一枝黃花含漱液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

曾茂貴，張 寬，謝晶心，鄭文煒，黃飛翔

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003；2.福建省醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350003）

一枝黃花為菊科植物一枝黃花Solidago decurrensLour. 的干燥全草［1］，性辛苦涼，歸肺、肝經(jīng)，其本草考證最早始載于《植物名實(shí)圖考》［2］，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效。一枝黃花提取物具有殺菌、消炎、抗腫瘤、降脂、降糖等多種藥理活性［3-6］，其對(duì)細(xì)菌和真菌具有較好的抑制和殺滅作用［7］，臨床常用于口臭、口腔潰瘍、口腔炎等口腔疾病的預(yù)防及治療［8-11］。一枝黃花含漱劑是福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院制劑中心擬開發(fā)的中藥單方制劑，具有安全無毒、使用方便快捷、適用人群廣泛、價(jià)格便宜等特點(diǎn)。已有研究表明黃酮類和酚酸類成分是其抗菌消炎的主要藥效物質(zhì)［3，12］，包括蘆丁、槲皮素、綠原酸等［13］。因此，為較全面地對(duì)一枝黃花含漱液質(zhì)量進(jìn)行控制，本研究采用薄層色譜法（TLC）對(duì)其進(jìn)行定性鑒別；同時(shí)建立高效液相色譜法（HPLC）對(duì)一枝黃花含漱液中綠原酸、蘆丁、異槲皮苷與槲皮素4 個(gè)成分進(jìn)行定量分析，以期為一枝黃花含漱液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立與院內(nèi)制劑申報(bào)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 戴安U3000 高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；超聲波儀（寧波新芝生物有限公司，型號(hào)：CLEAE01）；電子天平［奧豪斯儀器（常州）有限公司，型號(hào)：EX125ZH］；四孔加熱水浴鍋（上海力辰邦西儀器科技有限公司，型號(hào)：BHS-2）；低溫冷卻循環(huán)泵（上海亞榮生化儀器廠，型號(hào)：DLSB-6/20）；普通硅膠G 板（青島裕寶精細(xì)化工有限公司）；暗箱式三用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司，型號(hào)：ZF-7）；超純水制造設(shè)備（四川卓越水處理設(shè)備有限公司）；調(diào)溫電熱套（北京永光明醫(yī)療器材有限公司，型號(hào)：DZTW）；電動(dòng)薄層條帶狀點(diǎn)樣器（上海科哲生化科技有限公司，型號(hào)：SP-Ⅲ）。

1.2 試藥 一枝黃花購(gòu)自毫州市瀘譙藥業(yè)有限公司（批號(hào)：1903290222），經(jīng)福建省第二人民醫(yī)院藥學(xué)部倪立堅(jiān)主任藥師鑒定符合2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定；對(duì)照品綠原酸（純度96.1%，批號(hào)：110753-202018）、蘆?。兌?1.6%，批號(hào)：100080-202012）、異槲皮苷（純度97.2%，批號(hào)：111809-201804）、槲皮素（純度99.1%，批號(hào)：100081-201610）、一枝黃花對(duì)照藥材（批號(hào)：121433-201304）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。一枝黃花含漱液樣品及陰性制劑均為醫(yī)院制劑中心自制。阿斯巴甜（批號(hào)：W17032015）購(gòu)自江蘇漢光甜味劑有限公司；安賽蜜（批號(hào)：2020055V）購(gòu)自安徽維多食品配料有限公司；苯甲酸鈉（批號(hào)：23051203）購(gòu)自湖南新綠方藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液制備 取一枝黃花飲片30 g，加70%乙醇加熱回流，300 mL/次，提取3次，每次1.5 h，放冷，濾過，合并濾液，放四孔水浴鍋上加熱至無醇味，加入阿斯巴甜0.01 g、安賽蜜0.1 g 和苯甲酸鈉0.3 g，用純化水定容至100 mL，即得一枝黃花含漱液原液。精密量取一枝黃花含漱液原液20 mL 置水浴鍋加熱蒸干，殘?jiān)? mL 甲醇溶解，過濾后取續(xù)濾液，作為供試品溶液，用于TCL 分析。取上述一枝黃花含漱液原液用0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，用于HPLC 分析。

2.1.2 陰性供試品溶液制備 取阿斯巴甜0.01 g、安賽蜜0.1 g 和苯甲酸鈉0.3 g，用純化水溶解定容至100 mL，即得缺一枝黃花藥材陰性原液，后按“2.1.1”項(xiàng)下同法分別制成用于TCL 與HPLC 分析的陰性供試品溶液。

2.1.3 對(duì)照藥材溶液制備 取一枝黃花對(duì)照藥材約2 g，加入石油醚（60～90 ℃）50 mL，超聲處理（250 W，40 kHz）30 min，放冷，濾過，棄去石油醚液，藥渣揮干溶劑，加70%乙醇30 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)? mL 甲醇溶解，作為對(duì)照藥材溶液，用于TCL 分析。

2.1.4 混合對(duì)照品溶液制備 取蘆丁對(duì)照品，加甲醇制成1 mg/mL 蘆丁對(duì)照品溶液，用于TCL 分析。分別精密稱取綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、槲皮素對(duì)照品適量，加甲醇分別制成1.080、1.248、0.832、0.720 mg/mL 單一對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇制成含上述4 個(gè)成分、濃度分別為216.00、624.00、41.60、36.00 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液，搖勻，用于HPLC 分析。

