正交法優(yōu)選巖痛方的提取工藝

林滿遍，劉湘杰，林群慧，黃俊偉，張雙勝，宋 煜*

（1.福州市中醫(yī)院，福建 福州 350001；2.江門市中心醫(yī)院，廣東 江門 529020；3.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122）

巖痛方為福州市中醫(yī)院腫瘤科臨床協(xié)定方，由延胡索、川烏、乳香、沒藥、姜黃、白芥子、石菖蒲、冰片組成，具有理氣止痛、化瘀消癥的功效，主要用于改善氣滯血瘀型癌癥患者的癌性疼痛。由于臨床應用此方時未經提取，直接將藥材磨粉加入植物油調成糊狀后敷于疼痛部位，有效成分的釋放較慢，且容易沾染衣物。為進一步提升巖痛方的藥效及使用便利性，本研究擬提取巖痛方藥效物質后制成外用膏貼，因此首先要優(yōu)選巖痛方的提取工藝。依據(jù)前期文獻調研，乳香、沒藥、石菖蒲、白芥子這4 味中藥具有活血行氣止痛的作用［1-3］，能有效緩解癌痛［4］，同時也具有一定的抗腫瘤活性［5-7］，揮發(fā)油是其主要有效成分；而延胡索、川烏、姜黃藥性味辛、溫，為中醫(yī)臨床癌痛治療的常用藥物，其主要活性成分分別為延胡索生物堿、烏頭生物堿、姜黃類化合物，多采用乙醇回流方式加以提?。?-13］。正交試驗設計是一種能夠減少實驗次數(shù)、縮短實驗周期的實驗方法，本研究采用正交試驗優(yōu)選乳香、沒藥、石菖蒲、白芥子的揮發(fā)油提取工藝，優(yōu)化延胡索、川烏、姜黃的醇提工藝條件，為進一步開發(fā)巖痛方的外用制劑提供實驗基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 SZCL-2A 電子恒溫電熱套（鞏義市英峪博研儀器設備廠）；揮發(fā)油提取器（天津玻璃儀器廠）；DFY-600 高速中藥粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；HH-S 電熱恒溫水浴鈉（上海錦屏儀器儀表有限公司）；e2695 型高效液相色譜儀（美國Water公司）。

1.2 試藥 乳香、沒藥、白菖蒲、白芥子、延胡索、川烏、姜黃等藥材均購自福州同春中藥有限公司，經福州市中醫(yī)院潘鴻貞主任中藥師鑒定為正品，所用藥材均符合2020 年版《中華人民共和國藥典》的規(guī)定；苯甲酰新烏頭原堿對照品、苯甲酰次烏頭原堿對照品均購自成都普思生物科技有限公司（批號：PS1132-0025、PS1134-0025）；延胡索乙素對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：Y21S7Y1709 1），以上對照品純度均≥98%；乙酸銨、乙腈均購自國藥集團化學試劑有限公司。

2 方法與結果

2.1 揮發(fā)油的提取及正交設計 參考文獻［14-15］采用水蒸氣蒸餾法提取藥材中的揮發(fā)油。按照處方量分別稱取乳香24 g，沒藥24 g，石菖蒲20 g，白芥子20 g，共計88 g，以藥材粉碎度（A）、浸泡時間（B）、加水量（C）和提取時間（D）為4 個實驗因素，每個因素設定3 個水平，設計L9（34）正交試驗表進行實驗，優(yōu)選最佳提取工藝。以揮發(fā)油體積數(shù)為評價指標，體積大者為佳。正交試驗因素水平設計見表1，揮發(fā)油提取工藝正交試驗設計結果見表2，方差分析結果見表3。從表2 可知，4 個因素對揮發(fā)油提取量影響程度排序為D＞C＞A＞B，再結合方差分析，可知D 為最主要影響因素，且對揮發(fā)油的提取率產生顯著影響，而A、B、C 影響均不顯著。提取時間越長，揮發(fā)油提取量越大，因而選擇了3 h 提取時間；加4 倍水與12 倍量水的提取量差異較小，為了節(jié)約成本選擇4 倍量的水。綜合以上分析并考慮生產效率等因素最佳提取工藝確定為：A2B2C1D3，即藥材粉碎過20 目篩，水中浸泡30 min，加水量4 倍，提取時間為3 h。

