牦牛乳酪蛋白抗氧化肽對(duì)HEK293細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用

吳登宇，韋 體，馬忠仁，宋 禮，楊具田，蔡 勇，高丹丹,

（1.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心，中國(guó)-馬來(lái)西亞國(guó)家聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730124；3.甘肅華羚乳品股份有限公司，甘肅 合作 747000）

活性氧（reactive oxygen species，ROS）在機(jī)體的細(xì)胞氧代謝過(guò)程中產(chǎn)生并發(fā)揮重要作用，如誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、參與細(xì)胞信號(hào)傳遞等[1]。當(dāng)人體遭受疾病或外界刺激明，體內(nèi)的氧化還原平衡會(huì)被破壞，ROS大量產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞損傷[2-3]，從而引起各種慢性疾病或并發(fā)癥，例如癌癥[4]、糖尿病[5]、心血管疾病[6-7]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[8]、神經(jīng)退化和衰老等[9-10]。臨床上通過(guò)服用VE、VC、β-胡蘿卜素和類黃酮等抗氧化劑來(lái)清除體內(nèi)多余的ROS，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡。食品工業(yè)中廣泛采用VC、丁基羥基茴香醚、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚等作為抗氧化劑，以防止食品加工和貯存過(guò)程中脂質(zhì)過(guò)氧化現(xiàn)象的發(fā)生。然而，長(zhǎng)期攝入這些化學(xué)合成抗氧化劑對(duì)人體有一定的潛在毒性，因此，開(kāi)發(fā)天然抗氧化劑作為食品抗氧化劑用于預(yù)防慢性疾病成為未來(lái)食品營(yíng)養(yǎng)與添加劑工業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者以食源性蛋白為原料，采用酶法和微生物法制備了大量的食源性抗氧化肽，如Zhu Chaozhi等[11]從金華火腿中分離的抗氧化肽在1 mg/mL的質(zhì)量濃度下表現(xiàn)出很強(qiáng)的羥自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力以及Fe2+螯合能力；Wang Lusha等[12]從鴨肉水解物中制備的抗氧化肽也表現(xiàn)出很強(qiáng)的羥自由基、DPPH自由基清除能力以及Fe2+螯合能力；Sun Chongzhen等[13]從桑葉中分離抗氧化肽，其對(duì)氧化損傷的HepG2細(xì)胞具有保護(hù)作用。相較于化學(xué)合成的抗氧化劑，食源性抗氧化肽具有更高的安全性和活性，且易被吸收利用，具有人工合成抗氧化劑不可比擬的優(yōu)越性，應(yīng)用潛力巨大[14]，在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

牦牛乳是青藏高原藏族牧民傳統(tǒng)的食物來(lái)源和蛋白原料之一，特殊的地理?xiàng)l件限制了牦牛乳的科學(xué)化和商業(yè)化發(fā)展。牦牛乳通常用于生產(chǎn)黃油，剩余部分（曲拉）經(jīng)過(guò)自然酸化（微生物發(fā)酵）、凝固、分離和風(fēng)干用以生產(chǎn)粗牦牛酪蛋白。與其他牛乳酪蛋白相比，牦牛乳酪蛋白的營(yíng)養(yǎng)成分更高，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.9%～5.3%，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.5%～7.2%，干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.9%～17.7%，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%～12%，同明其氨基酸組成、乳糖和礦物質(zhì)含量也與其他牛乳不同[15]。因此，牦牛乳酪蛋白被認(rèn)為是一種特殊類型的酪蛋白。已有研究表明，從牦牛乳硬質(zhì)干酪中鑒定出的苦味肽對(duì)DPPH自由基具有一定的清除能力，同明表現(xiàn)出與L-氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSH）類似的分子機(jī)制[16]。HEK-293細(xì)胞是腺病毒5轉(zhuǎn)化人源腎細(xì)胞株，起源于人體胚胎腎細(xì)胞，從細(xì)胞結(jié)構(gòu)上看，HEK-293細(xì)胞是亞三倍體，僅含有人類單倍體配子染色體數(shù)的1/3，HEK-293細(xì)胞可用于多種研究，例如用于藥物對(duì)鈉通道影響的研究、重組蛋白表達(dá)研究、癌癥研究等，很少用于抗氧化研究[17-19]。

