清達(dá)顆粒對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓小鼠心臟損傷的保護(hù)作用

趙春雨，張 鈴，2，3，賈沛芝，王美玲，許瑤瑤，林浩偉，蔡巧燕，2，3*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)陳可冀學(xué)術(shù)思想傳承工作室，福建 福州 350122）

隨著飲食與生活結(jié)構(gòu)的改變，高血壓成為危害人類健康，引起心腦血管疾病不良預(yù)后的首要危險(xiǎn)因素［1］。當(dāng)機(jī)體長期處于高血壓狀態(tài)時(shí)，心臟會(huì)發(fā)生功能與結(jié)構(gòu)的病理性改變，形成心肌肥大或纖維化等心臟損傷，繼而可能引發(fā)心肌缺血、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、心力衰竭或心肌梗死等嚴(yán)重的并發(fā)癥［2-3］。因此，預(yù)防和控制高血壓是遏制我國心腦血管疾病流行的核心策略之一［4］。清達(dá)顆粒（Qingda granule，QDG）是陳可冀院士根據(jù)70 余年的臨床經(jīng)驗(yàn)方清眩降壓湯精簡(jiǎn)化裁而來［5］，主治高血壓證屬肝陽上亢所致的頭暈、頭痛、煩躁、失眠等癥狀。課題組前期研究顯示：QDG 能明顯降低血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）誘導(dǎo)的高血壓小鼠血壓，同時(shí)還能改善自發(fā)性高血壓大鼠的左心室功能并減輕其心臟炎癥反應(yīng)［5-6］。本研究以皮下埋入微量Ang Ⅱ泵誘導(dǎo)的高血壓小鼠模型作為研究對(duì)象，探討QDG 對(duì)高血壓小鼠心臟損傷的影響，為QDG 的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8 周齡雄性SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠30 只，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-000，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SYXK（閩）2019-0007。本實(shí)驗(yàn)已通過福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)審核（2019048）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 QDG 由天麻、鉤藤、黃芩和蓮子心4 味藥物組成（比例為12∶10∶6∶5），其顆粒劑由江陰天江藥業(yè)有限公司提供，產(chǎn)品批號(hào)：1805351，規(guī)格：5 g/袋。纈沙坦膠囊（Valsartane，Val）購自北京諾華制藥有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：H20040217。QDG和Val 均使用生理鹽水配制成藥液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 Ang Ⅱ（英國 Abcam 公司，貨號(hào)：ab120183）；肌酸激酶同工酶（CK-MB）、腦鈉肽（BNP）ELISA 試劑盒均購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司（貨號(hào)：MM-43703M2、MM-0060M2）；TRNzol（北京天根生化科技有限公司，貨號(hào)：DP424）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司，貨號(hào)：R211-02）；qPCR 試劑盒（普洛麥格生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：LS2068）；天狼星紅染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：G1472）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 Coda 血壓測(cè)量?jī)x（美國Kent Scientific 公司）；植入式膠囊滲壓泵（美國ALzet 公司）；7500 熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）；生物組織石蠟包埋儀（湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；石蠟切片機(jī)、偏振光顯微鏡均購自德國Leica 公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模 將30 只雄性C57BL/6 小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組、低劑量組、高劑量組和陽性組，每組6 只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，在小鼠兩側(cè)肩胛骨中間偏右做一長約1.5 cm 的橫行皮膚切口，使用剪刀沿皮下鈍性分離組織，游離至對(duì)側(cè)背部皮下，將滲透微型泵埋入至切口皮下，要求滲透微型泵開口朝向尾部，縫合切口，碘伏消毒。對(duì)照組小鼠植入預(yù)裝200 μL 生理鹽水的微型泵，模型組和給藥組小鼠植入預(yù)裝200 μL 的3 mg/mL Ang Ⅱ溶液微型泵，3 組均以0.25 μL/h 的速度釋放，均持續(xù)釋放28 d。術(shù)后小鼠出現(xiàn)收縮壓（SBP）≥140 mm Hg，提示高血壓小鼠模型成功建立［7］。

2.2 干預(yù)方法 于造模第2 天開始給藥干預(yù)。低、高劑量組分別按1.3、2.6 mg/（kg·d）給予QDG 藥液灌胃，陽性組按10.4 mg/（kg·d）給予Val 藥液灌胃，對(duì)照組和模型組按12 mL/（kg·d）給予生理鹽水灌胃，每日1 次，連續(xù)灌胃28 d。

2.3 血壓監(jiān)測(cè) 分別于造模后第0、7、14、21、28天檢測(cè)小鼠尾動(dòng)脈SBP 和舒張壓（DBP）。將小鼠裝進(jìn)固定器中，放于加熱板上加熱3 min，將大小合適的阻斷環(huán)和血壓檢測(cè)環(huán)套在小鼠尾部。設(shè)置好電腦上的Coda 軟件后開始測(cè)定，每只小鼠測(cè)定3 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)記錄20 次血壓數(shù)據(jù)，記錄所有小鼠的SBP、DBP。

