基于HPLC指紋圖譜的沙棘葉黃酮類功效成分研究△

王寧寧，高巖，張梅，溫秀鳳，盧順光，楊志剛*

1.蘭州大學 藥學院，甘肅 蘭州 730030；2.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193；3.水利部沙棘開發(fā)管理中心，北京 100058

沙棘為胡頹子科沙棘屬植物，近年來研究發(fā)現(xiàn)，其葉具有藥用價值及大健康產(chǎn)品開發(fā)潛力[1]。目前，沙棘葉已被批準為新資源食品[2]。沙棘葉中蛋白質類、氨基酸類、多糖類、有機酸類、黃酮類、萜類及微量元素等活性物質含量豐富[3]，尤其是具有抗炎、肝臟保護、抗氧化等活性的黃酮類功效成分含量顯著高于果實[4]。但大部分沙棘葉在收獲果實后被歸為農(nóng)業(yè)廢料，未得到合理利用[5]。沙棘葉富含黃酮醇苷，主要是異鼠李素和槲皮素衍生物[6]。張小民等[7]按照食品安全性毒理學評價程序和方法，對沙棘茶葉進行了急性毒性實驗，結果表明以沙棘茶葉提取物對小鼠經(jīng)口灌胃，半數(shù)致死量（LD50）>10 g·kg-1（以體質量計），屬無毒級物質，可作為安全的食品開發(fā)原料。沙棘有“天然營養(yǎng)庫”的美稱，其枝葉、果渣是優(yōu)良的畜禽補充飼料[8-9]。以沙棘葉為原料開發(fā)的沙棘葉茶產(chǎn)品相關研究也較多[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，沙棘葉和沙棘葉茶中總黃酮含量豐富，主要包含以異鼠李素、槲皮素、山柰素為母核的黃酮苷類和可水解鞣質等成分，并且具有較強的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性[11]。建立沙棘葉中黃酮類功效成分高效液相色譜法（HPLC）定性、定量分析方法，對沙棘葉及沙棘葉茶等相關產(chǎn)品的質量評價和質量控制具有積極意義。HPLC 等色譜指紋圖譜技術在藥品、食品質量評價和質量控制領域應用廣泛[12]。本研究建立了不同產(chǎn)地沙棘葉HPLC 指紋圖譜，采用聚類分析和主成分分析對不同產(chǎn)地沙棘葉質量進行評價，并測定了其中異鼠李素、槲皮素、山柰酚3 種黃酮類功效成分含量，以期為沙棘葉質量控制及其黃酮類功效成分產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 樣品

2018 年9 月采集15 批沙棘葉樣品，經(jīng)蘭州大學藥學院楊志剛教授鑒定為胡頹子科沙棘屬沙棘Hippophae rhamnoidesL.的葉，測試樣品標本保存于蘭州大學藥學院。樣品信息見表1。

表1 不同產(chǎn)地沙棘葉樣品信息

1.2 儀器

EasySep-3030型液相色譜儀（包括EasySep-3030型紫外檢測器、AS-2000 型自動進樣器、EasySep-3030 型二元泵，上海通微公司）；BSM220.4 型電子分析天平（上海卓精科技有限公司）；SB25-12D型超聲波儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.3 試藥

對照品異槲皮苷、水仙苷（純度≥98%，成都麥德生科技有限公司）；蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷（純度均≥98%，成都普菲德生物技術有限公司）；表沒食子兒茶素、表兒茶素、槲皮素、異鼠李素、山柰酚、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯（純度均≥98%，上海詩丹德生物科技有限公司）；沙棘寧B、英國櫟鞣花酸、木麻黃鞣寧為本課題組從沙棘葉中提取分離得到，純度均≥98%；色譜級乙腈、甲醇（德國默克公司）；其他試劑為分析純。

2 方法

2.1 指紋圖譜

供試品溶液的制備：稱取沙棘葉粉末約0.25 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲提取30 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

色譜條件：色譜柱為GS-120-5-C18-AP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.4%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～40.0 min，10%～20%A；40.1～50.0 min，20%～40%A；50.1～60.0 min，40%～80%A；60.1～73.0 min，100%～10%A）；進樣量為10 μL；流速為0.8 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長為280 nm。