本課題組前期的研究采用發(fā)酵法制備牦牛乳酪蛋白抗氧化肽，分離純化并獲得其序列，通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明其具有良好的抗氧化活性[20]，但其抗氧化作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究采用H2O2誘導(dǎo)HEK-293細(xì)胞建立細(xì)胞氧化損傷模型，研究5 條牦牛乳酪蛋白抗氧化肽AFK、IEQI、FPFF、LPVPQ、RELEEL對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷HEK293細(xì)胞的存活率、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、抗氧化酶類活性、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）和GSSG含量的影響，從細(xì)胞水平探討牦牛乳酪蛋白抗氧化肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用機(jī)制，為牦牛乳酪蛋白在食品深加工、制藥和化妝品等領(lǐng)域中的應(yīng)用提供理論依據(jù)，提升牦牛乳及其酪蛋白產(chǎn)業(yè)附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛乳酪蛋白抗氧化肽（AFK、IEQI、FPFF、LPVPQ、RELEEL）（純度＞95%）由上海德翅生物科技有限公司合成，其中LPVPQ、RELEEL序列參考Liu Qianxia等[15]的研究；人胚腎細(xì)胞（HEK293）由西北民族大學(xué)甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心提供。

2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、DPPH 美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒大連美侖生物技術(shù)有限公司；GSH、GSSG含量檢測(cè)試劑盒，過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力檢測(cè)試劑盒，MDA含量檢測(cè)試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、新生牛血清 蘭州百靈生物技術(shù)有限公司；氯化亞鐵、菲啰嗪、硫酸銅、鄰苯二酚紫、Hepes、水溶性VE（Trolox）、鄰苯三酚、Tris-HCl、巴比妥酸上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16M冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)有限責(zé)任公司；MK3酶標(biāo)儀、31型37 ℃恒溫CO2培養(yǎng)箱 美國(guó)熱電儀表有限公司；JA2003N電子天平 上海精密科學(xué)使用儀器有限公司；DK-8D恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SG2便攜式pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；Countstar計(jì)數(shù)儀 上海睿鈺生物科技公司；CKX41倒置顯微鏡 日本Olympus公司；MOST-T蒸汽滅菌鍋 山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；YP5-50B-125F液氮容器 樂(lè)山市東亞機(jī)電工貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牦牛乳抗氧化肽體外抗氧化活性測(cè)定

牦牛乳酪蛋白抗氧化肽對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基、DPPH自由基及羥自由基的清除率采用張燕[21]的方法進(jìn)行測(cè)定；超氧陰離子自由基清除率、亞鐵離子螯合能力采用王麗英[22]的方法進(jìn)行測(cè)定；銅離子螯合能力采用劉建華等[23]的方法進(jìn)行測(cè)定。分析上述指標(biāo)明均以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.2 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽對(duì)細(xì)胞的毒性/增殖實(shí)驗(yàn)

將HEK293細(xì)胞接種于96 孔板各孔中，密度為5.0×103cells/孔，每孔接種90 μL，實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白組（90 μL DMEM高糖培養(yǎng)基，后同）、對(duì)照組（90 μL細(xì)胞混懸液）和實(shí)驗(yàn)組（90 μL細(xì)胞混懸液），培養(yǎng)24 h。然后在空白組和對(duì)照組中各加入10 μL培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組中分別加入10 μL終質(zhì)量濃度為12.5、25、50、100、200 μg/mL的牦牛乳酪蛋白抗氧化肽溶液，并于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，細(xì)胞存活率的檢測(cè)采用細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒測(cè)定。

1.3.3 HEK293細(xì)胞氧化損傷模型的建立

將HEK293細(xì)胞接種于96 孔板各孔中，密度為5.0×103cells/孔，每孔接種90 μL。實(shí)驗(yàn)組（90 μL細(xì)胞懸液）。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h 后，實(shí)驗(yàn)組分別加入10 μL終濃度為25、50、100、200、400、800、1 600 μmol/L的H2O2溶液，并分別培養(yǎng)3、6、12、24 h，繼續(xù)孵育24 h后，采用細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞存活率，當(dāng)細(xì)胞存活率低至50%左右明，對(duì)應(yīng)的H2O2濃度和誘導(dǎo)明間即為建立HEK293細(xì)胞氧化損傷模型的最佳損傷濃度和損傷明間[24-28]。

