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    UPLC-Q-TOF-MS/MS法定性和HPLC法定量分析菟絲子飲片成分

    2024-01-03 12:34:42歐余航許榕倩吳金棟
    福建中醫(yī)藥 2023年11期
    關(guān)鍵詞:槲皮苷桃苷菟絲子

    歐余航,張 寬,周 菲,許榕倩,吳金棟

    (1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院,福建 福州 350108;2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院,福建 福州 350003)

    菟絲子為旋花科植物南方菟絲子Cuscuta australisR. Br.或菟絲子Cuscuta chinensisLam.的干燥成熟種子。菟絲子產(chǎn)地分布廣泛,具有補益肝腎、固精縮尿、安胎等功效,目前臨床常用于治療頭暈耳鳴、腰膝酸軟、陽痿遺精、胎動不安等癥狀[1-2]。菟絲子中主要含有黃酮類、有機酸、多糖、生物堿和氨基酸等多種物質(zhì)成分[3-4],其中黃酮、酚酸類等有效成分已證實具有抗衰老、抗氧化、保肝益腎增強免疫等作用[5-6]。

    中藥菟絲子來源廣泛,質(zhì)量參差不齊。《中華人民共和國藥典》[1]以金絲桃苷(C21H20O12)含量不得少于干燥菟絲子樣品0.1%作為菟絲子飲片含量測定的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn);有文獻采用建立高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜法,對比樣品與指紋圖譜的相關(guān)性及差異性對菟絲子飲片質(zhì)量進行評價[7],但對于其中主要成分鑒別及含量測定并未進行明確檢測。本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜法(UPLC-Q-TOF-MS/MS)對菟絲子飲片中分離度高、含量較大的成分進行定性分析,并建立上述成分HPLC 含量測定方法,進一步為菟絲子飲片的評價與質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器 1290 Infinity Ⅱ液相色譜儀(美國Agilent Technologies 公司)和micro TOF Ⅱ[布魯克(北京)科技有限公司];戴安U3000 高效液相色譜儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司];AL04 型萬分之一電子天平[梅特勒托利多科技(中國)有限公司];SB-5200DT 超聲波提取器(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

    1.2 材料 菟絲子飲片購于安徽省萬生中藥飲片有限公司(產(chǎn)地:內(nèi)蒙古),經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)曾建偉副研究員鑒定為菟絲子Cuscuta chinensisLam.干燥成熟種子。對照品綠原酸(純度96.1%)、異槲皮苷(純度97.2%)、金絲桃苷(純度94.7%)、咖啡酸(純度99.7%)均購自中國食品藥品檢定研究院(批號:110753-202018、111809-201804、111521-201809、110885-201703);對照品紫云英苷(純度98%,上海源葉生物科技有限公司,批號:B21704)。甲醇、乙腈、磷酸和甲酸均為色譜純,其余試劑均為分析純。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 色譜及質(zhì)譜條件

    2.1.1 HPLC 色譜條件 大連依利特SinoChrom ODS-BP C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脫:0~20 min,7%~12%A;20~50 min,12%~15%A;50~60 min,15%~17%A;60~70 min,17%~17%A;70~90 min,17%~20%A;90~100 min,20%~30%A;流速1 mL/min;紫外檢測波長360 nm;柱溫25 ℃;進樣量10 μL。

    2.1.2 UPLC-Q-TOF-MS/MS 條件 Acclaim UPLC RSLC 120 C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,2.2 μm);流動相:乙腈(A)-0.01%甲酸水溶液(B),梯度洗脫:0~8 min,7%~7%A;8~20 min,7%~12%A;20~25 min,12%~15%A;25~30 min,15%~17%A;30~37 min,17%~20%A;37~42 min,20%~30%A;流速0.3 mL/min;進樣量2 μL;柱溫30 ℃。質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI);掃描方式為正(+)、負(-)離子模式;氣體流速10 L/min;源電壓3.5 kV;氣體流速10 L/min;噴霧干燥器溫度350 ℃;壓力30 psi;MSbreaking電壓1.0 V;掃描范圍100~1 500 U。

