UPLC-Q-TOF-MS/MS法定性和HPLC法定量分析菟絲子飲片成分

歐余航，張 寬，周 菲，許榕倩，吳金棟

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院，福建 福州 350108；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003）

菟絲子為旋花科植物南方菟絲子Cuscuta australisR. Br.或菟絲子Cuscuta chinensisLam.的干燥成熟種子。菟絲子產(chǎn)地分布廣泛，具有補益肝腎、固精縮尿、安胎等功效，目前臨床常用于治療頭暈耳鳴、腰膝酸軟、陽痿遺精、胎動不安等癥狀［1-2］。菟絲子中主要含有黃酮類、有機酸、多糖、生物堿和氨基酸等多種物質(zhì)成分［3-4］，其中黃酮、酚酸類等有效成分已證實具有抗衰老、抗氧化、保肝益腎增強免疫等作用［5-6］。

中藥菟絲子來源廣泛，質(zhì)量參差不齊。《中華人民共和國藥典》［1］以金絲桃苷（C21H20O12）含量不得少于干燥菟絲子樣品0.1%作為菟絲子飲片含量測定的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)；有文獻采用建立高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜法，對比樣品與指紋圖譜的相關(guān)性及差異性對菟絲子飲片質(zhì)量進行評價［7］，但對于其中主要成分鑒別及含量測定并未進行明確檢測。本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜法（UPLC-Q-TOF-MS/MS）對菟絲子飲片中分離度高、含量較大的成分進行定性分析，并建立上述成分HPLC 含量測定方法，進一步為菟絲子飲片的評價與質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 1290 Infinity Ⅱ液相色譜儀（美國Agilent Technologies 公司）和micro TOF Ⅱ［布魯克（北京）科技有限公司］；戴安U3000 高效液相色譜儀［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；AL04 型萬分之一電子天平［梅特勒托利多科技（中國）有限公司］；SB-5200DT 超聲波提取器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 材料 菟絲子飲片購于安徽省萬生中藥飲片有限公司（產(chǎn)地：內(nèi)蒙古），經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)曾建偉副研究員鑒定為菟絲子Cuscuta chinensisLam.干燥成熟種子。對照品綠原酸（純度96.1%）、異槲皮苷（純度97.2%）、金絲桃苷（純度94.7%）、咖啡酸（純度99.7%）均購自中國食品藥品檢定研究院（批號：110753-202018、111809-201804、111521-201809、110885-201703）；對照品紫云英苷（純度98%，上海源葉生物科技有限公司，批號：B21704）。甲醇、乙腈、磷酸和甲酸均為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1 HPLC 色譜條件 大連依利特SinoChrom ODS-BP C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0～20 min，7%～12%A；20～50 min，12%～15%A；50～60 min，15%～17%A；60～70 min，17%～17%A；70～90 min，17%～20%A；90～100 min，20%～30%A；流速1 mL/min；紫外檢測波長360 nm；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。

2.1.2 UPLC-Q-TOF-MS/MS 條件 Acclaim UPLC RSLC 120 C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.2 μm）；流動相：乙腈（A）-0.01%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～8 min，7%～7%A；8～20 min，7%～12%A；20～25 min，12%～15%A；25～30 min，15%～17%A；30～37 min，17%～20%A；37～42 min，20%～30%A；流速0.3 mL/min；進樣量2 μL；柱溫30 ℃。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式為正（+）、負（-）離子模式；氣體流速10 L/min；源電壓3.5 kV；氣體流速10 L/min；噴霧干燥器溫度350 ℃；壓力30 psi；MSbreaking電壓1.0 V；掃描范圍100～1 500 U。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液制備 菟絲子飲片粉碎，過四號篩，精密稱取菟絲子飲片（批號：200501）0.5 g，置于三角錐形瓶中，精密量取70%甲醇溶液50 mL 置于錐形瓶中，密封稱重后浸泡過夜，復(fù)稱后用70%甲醇溶液補足重量，置超聲提取器中超聲30 min（功率250 W，頻率50 kHz），置水浴鍋上揮干溶劑，70%甲醇溶液復(fù)溶，溶液定容至5 mL量瓶。靜置30 min，取上清液過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.2 對照品貯備液制備 精密稱取綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、金絲桃苷、紫云英苷對照品適量，分別置于量瓶中，加入適量甲醇超聲溶解后，再加甲醇定容，分別配置成濃度為0.216 0、0.200 0、0.208 0、1.452 0、0.200 0 mg/mL 的綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、金絲桃苷、紫云英苷對照品貯備液，并置冰箱（2～8 ℃）保存。

2.2.3 混合對照品溶液制備 精密吸取“2.2.2”項下對照品貯備液：綠原酸500 μL、咖啡酸70 μL、異槲皮苷200 μL、金絲桃苷70 μL、紫云英苷300 μL，置同一量瓶，混合后配制成濃度分別為94.74、12.28、36.49、89.16、52.63 μg/mL 的綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、金絲桃苷、紫云英苷混合對照品溶液。

2.3 UPLC-Q-TOF-MS/MS 定性分析 按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項下UPLCQ-TOF-MS/MS 條件進樣檢測，得到菟絲子飲片基準(zhǔn)峰色譜圖，見圖1。對對照品、供試品溶液進行UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析，將得到化合物的［M+H］+、［M-H］-與文獻［8-11］中化合物進行信息比對，收集菟絲子飲片中所含化合物，匯總各化合物的名稱、分子式、分子量及化合物結(jié)構(gòu)式等信息，計算正、負離子模式下的常見離子形態(tài)的精確質(zhì)荷比。最終從菟絲子飲片中鑒定出5 個主要成分，與對照品比對確認，經(jīng)Mass calculator 驗證，見表1。