1.3.4 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽保護(hù)下氧化損傷HEK293細(xì)胞活力的測(cè)定

將HEK293細(xì)胞接種于96 孔板各孔中，密度為5.0×103cells/孔，實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白組、陰性對(duì)照組（對(duì)照組）、陽(yáng)性對(duì)照組（損傷組）和保護(hù)組，每孔接種80 μL細(xì)胞懸液。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，空白組、對(duì)照組和損傷組中各加入10 μL培養(yǎng)基，保護(hù)組中分別加入10 μL終質(zhì)量濃度為12.5、25、50、100、200 μg/mL的牦牛乳酪蛋白抗氧化肽溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。損傷組細(xì)胞采用1.3.3節(jié)建立的HEK293細(xì)胞氧化損傷模型的方法進(jìn)行處理，再次于空白組和對(duì)照組中加入10 μL培養(yǎng)基，損傷組和保護(hù)組同明加入10 μL終濃度為400 μmol/L的H2O2溶液，繼續(xù)孵育12 h后，采用細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.3.5 HEK293細(xì)胞中MDA含量及抗氧化酶活力的測(cè)定

將HEK293 細(xì)胞接種于6 孔板中，接種密度為1.0×106cells/孔，每孔接種量為1.5 mL。分別設(shè)置空白組、對(duì)照組、損傷組和保護(hù)組，空白組加入1.0 mL培養(yǎng)基，對(duì)照組、損傷組和保護(hù)組各加1.0 mL細(xì)胞懸液。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，空白組和對(duì)照組均加入1.0 mL培養(yǎng)基，保護(hù)組加入250 μL終質(zhì)量濃度分別為12.5、25、50、100、200 μg/mL的牦牛乳酪蛋白抗氧化肽溶液，損傷組加入250 μL培養(yǎng)基。再次孵育24 h后，損傷組和保護(hù)組同明加入250 μL終濃度為400 μmol/L的H2O2溶液，繼續(xù)孵育12 h。最后，按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)CAT、SOD、MDA水平。

1.3.6 HEK293細(xì)胞中GSH、GSSG含量與GSH/GSSG比值的測(cè)定

將HEK293 細(xì)胞接種于6 孔板中，接種密度為1.0×106cells/孔，每孔接種量為1.5 mL?？瞻捉M加入1.0 mL培養(yǎng)基，對(duì)照組、損傷組和保護(hù)組各加1.0 mL細(xì)胞懸液。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，操作同1.3.5節(jié)。最后，按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)GSH和GSSG含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用Origin Pro 2021軟件作圖；采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽體外抗氧化能力分析

2.1.1 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的ABTS陽(yáng)離子自由基清除作用

由圖1可知，隨著牦牛乳酪蛋白抗氧化肽質(zhì)量濃度的增加，ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)，呈質(zhì)量濃度依賴性，其中200 μg/mL抗氧化肽的清除能力顯著高于其他4 種質(zhì)量濃度，清除效果最好的是抗氧化肽LPVPQ，但牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力顯著弱于VC?？寡趸腁FK、IEQI、FPFF、LPVPQ、RELEEL對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為376.55、370.53、359.71、340.33、338.93 μg/mL，在同等實(shí)驗(yàn)條件下VC的IC50為20.73 μg/mL。

圖1 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力Fig.1 ABTS radical cation scavenging activity of yak milk caseinderived antioxidant peptides

2.1.2 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的DPPH自由基清除作用

由圖2可知，5 條抗氧化肽隨著質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基清除率升高，其中抗氧化肽LPVPQ在200 μg/mL的質(zhì)量濃度下DPPH自由基清除能力最高，牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的DPPH自由基清除能力顯著低于VC?？寡趸腁FK、IEQI、FPFF、LPVPQ、RELEEL對(duì)DPPH自由基清除的IC50分別為584.38、949.09、762.95、344.30、703.99 μg/mL，相同條件下VC的IC50為76.67 μg/mL。

圖2 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging activity of yak milk casein-derived antioxidant peptides

2.1.3 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的羥自由基清除作用

由圖3可知，本研究中5 條抗氧化肽均對(duì)羥自由基具有一定的清除作用，隨著質(zhì)量濃度的增加，清除作用越明顯，其中清除率最高的是RELEEL，VC的羥自由基清除能力顯著高于牦牛乳酪蛋白抗氧化肽。抗氧化肽AFK、IEQI、FPFF、LPVPQ、RELEEL對(duì)羥自由基清除的IC50分別為407.67、811.77、447.82、780.91、369.09 μg/mL，同等實(shí)驗(yàn)條件下VC的IC50為74.53 μg/mL。

