栝樓桂枝湯調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞活化后的表型轉(zhuǎn)化緩解腦缺血再灌注大鼠模型的神經(jīng)損傷

鐘興華，楊勁博，胡海霞

（福建中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新與轉(zhuǎn)化中心，福建 福州 350122）

缺血性腦卒中常伴隨著嚴(yán)重的并發(fā)癥，有較高的致殘率，給社會(huì)、家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)［1-2］。腦卒中后腦損傷是由多種細(xì)胞相互作用引起的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，腦卒中后過度的神經(jīng)炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致神經(jīng)元功能異常的主要因素之一［3］。研究表明缺血性腦損傷后的炎癥反應(yīng)會(huì)使小膠質(zhì)細(xì)胞活化，活化后的小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)轉(zhuǎn)化為M1 型（促炎型）及M2 型（抗炎型）2 種表型，M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)釋放過量的促炎因子，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)持續(xù)進(jìn)展，使突觸結(jié)構(gòu)異常和突觸減少［4-6］，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷［7］。相比之下，M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)增強(qiáng)吞噬活性以清除碎片，并產(chǎn)生許多抗炎和修復(fù)因子。因此調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞活化后的表型轉(zhuǎn)化，抑制卒中后過度的炎癥反應(yīng)，可改善神經(jīng)損傷，為缺血性腦卒中治療提供了重要的研究方向。

栝樓桂枝湯來源于《金匱要略》，治療外感熱病引起的肢體痙攣，也可用于緩解卒中后肢體痙攣［8］。研究證實(shí)：栝樓桂枝湯可緩解缺血再灌注損傷模型大鼠卒中后痙攣狀態(tài)，抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，且可明顯降低腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化及炎癥因子、趨化因子的表達(dá)［9］，但其具體機(jī)制尚不明確。本研究通過建立腦缺血再灌注大鼠模型，調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化后的炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步明確栝樓桂枝湯對(duì)腦保護(hù)的分子作用機(jī)制，為栝樓桂枝湯治療缺血性腦卒中提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)健康雄性SD 大鼠30 只，8～12 周齡，體質(zhì)量（240±20）g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（閩）2019-0007，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（閩）2019-0007。將小鼠置于籠具中飼養(yǎng)，室溫22～24 ℃，相對(duì)濕度50%～60%。本研究已通過福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核（FJTCM IACUC 2020086）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 栝樓桂枝湯由栝樓根30 g，桂枝9 g，生姜9 g，白芍9 g，大棗9 g，甘草6 g 組成，購自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院。栝樓桂枝湯水提液制備：加5 倍量水，浸泡30 min，加熱回流2 次，每次1 h，濾液合并濃縮至1.06 g/mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 大鼠白細(xì)胞介素-1（IL-1）ELISA試劑盒（合肥萊爾生物科技有限公司，貨號(hào)：LEB1145）；精氨酸酶1（Arg-1）抗體（武漢三鷹生物科技有限公司，貨號(hào)：66129-1）；組織相容性復(fù)合物-Ⅱ（MHC-Ⅱ，貨號(hào)：ab92511）、離子鈣接頭蛋白（Iba-1，貨號(hào)：ab178846）、微管相關(guān)蛋白2（MAP-2，貨號(hào)：ab5392）抗體均購自英國Abcam 公司；DAB 顯色試劑盒（貨號(hào)：DA1015）、中性樹膠（貨號(hào)：G8590-100ML）、檸檬酸鈉緩沖液（貨號(hào)：C1010-2L）均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 7500 熒光定量PCR 儀（美國ABI公司）；石蠟包埋機(jī)（臨沂愛華生物科技有限公司，型號(hào)：BMJ-1B）。

2 方 法

2.1 分組與造模 將SD 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組10 只和造模組20 只。造模組采用改良型線栓法［10］使大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈發(fā)生梗死，1.5 h 后再灌注建立腦缺血再灌注模型；假手術(shù)組僅鈍性分離頸部肌肉血管，不插入線栓。采用Longa 評(píng)分［11］進(jìn)行神經(jīng)功能損傷程度的評(píng)價(jià)，1～3 分視為造模成功。采用抽簽法將造模成功的大鼠分成模型組和栝樓桂枝湯組各10 只。