    2.2 溶液制備

    2.2.1 供試品溶液制備 菟絲子飲片粉碎,過四號篩,精密稱取菟絲子飲片(批號:200501)0.5 g,置于三角錐形瓶中,精密量取70%甲醇溶液50 mL 置于錐形瓶中,密封稱重后浸泡過夜,復(fù)稱后用70%甲醇溶液補足重量,置超聲提取器中超聲30 min(功率250 W,頻率50 kHz),置水浴鍋上揮干溶劑,70%甲醇溶液復(fù)溶,溶液定容至5 mL量瓶。靜置30 min,取上清液過0.22 μm 微孔濾膜,取續(xù)濾液,即得供試品溶液。

    2.2.2 對照品貯備液制備 精密稱取綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、金絲桃苷、紫云英苷對照品適量,分別置于量瓶中,加入適量甲醇超聲溶解后,再加甲醇定容,分別配置成濃度為0.216 0、0.200 0、0.208 0、1.452 0、0.200 0 mg/mL 的綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、金絲桃苷、紫云英苷對照品貯備液,并置冰箱(2~8 ℃)保存。

    2.2.3 混合對照品溶液制備 精密吸取“2.2.2”項下對照品貯備液:綠原酸500 μL、咖啡酸70 μL、異槲皮苷200 μL、金絲桃苷70 μL、紫云英苷300 μL,置同一量瓶,混合后配制成濃度分別為94.74、12.28、36.49、89.16、52.63 μg/mL 的綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、金絲桃苷、紫云英苷混合對照品溶液。

    2.3 UPLC-Q-TOF-MS/MS 定性分析 按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液,按“2.1.2”項下UPLCQ-TOF-MS/MS 條件進樣檢測,得到菟絲子飲片基準(zhǔn)峰色譜圖,見圖1。對對照品、供試品溶液進行UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析,將得到化合物的[M+H]+、[M-H]-與文獻[8-11]中化合物進行信息比對,收集菟絲子飲片中所含化合物,匯總各化合物的名稱、分子式、分子量及化合物結(jié)構(gòu)式等信息,計算正、負離子模式下的常見離子形態(tài)的精確質(zhì)荷比。最終從菟絲子飲片中鑒定出5 個主要成分,與對照品比對確認,經(jīng)Mass calculator 驗證,見表1。

    表1 菟絲子飲片UPLC-Q-TOF-MS/MS 質(zhì)譜分析結(jié)果

    圖1 菟絲子飲片基準(zhǔn)峰色譜圖

    2.4 HPLC 定量分析

    2.4.1 專屬性試驗 分別精密吸取空白溶劑、混合對照品溶液及供試品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析,見圖2。供試品溶液與對照品溶液色譜峰的保留時間一致,且空白溶劑在相應(yīng)保留時間無干擾,表明該方法專屬性良好。

    圖2 菟絲子飲片HPLC 圖譜

    2.4.2 線性范圍考察 分別精密吸取“2.2.3”項下混合對照品溶液各2.5、5、10、20、40 μL,按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析,測定峰面積。以進樣濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)X,色譜峰面積(A)為縱坐標(biāo)Y,結(jié)果如表2 所示。

    表2 菟絲子5 個成分回歸方程及線性范圍

    2.4.3 精密度試驗 精密稱定菟絲子飲片粉末(批號:200501)約0.5 g,按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件進行測定,連續(xù)進樣6 次。結(jié)果綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、金絲桃苷、紫云英苷的峰面積RSD 分別為0.74%、0.40%、0.49%、0.86%、0.76%,說明該色譜條件下儀器精密度良好。