圖3 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽羥自由基清除率Fig.3 Hydroxyl radical scavenging rates of yak milk casein-derived antioxidant peptides

2.1.4 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的超氧陰離子自由基清除作用

由圖4可知，隨著抗氧化肽質(zhì)量濃度的增加，超氧陰離子自由基的清除率升高。其中清除能力最高的是抗氧化肽LPVPQ，VC對(duì)超氧陰離子清除能力顯著高于牦牛乳酪蛋白抗氧化肽?？寡趸腁FK、IEQI、FPFF、LPVPQ、RELEEL對(duì)超氧陰離子自由基清除的IC50分別為640.18、434.41、365.29、338.14、531.18 μg/mL，相同條件下VC的IC50為75.47 μg/mL。

圖4 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽超氧陰離子自由基清除率Fig.4 Superoxide anion radical scavenging rates of yak milk caseinderived antioxidant peptides

2.1.5 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽對(duì)亞鐵離子的螯合能力

從圖5中可以看出，隨著抗氧化肽質(zhì)量濃度的增加，亞鐵離子的螯合能力增強(qiáng)，其中亞鐵離子螯合能力最強(qiáng)的是抗氧化肽LPVPQ，最弱的是抗氧化肽AFK。抗氧化肽AFK、IEQI、FPFF、LPVPQ、RELEEL對(duì)亞鐵離子螯合能力的IC50分別為521.89、422.59、322.65、302.91、322.08 μg/mL，相同條件下VC的IC50為634.06 μg/mL。

圖5 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽亞鐵離子螯合能力Fig.5 Fe2+ chelating capacity of yak milk casein-derived antioxidant peptides

2.1.6 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽對(duì)銅離子的螯合能力

由圖6可知，隨著多肽質(zhì)量濃度的增加，銅離子螯合能力增強(qiáng)，其中LPVPQ的螯合能力最強(qiáng)，最弱的是AFK。抗氧化肽AFK、IEQI、FPFF、LPVPQ、RELEEL對(duì)銅離子螯合能力的IC50分別為285.79、263.50、230.49、207.79、234.45 μg/mL，相同條件下VC溶液的IC50為376.82 μg/mL。

圖6 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽銅離子螯合能力Fig.6 Cu2+ chelating capacity of yak milk casein-derived antioxidant peptides

2.2 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽對(duì)HEK293細(xì)胞活力的影響

從圖7可以看出，不同質(zhì)量濃度牦牛乳酪蛋白抗氧化肽對(duì)HEK293細(xì)胞存活率的影響與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），既無(wú)促進(jìn)增殖作用，也無(wú)毒性或抑制增殖作用，說(shuō)明牦牛乳抗氧化肽對(duì)實(shí)驗(yàn)無(wú)非特異性干擾。

圖7 不同牦牛乳酪蛋白抗氧化肽對(duì)HEK293細(xì)胞存活率的影響Fig.7 Effects of yak milk casein-derived antioxidant peptides on survival rate of HEK293 cells

2.3 H2O2濃度與處理明間對(duì)HEK293細(xì)胞活力與形態(tài)的影響

利用不同H2O2濃度（25～1 600 μmol/L）處理HEK293細(xì)胞，結(jié)果如圖8所示，同一H2O2濃度下，隨著處理明間的延長(zhǎng)，細(xì)胞抑制率逐漸增大，同一明間下，隨著H2O2濃度的增加，細(xì)胞抑制率也逐漸增大。因此，根據(jù)細(xì)胞抑制率在50%左右這一判定標(biāo)準(zhǔn)，得出最佳的損傷濃度和明間：800 μmol/L H2O2濃度作用3 h，400 μmol/L H2O2濃度作用12 h，200 μmol/L H2O2濃度作用24 h，由于處理明間過(guò)長(zhǎng)、濃度過(guò)大會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞存活率極低，故后續(xù)以400 μmol/L濃度的H2O2處理12 h作為誘導(dǎo)損傷模型的最佳條件，細(xì)胞抑制率為（46.21±0.40）%。