2.2 TCL 法定性分析 參照《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版四部通則（0502）進(jìn)行TCL 分析，吸取供試品溶液10、15 μL，蘆丁對(duì)照品溶液5 μL，對(duì)照藥材溶液與陰性供試品溶液各15 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（8∶1∶1∶1）為展開劑展開，取出，晾干，置紫外光燈365 nm 下檢視。結(jié)果表明：供試品色譜中，在與蘆丁對(duì)照品色譜和對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無干擾，見圖1。

圖1 一枝黃花含漱液薄層色譜鑒別圖

2.3 HPLC 法定量分析

2.3.1 色譜條件 SinoChrom ODS-BP C18色譜柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.05%磷酸乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0～8 min，12%～20%A；8～15 min，20%～25%A；15～25 min，25%～35%A；25～40 min，35%～75%A；40～50 min，75%～12%A；50～60 min，12%～12%A；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。見圖2。

圖2 一枝黃花含漱液HPLC 圖

2.3.2 線性關(guān)系考察 取“2.1.4”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，稀釋為一系列梯度濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量為10 μL。以各化學(xué)成分進(jìn)樣量（μg）作為橫坐標(biāo)X，各成分峰面積作為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算出各自的回歸方程與相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明：4 個(gè)成分在一定進(jìn)樣量范圍內(nèi)與峰面積呈較好的線性關(guān)系，見表1。

表1 一枝黃花含漱液中4 個(gè)化學(xué)成分的線性回歸方程

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下的供試品溶液10 μL，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算各組分峰面積RSD，結(jié)果顯示：供試品溶液色譜中綠原酸、蘆丁、異槲皮苷與槲皮素峰面積的RSD分別為1.57%、1.45%、1.50%、1.28%，表明該高效液相色譜儀精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取一枝黃花藥材（批號(hào)：1903290222）6 份，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備成6 份一枝黃花含漱液。以“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，計(jì)算綠原酸、蘆丁、異槲皮苷與槲皮素平均含量分別為63.22、159.5、10.35、10.50 μg/mL，各組分含量RSD 分別為1.54%、0.82%、1.27%、1.49%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，25 ℃室溫放置，于0、2、4、6、12、24 h 分別按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄各組分峰面積，并計(jì)算綠原酸、蘆丁、異槲皮苷與槲皮素峰面積RSD 分別為1.80%、0.59%、1.62%、1.16%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取一枝黃花藥材（批號(hào)：1903290222）6 份，按“2.1.1”項(xiàng)下方法平行制備6 份一枝黃花含漱液，每份取2 mL，分別加入適量“2.1.4”項(xiàng)下各單一對(duì)照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜方法進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示：綠原酸、蘆丁、異槲皮苷與槲皮素的加樣回收率分別為99.12%、99.97%、98.46%、98.97%，各組分RSD分別為1.82%、1.27%、2.02%、2.28%。表明該方法準(zhǔn)確性高，見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3.7 樣品含量測(cè)定 按“2.1.1”項(xiàng)下方法分別制成3 批次供試品溶液，并按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄各組分峰面積，代入“2.3.2”項(xiàng)下方程計(jì)算一枝黃花含漱液中各待測(cè)組分含量，見表3。

表3 3 批次樣品含量測(cè)定表（n=3） μg/mL

3 討 論

3.1 薄層鑒別 在薄層色譜鑒別中對(duì)比了水提醇沉與乙醇加熱回流2 種提取方法，發(fā)現(xiàn)采用水提醇沉法所制備樣品在薄層色譜上斑點(diǎn)拖尾嚴(yán)重，分離度不理想，而乙醇回流提取方法能明顯改善上述現(xiàn)象。進(jìn)一步對(duì)乙醇濃度進(jìn)行考察，分別采用30%、50%、70%和純乙醇回流提取，發(fā)現(xiàn)70%乙醇提取的樣品在色譜上斑點(diǎn)分離度較好，與對(duì)照品以及對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，觀察到相同顏色的斑點(diǎn)且顯色清晰，陰性無干擾。因此本試驗(yàn)最終采用70%乙醇加熱回流提取樣品。

3.2 HPLC 法流動(dòng)相選擇 參考文獻(xiàn)［14-15］，本次試驗(yàn)共設(shè)計(jì)考察了0.1%甲酸甲醇-0.2%甲酸水、0.1%甲酸乙腈-0.2%甲酸水、0.05%磷酸乙腈-0.1%磷酸水溶液3 種不同的流動(dòng)相體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：0.1%甲酸甲醇-0.2%甲酸水色譜基線出現(xiàn)下漂現(xiàn)象且色譜峰表征數(shù)量較少；0.1%甲酸乙腈-0.2%甲酸水出現(xiàn)部分色譜峰的分離度較低；采用0.05%磷酸乙腈-0.1%磷酸水發(fā)現(xiàn)色譜峰分離度與峰形較好且基線平穩(wěn)。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 參照文獻(xiàn)［16-17］，結(jié)合對(duì)比了5 種不同波長(zhǎng)下一枝黃花含漱液色譜峰的表征效果，以一枝黃花藥典指標(biāo)成分蘆丁峰面積大小為參照依據(jù)，發(fā)現(xiàn)在360 nm 波長(zhǎng)下，4 個(gè)待測(cè)成分的色譜峰峰形對(duì)稱，分離度良好，因此最終確定以360 nm 波長(zhǎng)作為本次HPLC 定量方法的檢測(cè)波長(zhǎng)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)所建立的一枝黃花含漱液TLC 法鑒別的專屬性強(qiáng)，斑點(diǎn)清晰且陰性對(duì)照無干擾；建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定一枝黃花含漱液中綠原酸、蘆丁、異槲皮苷與槲皮素4 個(gè)成分的含量，經(jīng)精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性與加樣回收率方法學(xué)考察驗(yàn)證，該方法穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)便，可為一枝黃花含漱液質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。