2.2 含量測定

對照品溶液的制備：精密稱取槲皮素、山柰酚、異鼠李素對照品3.14、1.60、1.85 mg，分別加入甲醇配制成質量濃度為1.046 7、0.533 3、0.616 7 mg·mL-1的母液，之后用甲醇稀釋成梯度質量濃度的溶液，作為對照品溶液。

供試品溶液的制備：稱取沙棘葉樣品粉末約0.50 g，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，加熱回流30 min。精密量取續(xù)濾液25 mL，置具塞比色管中，加鹽酸3.5 mL，75 °C 水浴中加熱水解1 h，加甲醇定容至50 mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

色譜條件：色譜柱為GS-120-5-C18-AP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.1%甲酸水溶液（58∶42）；流速為1.0 mL·min-1；柱 溫為30 ℃；進樣量為10 μL；檢測波長為370 nm。

3 結果

3.1 指紋圖譜

3.1.1 方法學考察

3.1.1.1 精密度試驗 樣品S1按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣5 次，峰1 相對保留時間的RSD 為0.48%，相對峰面積的RSD為0.96%，表明儀器精密度良好。

3.1.1.2 穩(wěn)定性試驗 樣品S1 在貯存0、2、4、6、12、24 h 后按2.1 項下色譜條件進行分析，峰1 相對保留時間的RSD 為0.96%，相對峰面積的RSD 為4.68%，表明樣品溶液在24 h內較穩(wěn)定。

3.1.1.3 重復性試驗 樣品S1按2.1項下方法平行制備5 份，測定，峰1 相對保留時間RSD 為0.86%，相對峰面積的RSD 為0.40%，表明該方法重復性良好。

3.1.2 指紋圖譜 不同產(chǎn)地沙棘葉和對照品色譜圖見圖1。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版）軟件對15 批不同產(chǎn)地沙棘葉指紋圖譜進行相似度分析（表2），以樣品S1為參比樣品，不同產(chǎn)地沙棘葉相似度為0.647～0.910，13批樣品相似度均大于0.80，表明這些產(chǎn)地沙棘葉化學成分組成較為相似，產(chǎn)地因素對沙棘葉化學成分有一定影響；指紋圖譜共有26 個共有峰，以4 號峰為參比峰，以各共有峰對4 號峰的峰面積之比為相對峰面積，得到15 批樣品26 個色譜峰的標準化數(shù)據(jù)（表3）。通過和對照品tR比對共指認出9 個共有峰，其中4 號峰為英國櫟鞣花酸、13 號峰為沙棘寧B、14 號峰為木麻黃鞣寧、15 號峰為表兒茶素、17 號峰為表沒食子兒茶素、19 號峰為蘆丁、20號峰為異槲皮苷、21號峰為山柰酚-3-O-蕓香糖苷、22號峰為水仙苷。

圖1 沙棘葉和對照品HPLC圖

表2 不同產(chǎn)地沙棘葉樣品HPLC指紋圖譜相似度

表3 沙棘葉共有峰相對峰面積

3.2 聚類分析

聚類分析將15 批不同產(chǎn)地沙棘葉樣品聚為3 類（圖2）。其中，產(chǎn)地為新疆的樣品S5、S9、S11聚為一類；除S8 外，剩余樣品聚為一類，說明這些產(chǎn)地的沙棘葉質量較為接近，而新疆產(chǎn)地的沙棘葉與其他產(chǎn)地的沙棘葉化學成分差異較大。

圖2 不同產(chǎn)地沙棘葉聚類分析

3.3 主成分分析

將26 個共有峰峰面積導入SIMCA-P 14.1 軟件，對所有樣品進行主成分分析，除樣品S8 外，沙棘葉樣品被分為2 類（圖3），新疆產(chǎn)地樣品S15、S11 和S9 距離其他產(chǎn)地的樣品較遠，說明新疆產(chǎn)地的沙棘葉和其他產(chǎn)地沙棘葉成分差異較大，這與聚類分析結果一致。

圖3 不同產(chǎn)地沙棘葉主成分分析

3.4 含量測定

3.4.1 方法學考察

3.4.1.1 線性關系考察 按2.2 項下色譜條件進樣分析，以混合對照品不同質量濃度為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，計算回歸方程，見表4。