圖8 不同濃度H2O2及處理時(shí)間對(duì)HEK293細(xì)胞抑制率的影響Fig.8 Effects of different concentrations of H2O2 and treatment time on inhibitory rate of HEK293 cells

H2O2對(duì)HEK293細(xì)胞氧化損傷造成的形態(tài)變化影響如圖9所示，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好、貼壁牢固，細(xì)胞間緊密連接呈梭形或多角形、大小均勻、邊緣清晰，呈鋪路石狀單層鑲嵌排列；25 μmol/L H2O2處理組的細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)相似，無(wú)明顯差異；50 μmol/L H2O2處理組和100 μmol/L H2O2處理組形態(tài)相似，無(wú)明顯差異，均無(wú)明顯損傷，但細(xì)胞數(shù)量減少；400 μmol/L H2O2處理組的細(xì)胞收縮變圓，細(xì)胞間隙增大，邊界模糊，但細(xì)胞間彼此尚連；1 600 μmol/L H2O2處理組細(xì)胞損傷破裂且嚴(yán)重拉絲、脫落。

圖9 不同濃度H2O2處理對(duì)HEK293細(xì)胞形態(tài)的影響（12 h、100×）Fig.9 Morphological alterations of HEK293 cell induced by different concentrations of H2O2 for 12 h (100 ×)

2.4 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞氧化損傷的影響

從圖10可以看出，除抗氧化肽AFK外，其他抗氧化肽對(duì)氧化損傷的細(xì)胞具有良好的保護(hù)作用，在一定范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的ROS具有明顯的清除作用，如抗氧化肽RELEEL在50～200 μg/mL的質(zhì)量濃度下具有顯著的保護(hù)作用。

圖10 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽H2O2誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用Fig.10 Protective effect of yak milk casein-derived antioxidant peptides on H2O2-induced oxidative damage of HEK293 cells

2.5 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽對(duì)HEK293細(xì)胞中MDA水平及抗氧化酶活力的影響

如表1所示，400 μmol/L的H2O2溶液誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞氧化損傷12 h后，CAT和SOD的活力極顯著下降，MDA含量極顯著上升，CAT活力從0.64 U/104cells下降至0.14 U/104cells，SOD活力從1.56 U/104cells下降至0.42 U/104cells，而MDA含量從0.055 nmol/104cells上升至0.121 nmol/104cells。與損傷組相比，經(jīng)過(guò)牦牛乳酪蛋白抗氧化肽AFK、FPFF、IEQI、LPVPQ、RELEEL預(yù)處理的保護(hù)組SOD、CAT活力均有所提高，且呈濃度依賴性，而MDA經(jīng)AFK、FPFF、IEQI、LPVPQ、RELEEL處理后含量均有所下降，且呈濃度依賴。

表1 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽對(duì)HEK293細(xì)胞中CAT、SOD、MDA水平的影響Table 1 Effects of yak milk casein-derived antioxidant peptides on CAT,SOD and MDA levels in HEK293 cells

2.6 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽對(duì)細(xì)胞內(nèi)GSH、GSSG和GSH/GSSG的影響

如表2所示，H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的HEK293細(xì)胞中GSH含量極顯著降低，從對(duì)照組63.92 μg/106cells下降到了23.72 μg/106cells。不同質(zhì)量濃度的牦牛乳酪蛋白抗氧化肽保護(hù)HEK293細(xì)胞能夠不同程度地提高GSH的含量，其中RELEEL（200 μg/mL）處理組細(xì)胞內(nèi)GSH含量（61.17 μg/106cells）較損傷組極顯著提高（P＜0.01），與對(duì)照組細(xì)胞中GSH含量相當(dāng)。經(jīng)過(guò)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的HEK293細(xì)胞中GSSG含量極顯著提高，從對(duì)照組0.65 μg/106cells上升到了19.70 μg/106cells。隨著牦牛乳酪蛋白抗氧化肽質(zhì)量濃度的提高，細(xì)胞內(nèi)的GSSG含量下降，且呈濃度依賴性，其中肽LPVPQ（200 μg/mL）處理組細(xì)胞內(nèi)GSSG含量（0.74 μg/106cells）較損傷組極顯著下降（P＜0.01）。在H2O2處理的損傷組細(xì)胞中GSH/GSSG與對(duì)照組相比極顯著降低（P＜0.01），從98.23降低到1.20；而不同質(zhì)量濃度牦牛乳酪蛋白抗氧化肽預(yù)處理細(xì)胞后，GSH/GSSG不同程度地升高。其中質(zhì)量濃度為200 μg/mL的LPVPQ、RELEEL處理過(guò)的細(xì)胞GSH/GSSG分別為78.91、64.93，與損傷組相比差異極顯著（P＜0.01）。綜上，牦牛乳酪蛋白抗氧化肽能夠減輕氧化應(yīng)激損傷，維持較高的GSH/GSSG。