2.2 干預(yù) 于造模成功后第2 天開始灌胃干預(yù)，栝樓桂枝湯組按0.15 mg/（kg·d）給予栝樓桂枝湯藥液灌胃，假手術(shù)組和模型組按10 mL/（kg·d）給予生理鹽水灌胃，每日1次，持續(xù)灌胃1 周。

2.3 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 采用Longa 評(píng)分［11］對(duì)干預(yù)前后神經(jīng)功能缺損狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估。① 大鼠可自主活動(dòng)，沒有神經(jīng)功能異常狀態(tài)，計(jì)為0 分；② 提尾時(shí)，前肢不能完全屈伸，計(jì)為1 分；③ 自主行動(dòng)時(shí)，大鼠向大腦缺血側(cè)病灶對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈，計(jì)為2 分；④ 自主行動(dòng)時(shí)，大鼠身體向大腦缺血側(cè)病灶對(duì)側(cè)歪斜，計(jì)為3 分；⑤ 大鼠不能自主行走，有意識(shí)昏迷，計(jì)為4 分。評(píng)分越高則說明大鼠神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

2.4 取材 2%的戊巴比妥鈉動(dòng)物麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，靜置30 min 后，12 000 r/min 離心30 min，取血清于-20 ℃凍存，用于后續(xù)ELISA 實(shí)驗(yàn)。同時(shí)各組選取部分大鼠腦組織于-20 ℃凍存，用于Western blot 實(shí)驗(yàn)。剩余大鼠從左心室灌注生理鹽水約100 mL，然后抽取50 mL 4%多聚甲醛繼續(xù)灌注，固定腦組織，隨后斷頭取腦，進(jìn)行脫水、石蠟包埋以及切片，用于HE 染色及免疫組化實(shí)驗(yàn)。

2.5 ELISA 法檢測(cè)大鼠血清IL-1 含量 取外周血血清，每組單次設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次以上，按ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)并計(jì)算IL-1 含量。

2.6 HE 染色觀察大鼠腦組織病理形態(tài) 石蠟切片置于梯度酒精脫蠟，隨后分別用蘇木素與伊紅染色細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)，PBS 溶液清洗，中性樹脂封片。光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠大腦腦組織細(xì)胞形態(tài)并拍照。

2.7 Western blot 檢測(cè)大鼠腦組織MHC-Ⅱ、Arg-1蛋白表達(dá)量 取各組腦組織使用蛋白裂解液提取總蛋白，BCA 法測(cè)定濃度。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜，快速封閉液封閉15 min，分別加入MHC-Ⅱ（1∶1 000）、Arg-1（1∶8 000）、vinculin（1∶1 000）抗體，4 ℃孵育過夜，TBST 溶液洗膜后，再加兔二抗（1∶5 000）及鼠二抗（1∶3 000），37 ℃下孵育1 h，TBST 溶液洗膜3 次后加ECL 化學(xué)發(fā)光劑顯影。應(yīng)用Image Lab 圖像分析軟件測(cè)定目的條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白表達(dá)量。

2.8 免疫組化觀察大鼠腦組織Iba-1、MAP-2 蛋白表達(dá)水平 取大鼠腦組織，制備蠟塊，并包埋切片備用。將石蠟切片放入檸檬酸鹽緩沖溶液中，水浴加熱10 min，冷卻至室溫后，PBS 溶液清洗3 次。切片上滴加封閉液，室溫下封閉20 min。在切片上滴加Iba-1 及MAP-2 一抗，4 ℃孵育過夜，PBS 溶液清洗3次。在切片上滴加二抗，37 ℃下孵育抗體20 min，PBS 溶液清洗3 次。在切片上滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP），37 ℃孵育20 min。隨后在切片上滴加DAB 顯色試劑，顯微鏡觀察并拍照后，若出現(xiàn)棕色或棕褐色表示Iba-1、MAP-2 陽性。應(yīng)用ImageJ 軟件計(jì)數(shù)400 倍鏡下隨機(jī)5 個(gè)視野的陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值，求得陽性細(xì)胞數(shù)目。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊性采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊采用Games-Howell 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 3 組干預(yù)前后Longa 評(píng)分比較 見表1。

