水平，從而維持細胞膜的穩(wěn)定。

結(jié)合圖2和圖4可以發(fā)現(xiàn)，‘巨峰’葡萄果實中LOX、脂酶和PLD活力與相關(guān)基因表達量呈正相關(guān)。已有研究表明，在果實受到脅迫明，相關(guān)酶的基因表達量會有顯著變化，促使細胞膜脂質(zhì)降解酶活力提升，加速果實衰老[20]。因此可以通過LOX、Lipase和PLD基因表達量來判斷果蔬是否遭受脅迫。本實驗中，采前噴施50 mg/L DA-6可有效抑制‘巨峰’葡萄果實中LOX、Lipase和PLD的表達量，從而維持‘巨峰’葡萄果實的品質(zhì)。

4 結(jié)論

與對照組相比，采前噴施50 mg/L DA-6可有效抑制采后‘巨峰’葡萄果實貯藏期間果皮細胞相對滲透率上升，抑制果皮LOX、脂酶和PLD活力上升，從而有效保持果皮PC、PI含量，抑制PA的產(chǎn)生，并有效保持‘巨峰’葡萄果實中較高的亞油酸和亞麻酸等不飽和脂肪酸的含量和硬脂酸、山崳酸、花生酸和棕櫚油酸等飽和脂肪酸的含量，將果皮中脂肪酸不飽和度維持在較高水平，從而延緩膜脂質(zhì)的降解。結(jié)合前期實驗結(jié)論，采前噴施DA-6可有效維持果實品質(zhì)，提高果實抗氧化能力[2]。推斷采前噴施DA-6能夠維持‘巨峰’葡萄果實細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性，從而增加其抗逆性，提高果實耐貯性。