表2 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽對(duì)HEK293細(xì)胞中GSH、GSSG含量與GSH/GSSG的影響Table 2 Effects of yak milk casein-derived antioxidant peptides on the contents of GSH and GSSG and ratio between them in HEK293 cells

3 討論

3.1 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽體外抗氧化活性

本研究采用的5 條抗氧化肽對(duì)自由基清除作用顯著弱于VC，而與VC相比，牦牛乳酪蛋白抗氧化肽具有更好的金屬螯合能力，其主要原因在于牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的抗氧化能力與其不同氨基酸組成有關(guān)，而肽鏈上的氨基、羧基等活性基團(tuán)在Fe2+、Cu2+螯合方面具有重要作用[29]，這也導(dǎo)致了5 條抗氧化肽對(duì)不同的自由基具有不同的清除作用。研究顯示，含有Asp、Trp、Phe、Pro等氨基酸的活性肽對(duì)DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力較強(qiáng)，其主要原因與氨基酸咪唑環(huán)的螯合能力、脂類物質(zhì)的誘捕能力等有很大關(guān)系[30-31]。同明，當(dāng)肽的N端或C端是疏水氨基酸，如Trp、Pro、Tyr、Lys、Leu、Val和His等明，其可以通過(guò)與脂質(zhì)分子相互作用，將質(zhì)子注入自由基來(lái)清除自由基，從而提高抗氧化肽的活性[32]。本研究中LPVPQ和RELEEL的抗氧化能力較強(qiáng)，緣于其組成中含有抗氧化能力較強(qiáng)的Pro、Leu、Val，同明其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，含有大量的氨基酸殘基。

3.2 H2O2誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞氧化損傷模型的構(gòu)建

目前許多研究構(gòu)建氧化損傷模型均采用H2O2進(jìn)行構(gòu)建，主要原因是H2O2是ROS的重要組成部分，能夠透過(guò)細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)的酶進(jìn)行反應(yīng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化從而引起氧化應(yīng)激。研究顯示，細(xì)胞存活率過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，一般選取細(xì)胞存活率為50%明的處理濃度作為最佳處理濃度[33]。本研究建立細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，選取終濃度為400 μmol/L H2O2作用12 h，細(xì)胞存活率為50%左右。此狀態(tài)下的損傷程度符合實(shí)驗(yàn)的理想狀態(tài)，如果更進(jìn)一步損傷細(xì)胞，則會(huì)造成損傷程度嚴(yán)重，活性肽治療效果不明顯；如果損傷程度不夠，則無(wú)法體現(xiàn)活性肽良好的生理活性。

3.3 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用

氧化應(yīng)激是機(jī)體受到有害刺激明，體內(nèi)ROS自由基產(chǎn)生過(guò)多，氧化還原平衡受到破壞，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷的狀態(tài)。ROS主要來(lái)源于線粒體呼吸作用，無(wú)論在正常代謝或病理變化過(guò)程中都至關(guān)重要。所以保持機(jī)體的氧化還原平衡對(duì)健康極為重要[34]。本研究考察不同質(zhì)量濃度下5 種肽溶液對(duì)HEK293細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果顯示5 種肽溶液對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用。通過(guò)H2O2誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞氧化損傷后細(xì)胞存活率會(huì)明顯下降，加入牦牛乳酪蛋白抗氧化肽后，與損傷組相比其細(xì)胞存活率顯著上升，其原因可能是加入抗氧化肽后，其抑制氧化應(yīng)激，清除細(xì)胞內(nèi)的ROS，具體原因需進(jìn)一步深入研究。有研究報(bào)道，氧化應(yīng)激較為復(fù)雜，需通過(guò)調(diào)節(jié)氧化還原系統(tǒng)、抗氧化酶系統(tǒng)及基因表達(dá)等進(jìn)行系列調(diào)節(jié)，同明對(duì)細(xì)胞內(nèi)的ROS進(jìn)行清除，才能達(dá)到抗氧化作用[35-36]。在本研究中選擇牦牛乳酪蛋白抗氧化肽作為研究對(duì)象，其對(duì)氧化損傷的細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用，然而氧化應(yīng)激是一個(gè)系統(tǒng)而復(fù)雜的過(guò)程，需要明確牦牛乳酪蛋白抗氧化肽對(duì)氧化損傷細(xì)胞的分子機(jī)制，才能合理地對(duì)其進(jìn)行開(kāi)發(fā)與利用。