表1 3 組干預(yù)前后Longa 評(píng)分比較（±s） 分

表1 3 組干預(yù)前后Longa 評(píng)分比較（±s） 分

注：與假手術(shù)組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

干預(yù)后0.0±0.0 1.82±0.501）1.05±0.222）組別假手術(shù)組模型組栝樓桂枝湯組n333干預(yù)前0.0±0.0 2.09±0.591）2.13±0.551）

3.2 3 組血清IL-1 含量比較 見圖1。

圖1 3 組血清IL-1 含量比較

3.3 3 組腦組織病理形態(tài)變化 假手術(shù)組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)清晰完整，神經(jīng)細(xì)胞均勻分布，無異常；模型組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)排列紊亂，神經(jīng)元被破壞，出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、細(xì)胞核深染現(xiàn)象，同時(shí)大量炎性細(xì)胞貫穿腦組織；與模型組比較，栝樓桂枝湯組腦組織結(jié)構(gòu)均趨于正常，神經(jīng)細(xì)胞壞死顯著減少。見圖2。

圖2 3 組腦組織HE 染色圖（×400）

3.4 3組腦組織MHC-Ⅱ、Arg-1蛋白表達(dá)量比較 見圖3。

圖3 3 組腦組織MHC-Ⅱ、Arg-1 蛋白表達(dá)量比較

3.5 3 組腦組織Iba-1、MAP-2 蛋白表達(dá)水平比較 假手術(shù)組Iba-1 陽性表達(dá)較少，顏色較淺，MAP-2 陽性表達(dá)較多，顏色較深。與假手術(shù)組比較，模型組Iba-1 陽性表達(dá)明顯增多（P＜0.05），顏色為棕褐色；MAP-2 蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.05），并且神經(jīng)元細(xì)胞變小，排列不規(guī)則，棕黃色染色顆粒較少。與模型組比較，栝樓桂枝湯組Iba-1 陽性表達(dá)明顯降低（P＜0.05），MAP-2 陽性表達(dá)明顯提高（P＜0.05）。見圖4、圖5。

圖4 3 組腦組織Iba-1、MAP-2 免疫組化圖（×400）

圖5 3 組腦組織Iba-1、MAP-2 蛋白表達(dá)水平比較

4 討 論

越來越多的證據(jù)表明缺血后產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)是致病過程的重要促成因素［12］，缺血性卒中早期產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)會(huì)促進(jìn)腦梗死的發(fā)展，致使缺血半影區(qū)發(fā)生不可逆的損傷，加劇缺血再灌注損傷［13］。小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦的免疫調(diào)節(jié)器，在正常條件下不斷監(jiān)測(cè)大腦微環(huán)境［14-15］，它的活化在神經(jīng)炎癥的進(jìn)展中尤為重要［16］。腦缺血后引起的炎癥反應(yīng)會(huì)引起小膠質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化，即M1 型（促炎型）或M2型（修復(fù)型）2 種表型，小膠質(zhì)細(xì)胞活化后的M1 表型會(huì)產(chǎn)生損傷神經(jīng)的細(xì)胞因子，進(jìn)而加重神經(jīng)炎癥，引起神經(jīng)元細(xì)胞的損傷［17-18］，而M2 表型則會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的神經(jīng)保護(hù)介質(zhì)。腦卒中后壞死神經(jīng)細(xì)胞的清除以及腦梗死后神經(jīng)功能的恢復(fù)需要小膠質(zhì)細(xì)胞的活化［19］。