表1 正交試驗因素水平設計

表2 揮發(fā)油提取工藝正交試驗設計結果

表3 揮發(fā)油提取工藝方差分析結果

2.2 揮發(fā)油提取工藝驗證試驗 稱取處方量乳香、沒藥、石菖蒲與白芥子，按照優(yōu)化的提取工藝以水蒸氣蒸餾法提取3 次，分別提取了揮發(fā)油0.78、0.78、0.79 mL，所提取的揮發(fā)油量高于揮發(fā)油提取工藝正交試驗設計中的任一實驗組，此驗證試驗表明最佳提取工藝條件穩(wěn)定可行，且重復性良好。

2.3 醇提工藝考察

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil?C18高效液相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1 mol/L 乙酸銨溶液（B），梯度洗脫：0～23 min，27%A；23～33 min，27%～55%A；33～50 min，55%～90%A；流速1 mL/min；檢測波長：苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿為232 nm，延胡索乙素為280 nm；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

2.3.2 混合對照品溶液制備 分別精密稱取苯甲酰新烏頭原堿對照品10.2 mg、苯甲酰次烏頭原堿對照品10.1 mg 和延胡索乙素對照品10.2 mg，置10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻制成1.02、1.01、1.02 mg/mL 的含苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、延胡索乙素混合對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液制備 取正交試驗各方案所得到的乙醇回流提取液，抽濾，60 ℃減壓回收乙醇，收集藥液稱得質量M，然后精密稱取50% M 質量的藥液轉移至50 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3.4 標準曲線制備 精密吸取混合對照品溶液0.05、0.5、1.0、1.25、1.5、2.0 mL 置于5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋成不同質量濃度的系列混合對照品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，以苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、延胡索乙素的濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，計算回歸方程。各組分線性回歸方程結果見表4。

表4 醇提組分線性回歸方程

2.3.5 方法學考察

2.3.5.1 精密度試驗 精密量取混合對照品溶液1 mL，置于5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，連續(xù)進樣測定6 次，計算苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、延胡索乙素峰面積的RSD 分別為0.45%、0.95%、0.79%，說明儀器精密度良好。

2.3.5.2 重復性試驗 分別平行制備6 份供試品溶液，進樣，計算得苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、延胡索乙素含量的RSD 分別為1.30%、1.53%、0.98%，說明重復性良好。

2.3.5.3 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，于0、2、4、6、8、12 h 進樣測定，計算得苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、延胡索乙素含量的RSD 為0.93%、0.48%、0.65%，說明供試品溶液12 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.5.4 加樣回收率試驗 分別取6份已知含有苯甲酰新烏頭原堿6.04 mg、苯甲酰次烏頭原堿2.62 mg、延胡索乙素6.48 mg 的供試品溶液，分別加入含302.0 μg/mL 苯甲酰新烏頭原堿、131.5 μg/mL 苯甲酰次烏頭原堿和323.4 μg/mL 延胡索乙素的對照品溶液20 mL，制備供試品溶液，進樣，測定，結果苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、延胡索乙素平均回收率為98.70%、96.70%、103.8%，RSD分別為2.88%、1.41%、2.51%，故方法準確度較高。

2.3.6 出膏率測定 取“2.3.3”項下正交試驗各方案提取液回收乙醇后的收集藥液，精密稱取20%M 質量的藥液置于恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃下干燥3 h，移至干燥器中冷卻30 min，及時稱重干浸膏，計算出膏率。

2.3.7 考察指標 根據(jù)延胡索、川烏類藥材相關文獻［8，13，16-17］，以出膏率和延胡索乙素、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿含量為指標，采用綜合評分法，以苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、延胡索乙素含量和出膏率占權重系數(shù)0.15、0.15、0.6、0.1 計算各評分。