    2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取“2.4.3”項下供試品溶液,分別于0、1、2、4、8、12、24 h 按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。結(jié)果綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、金絲桃苷、紫云英苷的峰面積RSD 分別為0.79%、0.93%、0.77%、0.82%、0.75%,表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.4.5 重復(fù)性試驗 精密稱取菟絲子飲片粉末(批號:200501)6 份(約0.5 g/份),按“2.2.1”項下制備供試品溶液,依次進樣檢測,計算樣品中各組分含量。結(jié)果綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、金絲桃苷、紫云英苷的平均含量分別為0.691 3、0.061 4、0.528 5、1.107 3、0.629 9 mg/g,RSD 分別為0.49%、0.63%、1.04%、0.48%、0.53%,表明該方法的重復(fù)性良好。

    2.4.6 加樣回收率試驗 精密稱取菟絲子飲片粉末(批號:200501)6 份(0.5 g/份),分別精密加入與樣品含量近似相等的混合對照品溶液,按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液,最終用70%甲醇定容于10 mL 量瓶。按“2.1.1”項下色譜條件進樣檢測,計算各組分的加樣回收率和RSD。見表3。

    表3 加樣回收試驗結(jié)果

    2.4.7 樣品含量測定 取10個批次菟絲子飲片粉末(批號:200501、210401、210701、2003004、2007007、2011010、200901、200701、210601、201202),每個批次平行取樣3 份,分別按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液,取混合對照品溶液及供試品溶液各10 μL分別進樣,測定峰面積,按外標(biāo)法計算不同批次樣品含量,各個批次樣品間各成分的含量差異較大。見表4。

    表4 10 批次菟絲子飲片5 個成分平均含量測定結(jié)果 mg/g

    3 討 論

    中藥成分復(fù)雜多樣,有效成分難以全部明確,如何在成分不完全明確情況下對中藥進行質(zhì)量評價顯得十分重要。目前研究對于菟絲子的成分分析,或通過HPLC 法比較保留時間一致性對成分進行定量測定[12];或通過質(zhì)譜檢測對菟絲子成分進行定性分析[13],但未建立定量方法。本文通過質(zhì)譜對菟絲子飲片中化學(xué)成分進行分析,通過數(shù)據(jù)庫、軟件對化學(xué)成分精確分子量、保留時間、碎片離子峰等信息進行比對,從中選擇含量較高且有文獻報道明確藥理活性的5 個化學(xué)成分,進一步通過對照品綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、金絲桃苷、紫云英苷對結(jié)果進行驗證,保留時間、碎片離子峰等吻合,且通過質(zhì)譜定性可排除保留時間相同但不同化學(xué)成分的干擾。在質(zhì)譜基礎(chǔ)上,再應(yīng)用HPLC 法建立菟絲子飲片中5 個成分的含量測定方法,為研究菟絲子的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

    本實驗所測10 批樣品的5 個成分含量,批次間差異較大,黃酮苷中金絲桃苷、紫云英苷含量最高與最低相差近1 倍;咖啡酸的含量波動變化最大。根據(jù)樣品的含量測定結(jié)果,菟絲子飲片中黃酮苷的含量較大,又以金絲桃苷的含量最高。若以2020 版《中華人民共和國藥典》作為評價標(biāo)準(zhǔn),僅有3 份樣品合格。但本研究旨在尋找一種可檢測菟絲子飲片多種成分的快速、靈敏、準(zhǔn)確方法,以期為菟絲子飲片質(zhì)量控制提供更全面的評價,由于在流動相比例、檢測波長及樣品前處理等方面與《中華人民共和國藥典》中的方法均有差異,因此不能簡單將其結(jié)合本研究的檢測結(jié)果作為直接評價樣品是否合格的依據(jù)。

    本研究采用UPLC-Q-TOF-MS 對菟絲子飲片中的成分進行定性分析,根據(jù)定性分析結(jié)果,建立了綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、金絲桃苷、紫云英苷5 個成分的HPLC 含量測定方法,并采用該方法對10 批樣品進行定量檢測,結(jié)果穩(wěn)定可靠,重現(xiàn)性良好,可為進一步提高該藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

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