表1 菟絲子飲片UPLC-Q-TOF-MS/MS 質(zhì)譜分析結(jié)果

圖1 菟絲子飲片基準(zhǔn)峰色譜圖

2.4 HPLC 定量分析

2.4.1 專屬性試驗 分別精密吸取空白溶劑、混合對照品溶液及供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，見圖2。供試品溶液與對照品溶液色譜峰的保留時間一致，且空白溶劑在相應(yīng)保留時間無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖2 菟絲子飲片HPLC 圖譜

2.4.2 線性范圍考察 分別精密吸取“2.2.3”項下混合對照品溶液各2.5、5、10、20、40 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，測定峰面積。以進樣濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)X，色譜峰面積（A）為縱坐標(biāo)Y，結(jié)果如表2 所示。

表2 菟絲子5 個成分回歸方程及線性范圍

2.4.3 精密度試驗 精密稱定菟絲子飲片粉末（批號：200501）約0.5 g，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進行測定，連續(xù)進樣6 次。結(jié)果綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、金絲桃苷、紫云英苷的峰面積RSD 分別為0.74%、0.40%、0.49%、0.86%、0.76%，說明該色譜條件下儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取“2.4.3”項下供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、12、24 h 按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。結(jié)果綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、金絲桃苷、紫云英苷的峰面積RSD 分別為0.79%、0.93%、0.77%、0.82%、0.75%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗 精密稱取菟絲子飲片粉末（批號：200501）6 份（約0.5 g/份），按“2.2.1”項下制備供試品溶液，依次進樣檢測，計算樣品中各組分含量。結(jié)果綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、金絲桃苷、紫云英苷的平均含量分別為0.691 3、0.061 4、0.528 5、1.107 3、0.629 9 mg/g，RSD 分別為0.49%、0.63%、1.04%、0.48%、0.53%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 精密稱取菟絲子飲片粉末（批號：200501）6 份（0.5 g/份），分別精密加入與樣品含量近似相等的混合對照品溶液，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，最終用70%甲醇定容于10 mL 量瓶。按“2.1.1”項下色譜條件進樣檢測，計算各組分的加樣回收率和RSD。見表3。

表3 加樣回收試驗結(jié)果

2.4.7 樣品含量測定 取10個批次菟絲子飲片粉末（批號：200501、210401、210701、2003004、2007007、2011010、200901、200701、210601、201202），每個批次平行取樣3 份，分別按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，取混合對照品溶液及供試品溶液各10 μL分別進樣，測定峰面積，按外標(biāo)法計算不同批次樣品含量，各個批次樣品間各成分的含量差異較大。見表4。

表4 10 批次菟絲子飲片5 個成分平均含量測定結(jié)果 mg/g

3 討 論

中藥成分復(fù)雜多樣，有效成分難以全部明確，如何在成分不完全明確情況下對中藥進行質(zhì)量評價顯得十分重要。目前研究對于菟絲子的成分分析，或通過HPLC 法比較保留時間一致性對成分進行定量測定［12］；或通過質(zhì)譜檢測對菟絲子成分進行定性分析［13］，但未建立定量方法。本文通過質(zhì)譜對菟絲子飲片中化學(xué)成分進行分析，通過數(shù)據(jù)庫、軟件對化學(xué)成分精確分子量、保留時間、碎片離子峰等信息進行比對，從中選擇含量較高且有文獻報道明確藥理活性的5 個化學(xué)成分，進一步通過對照品綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、金絲桃苷、紫云英苷對結(jié)果進行驗證，保留時間、碎片離子峰等吻合，且通過質(zhì)譜定性可排除保留時間相同但不同化學(xué)成分的干擾。在質(zhì)譜基礎(chǔ)上，再應(yīng)用HPLC 法建立菟絲子飲片中5 個成分的含量測定方法，為研究菟絲子的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

本實驗所測10 批樣品的5 個成分含量，批次間差異較大，黃酮苷中金絲桃苷、紫云英苷含量最高與最低相差近1 倍；咖啡酸的含量波動變化最大。根據(jù)樣品的含量測定結(jié)果，菟絲子飲片中黃酮苷的含量較大，又以金絲桃苷的含量最高。若以2020 版《中華人民共和國藥典》作為評價標(biāo)準(zhǔn)，僅有3 份樣品合格。但本研究旨在尋找一種可檢測菟絲子飲片多種成分的快速、靈敏、準(zhǔn)確方法，以期為菟絲子飲片質(zhì)量控制提供更全面的評價，由于在流動相比例、檢測波長及樣品前處理等方面與《中華人民共和國藥典》中的方法均有差異，因此不能簡單將其結(jié)合本研究的檢測結(jié)果作為直接評價樣品是否合格的依據(jù)。

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS 對菟絲子飲片中的成分進行定性分析，根據(jù)定性分析結(jié)果，建立了綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、金絲桃苷、紫云英苷5 個成分的HPLC 含量測定方法，并采用該方法對10 批樣品進行定量檢測，結(jié)果穩(wěn)定可靠，重現(xiàn)性良好，可為進一步提高該藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。