各組分提取率評分=（各組分提取液濃度/各組分提取液濃度最大值）×100

各組出膏率評分=（各組出膏率/出膏率最大值）×100

綜合評分=苯甲酰次烏頭原堿提取率評分×0.15+苯甲酰新烏頭原堿提取率評分×0.15+延胡索乙素提取率評分×0.60+出膏率評分×0.10

2.3.8 正交法優(yōu)化提取工藝 按巖痛方處方比例，稱取藥材延胡索12 g，川烏15 g，姜黃15 g。共計42 g，以提取次數(shù)（A）、乙醇濃度（B）、溶劑量（C）、提取時間（D）為4 個因素，每個因素3 個水平，設計L9（34）正交試驗表（表5）進行實驗，依據(jù)表6 中的正交設計實驗所設置的醇提工藝進行提取得提取液，并進一步測定提取液中各組分含量和出膏率，計算綜合評分，優(yōu)選最佳乙醇回流提取工藝。

表5 正交法考察醇提工藝因素水平

表6 醇提工藝正交試驗設計結果

醇提工藝正交試驗設計結果見表6，醇提工藝方差分析結果見表7。由方差分析結果可知，4 個因素對提取效率的影響均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。4 個因素對綜合評分影響程度排序為：提取次數(shù)（A）＞溶劑量（C）＞乙醇濃度（B）＞提取時間（D）。最大影響因素為提取次數(shù)，回流提取3 次的綜合評分值最高，但回流提取3 次與2 次的差別不大，為節(jié)約成本與時間，確定回流提取次數(shù)為2 次；其次是加溶劑量（C），加乙醇達8 倍量時綜合評分最高，因而采用加8 倍量溶劑；第3 為乙醇濃度（B），依據(jù)結果采用90%乙醇為提取溶劑；提取時間（D）的影響最小，選擇回流提取1 h。根據(jù)分析結果確定優(yōu)選工藝為A2B3C2D2，即提取2 次，加8 倍量90%乙醇為提取溶劑，每次1 h。

2.4 醇提工藝驗證實驗 巖痛方按處方各藥材量稱取延胡索、川烏、姜黃，平行3 份，按最佳回流提取工藝條件進行實驗，濾過，合并藥液，依法測定各組分的含量與出膏率，以正交試驗中的各指標最大值為分母計算綜合評分，驗證優(yōu)化工藝的結果見表8。實驗結果顯示：各組分的含量與出膏率均較高，綜合評分均在90 分以上，高于任一醇提工藝正交試驗設計實驗組的綜合評分值，提示優(yōu)化的工藝參數(shù)是適宜的。

表8 醇提工藝驗證結果

3 討 論

揮發(fā)油提取結果分析中顯示，粉碎度、浸泡時間、加水量的影響因素均較小。其中加水4 倍量與12 倍量所蒸餾的揮發(fā)油較高，但兩者的差異不大，考慮到節(jié)約溶劑，且12 倍量水使得固定體積容器所容納的提取藥材量顯著下降，因而最終選擇4倍量水。揮發(fā)油的提取量雖然隨著提取時間的延長而增加，但在預實驗中發(fā)現(xiàn)提取時間達到2 h 后揮發(fā)油提取增加量已明顯下降，達到3 h 后提取揮發(fā)油量基本不變，因而最終將揮發(fā)油的提取時間的高水平設為3 h。

在設置權重時，延胡索作為君藥占權重最大，所占權重設為60%，川烏在本方中作佐藥，權重相對較小，其2 個指標成分苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿總占比為30%，中藥成分較為復雜，除了指標成分外考慮到其他有效成分極有可能與所提取的膏量相關，因而設定了干膏重作為另一項提取工藝的指標，并設定10%為其權重占比。另外，在選擇指標成分時，也曾嘗試將川烏的新烏頭堿、次烏頭堿與烏頭堿的提取濃度作為考察指標，結果在實驗中發(fā)現(xiàn)這3 個成分出峰時間較長，且在梯度洗脫中與姜黃類化合物難以分離，因而最后選擇了苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿為指標成分考察川烏的提取率。

本研究以揮發(fā)油提取量與延胡索乙素、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的含量及出膏率為指標，通過正交試驗設計優(yōu)選出巖痛方的最佳提取工藝，采用優(yōu)化后的提取工藝能夠大幅度地提高巖痛方中有效成分的提取率，從而為進一步的制劑研究與開發(fā)提供了便利性，一方面它有利于提高外用制劑的載藥量，另一方面藥用成分無須通過植物細胞擴散出來，縮短了藥物吸收的路徑，從而更有利于臨床藥效的發(fā)揮。