腦卒中后肢體痙攣歸屬于中醫(yī)學(xué)“痙病”范疇，病機(jī)為氣血陰陽失衡，筋脈失于濡養(yǎng)，因此治則當(dāng)以調(diào)和氣血陰陽、滋養(yǎng)筋脈為主。栝樓桂枝湯中天花粉清熱潤燥、濡潤筋脈；桂枝、白芍互用，酸甘化陰，具有通緩脈絡(luò)之效；大棗、生姜可資助脾胃之氣，促進(jìn)周身氣血運(yùn)化；甘草調(diào)和諸藥之性。諸藥互通互用，具有柔潤筋脈、解肌止痙的功效。臨床研究發(fā)現(xiàn)栝樓桂枝湯可改善中風(fēng)后肢體痙攣患者的肢體運(yùn)動(dòng)功能及生活活動(dòng)能力［1］。相關(guān)基礎(chǔ)研究也提示栝樓桂枝湯可以調(diào)控HIF-1α 信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)腦卒中后腦血管的再生，進(jìn)而緩解神經(jīng)細(xì)胞損傷、改善腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能缺損狀態(tài)［20］。本課題組前期研究也表明栝樓桂枝湯可改善腦缺血再灌注大鼠的運(yùn)動(dòng)功能障礙，可降低患側(cè)腦組織的炎癥反應(yīng)水平，抑制神經(jīng)元的凋亡，保護(hù)缺血半暗帶［21-23］。

Iba-1 也稱為同種異體移植炎癥因子，是細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白，參與活化小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞狀態(tài)相關(guān)的形態(tài)變化，是小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，可以反映小膠質(zhì)細(xì)胞的活化［24］。MAP-2 是神經(jīng)元特異性的細(xì)胞骨架蛋白，主要表達(dá)在軸突，能夠作為神經(jīng)細(xì)胞的表型標(biāo)記物，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元的形態(tài)、生長及功能密切相關(guān)，可以充分反應(yīng)神經(jīng)細(xì)胞的損傷［25］。本研究結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組Logna 評(píng)分明顯升高，血清IL-1含量明顯提高，病理形態(tài)顯示腦組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞及炎性細(xì)胞浸潤情況明顯，大鼠腦組織Iba-1 蛋白表達(dá)水平明顯提高，MAP-2 蛋白表達(dá)水平明顯降低，提示腦缺血再灌注模型大鼠炎癥反應(yīng)明顯。栝樓桂枝湯干預(yù)結(jié)束后，腦缺血再灌注大鼠Logna評(píng)分明顯降低，外周血IL-1 含量明顯減少，缺血側(cè)腦組織炎癥浸潤、神經(jīng)元損傷程度明顯改善，Iba-1蛋白表達(dá)水平明顯降低，MAP-2 蛋白表達(dá)水平明顯提高，提示栝樓桂枝湯能減輕腦卒中后的炎癥反應(yīng)，改善腦缺血再灌注大鼠卒中后的神經(jīng)功能缺損。

MHC-Ⅱ主要位于抗原提呈細(xì)胞上，能夠?qū)⒓?xì)胞外來抗原利用MHC-Ⅱ提呈給輔助細(xì)胞，激活免疫細(xì)胞，從而引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)，是M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞的常用標(biāo)記物［26］。Arg-1 為M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞最佳標(biāo)記物之一，可以通過促進(jìn)病原體的識(shí)別、結(jié)合和內(nèi)溶質(zhì)作用來介導(dǎo)抗炎反應(yīng)，主要受信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子6（STAT6）調(diào)控，因此是重要的抗炎因子，可抑制炎癥反應(yīng)并促進(jìn)機(jī)體修復(fù)［27］。本研究結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組MHC-Ⅱ蛋白表達(dá)量明顯升高，Arg-1 蛋白表達(dá)量明顯降低，提示腦缺血再灌注大鼠腦組織中M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)增多，M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)減少。與模型組比較，栝樓桂枝湯組MHC-Ⅱ蛋白表達(dá)量明顯降低，Arg-1 蛋白表達(dá)量明顯升高，提示栝樓桂枝湯可以促進(jìn)腦缺血再灌注大鼠腦組織中M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)，抑制M1 表型的表達(dá)。

綜上所述，栝樓桂枝湯可能通過調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化后的表型，即上調(diào)M2 表型，下調(diào)M1 表型，從而抑制炎癥反應(yīng)，改善腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)細(xì)胞損傷。但是，炎癥反應(yīng)涉及多種調(diào)控通路，級(jí)聯(lián)反應(yīng)復(fù)雜，栝樓桂枝湯通過調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化減弱缺血性腦卒中后炎性反應(yīng)，其機(jī)制是否涉及相應(yīng)調(diào)控通路，還需要進(jìn)一步研究。