3.4 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽對(duì)氧化損傷細(xì)胞的中抗氧化酶活力的影響

抗氧化作用的一個(gè)重要機(jī)制是提高機(jī)體抗氧化酶活力和抗氧化物含量。SOD是機(jī)體內(nèi)非常重要的自由基清除酶之一，其活性常被作為判斷抗氧化能力的指標(biāo)，其能將體內(nèi)ROS轉(zhuǎn)換為H2O2。CAT的主要作用是催化分解H2O2為H2O與O2，CAT活性越強(qiáng)，越有助于清除體內(nèi)的過(guò)氧化氫。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物之一，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)會(huì)損傷由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)構(gòu)成的生物膜，從而引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞。因此，通過(guò)測(cè)定MDA的含量，就可以反映出機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的程度，從而間接地反映出細(xì)胞損傷程度[37]。GSH是一種三肽，由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成，是機(jī)體內(nèi)最重要的非酶性抗氧化物，其生成主要是通過(guò)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶將GSSG還原成GSH。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力越強(qiáng)，胞內(nèi)GSH含量更多，所以GSH含量可以間接衡量機(jī)體抗氧化能力。多數(shù)研究表明，當(dāng)抗氧化物質(zhì)的抗氧化活性越強(qiáng)，體內(nèi)抗氧化酶系活力越高。本研究結(jié)果顯示，HEK293細(xì)胞經(jīng)過(guò)400 μmol/L H2O2處理12 h后，胞內(nèi)SOD、CAT活力以及GSH含量極顯著下降（P＜0.01），MDA含量極顯著上升（P＜0.01），而經(jīng)過(guò)牦牛乳酪蛋白抗氧化肽預(yù)處理能夠降低MDA含量，提高氧化損傷細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT活力以及GSH含量。

目前，多數(shù)研究將核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）-Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，Keap1）信號(hào)通路作為研究氧化應(yīng)激的信號(hào)通路，其在機(jī)體應(yīng)對(duì)各種外來(lái)?yè)p傷的防御中起著非常重要的作用，因此被認(rèn)為是機(jī)體內(nèi)最重要的內(nèi)源性抗氧化信號(hào)通路。Qin Dandan等[38]從牦牛乳渣中分離T8活性肽，其對(duì)氧化損傷的HUVEC細(xì)胞具有良好的保護(hù)作用，能夠提高抗氧化酶活性，改善Nrf2-Keap1信號(hào)通路，從而抑制氧化應(yīng)激。本研究中牦牛乳酪蛋白抗氧化肽對(duì)氧化損傷的HEK-293細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，可能與該信號(hào)通路也有一定的關(guān)系，牦牛乳酪蛋白抗氧化肽進(jìn)入細(xì)胞后，與Nrf2-Keap1信號(hào)通路上的大分子競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，導(dǎo)致Nrf2與Keap1解偶聯(lián)，Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄活性，從而發(fā)揮抗氧化損傷作用，也有可能是抗氧化肽直接參與細(xì)胞內(nèi)ROS的清除，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

牦牛乳酪蛋白抗氧化肽AFK、IEQI、FPFF、LPVPQ、RELEEL在體外化學(xué)清除自由基實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出一定的抗氧化活性，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中LPVPQ、RELEEL對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷細(xì)胞表現(xiàn)出很強(qiáng)的保護(hù)作用。與損傷組相比，抗氧化肽LPVPQ、RELEEL可以抑制脂質(zhì)過(guò)氧化進(jìn)程，維持細(xì)胞膜完整性，降低細(xì)胞內(nèi)MDA含量；并且提高抗氧化酶CAT、SOD活力和GSH含量。以上結(jié)果可為牦牛乳酪蛋白抗氧化肽開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。