表4 槲皮素、山柰酚、異鼠李素的回歸方程、線性范圍和r

3.4.1.2 精密度試驗 樣品S1按2.2項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄相對保留時間和相對峰面積，槲皮素、山柰酚、異鼠李素相對保留時間的RSD 分別為0.93%、1.68%、1.89%，相對峰面積的RSD分別為2.60%、2.82%、3.36%，表明儀器的精密度良好。

3.4.1.3 穩(wěn)定性試驗 按2.2項下條件制備樣品S1供試品溶液，在0、2、4、6、12、24 h后進行分析，槲皮素、山柰酚、異鼠李素相對保留時間的RSD 分別為1.21%、1.80、0.33%，相對峰面積的RSD分別為2.04%、4.13%、3.22%，表明樣品在24 h內穩(wěn)定性良好。

3.4.1.4 重復性試驗 將樣品S1按2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，測定，槲皮素、山柰酚、異鼠李素相對保留時間的RSD分別為1.74%、1.30%、1.35%，相對峰面積的RSD 分別為1.39%、3.32%、2.03%，表明該方法的重復性較好。

3.4.1.5 加樣回收率試驗 稱取已知含量的沙棘葉粉末6份，每份約0.25 g，分別精密加入已知含量的異鼠李素、槲皮素、山柰酚對照品溶液，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.2 項下色譜條件測定，記錄峰面積并計算平均加樣回收率，結果顯示，槲皮素、山柰酚、異鼠李素的平均加樣回收率分別為106.40%、103.65%、106.37%，RSD分別為2.23%、2.21%、2.79%。

3.4.2 樣品測定 對不同產(chǎn)地沙棘葉中槲皮素、山柰酚、異鼠李素的含量進行測定，結果見表5。不同產(chǎn)地沙棘葉中槲皮素、山柰酚、異鼠李素的質量分數(shù)分別為0.12%～0.33%、0.07%～0.32%、0.10%～0.49%。甘肅產(chǎn)地槲皮素、山柰酚、異鼠李素的質量分數(shù)分別為0.18%～0.30%、0.13%～0.21%、0.16%～0.30%；山西產(chǎn)地槲皮素、山柰酚、異鼠李素的質量分數(shù)分別為0.12%～0.33%、0.09%～0.17%、0.10%～0.26%；新疆產(chǎn)地槲皮素、山柰酚、異鼠李素的質量分數(shù)分別為0.19%～0.27%、0.10%～0.15%、0.17%～0.49%。由此可知，產(chǎn)地對沙棘葉中槲皮素、山柰酚、異鼠李素含量影響較大，新疆生長的沙棘葉中異鼠李素含量較其他產(chǎn)地高，可能和其生長環(huán)境、采收時間等因素相關。

表5 不同產(chǎn)地沙棘葉中槲皮素、山柰酚和異鼠李素質量分數(shù)（,n=6） %

表5 不同產(chǎn)地沙棘葉中槲皮素、山柰酚和異鼠李素質量分數(shù)（,n=6） %

4 討論

本研究建立了不同產(chǎn)地沙棘葉的指紋圖譜，相似度及聚類分析結果表明，不同產(chǎn)地沙棘葉化學成分有一定差異。英國櫟鞣花酸、沙棘寧B 和木麻黃鞣寧3 種共有鞣質類成分具有較強的抗炎活性和抗肥胖活性[13]。表兒茶素、表沒食子兒茶素、水仙苷、蘆丁、異槲皮苷和山柰酚-3-O-蕓香糖苷具有體外降血糖活性[14]。對15批不同產(chǎn)地沙棘葉樣品中槲皮素、山柰酚、異鼠李素含量進行測定，結果表明，在不同產(chǎn)地樣品中這3 個黃酮類成分含量差異較大。山西忻州的樣品中槲皮素質量分數(shù)最高，為0.33%；內蒙古鄂爾多斯的山柰酚質量分數(shù)最高，為0.32%；新疆塔城樣品中異鼠李素質量分數(shù)最高，為0.49%。這可能和沙棘生長環(huán)境、采收時間等因素相關。建議將槲皮素、山柰酚和異鼠李素作為沙棘葉及其相關產(chǎn)品質量控制的指標成分。