2.4 取材 小鼠干預(yù)4周后，測(cè)定體質(zhì)量，異氟烷麻醉后取眼球靜脈血，靜置30 min，于4 ℃、3 000 r/min下離心 5 min，收集血清，隨后放置-80 ℃冰箱，用于ELISA 檢測(cè)。于冰上取心臟，拍照后觀察心臟形態(tài)并稱重，隨后將心臟橫向等分切割為3 份，取上下兩部分置于液氮中保存，用于qPCR 檢測(cè)，中間部分置于4% 多聚甲醛中固定，用于天狼星紅染色。

2.5 心重指數(shù)和心脛比 測(cè)量小鼠脛骨長度，計(jì)算心重指數(shù)和心脛比。

2.6 qPCR 檢測(cè)心臟組織ANP 和BNP mRNA 相對(duì)表達(dá)水平 取心臟組織加入TRNzol 提取RNA，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qPCR。引物由上海生工生物工程合成，見表1。以GAPDH 作為內(nèi)參，根據(jù)2-△△CT計(jì)算心鈉肽（ANP）和BNP 的mRNA 表達(dá)水平。

表1 引物序列

2.7 ELISA 檢測(cè)血清CK-MB、BNP 水平 將血清從-80 ℃冰箱取出，解凍后按照試劑盒說明書步驟操作，于波長450 nm 處分別檢測(cè)CK-MB、BNP 的A值，標(biāo)準(zhǔn)品濃度由低到高自左向右作X 軸，A 值作Y軸，用Logit-Log 直線回歸繪圖并求值。

2.8 天狼星紅法觀察心臟組織中膠原纖維表達(dá)情況 小鼠心臟組織于4%多聚甲醛中固定24 h 后，隨后依次置于70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ、石蠟Ⅲ進(jìn)行梯度脫水，然后包埋成石蠟塊。將心臟組織石蠟塊切成4 μm 薄片，于37 ℃水中攤開后置于載玻片上。60 ℃烤片2 h后倒序脫蠟，天狼星紅染液滴染1 h，然后蘇木素染核，風(fēng)干后用中性樹膠封片。偏振光顯微鏡下觀察并拍片，隨后用ImageJ 軟件分析心臟組織的天狼星紅染色平均熒光強(qiáng)度，平均熒光強(qiáng)度與膠原纖維表達(dá)量成正比。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，若方差齊，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；若方差不齊則采用Games-Howell 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 5 組造模前后血壓比較 應(yīng)用Ang Ⅱ溶液誘導(dǎo)7、14、21、28 d 后，模型組SBP、DBP 均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），給藥2 周后，各給藥組SBP、DBP較模型組明顯降低（P＜0.05），其中低、高劑量組SBP、DBP 比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與陽性組相當(dāng)。見表2、表3。

表2 5 組造模前后SBP 比較（±s）mm Hg

表2 5 組造模前后SBP 比較（±s）mm Hg

注：與對(duì)照組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

第28天118.60±6.26 172.95±3.911）137.42±1.762）133.56±8.502）135.75±6.542）組別對(duì)照組模型組低劑量組高劑量組陽性組n66666第0天115.43±5.82 113.51±11.15 116.43±5.82 117.50±4.12 113.10±5.37第7天117.66±4.28 157.09±7.721）153.36±8.79 143.40±9.61 153.42±9.02第14天120.47±4.60 164.84±5.271）141.34±5.232）139.04±5.552）138.81±6.672）第21天118.38±3.27 169.66±2.961）136.23±6.622）139.00±7.562）139.13±5.652）

表3 5 組造模前后DBP 比較（±s）mm Hg

注：與對(duì)照組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

第28天88.83±6.47 132.77±4.891）105.29±4.152）103.56±8.502）105.67±2.872）組別對(duì)照組模型組低劑量組高劑量組陽性組n66666第0天83.75±5.25 75.88±6.36 80.35±3.86 77.50±4.12 75.06±5.96第7天84.36±4.90 120.51±11.331）118.89±8.30 113.40±9.61 117.89±9.11第14天86.76±3.74 131.13±8.441）113.29±5.502）115.04±5.552）107.80±6.622）第21天86.34±3.62 131.83±7.921）108.33±8.332）109.01±7.562）108.65±5.732）

3.2 5組心臟形態(tài)、心重指數(shù)與心脛比比較 與對(duì)照組比較，模型組心臟組織明顯肥大，心重指數(shù)與心脛比均明顯提高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組心臟肥大情況明顯被抑制，心重指數(shù)及心脛比均明顯降低（P＜0.05），其中低、高劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與陽性組相當(dāng)。見圖1、圖2。

圖1 5 組心臟形態(tài)圖

圖2 5 組心重指數(shù)與心脛比比較

3.3 5 組心臟組織ANP、BNP mRNA 相對(duì)表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，模型組ANP、BNP mRNA 相對(duì)表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組mRNA 相對(duì)表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05），其中低、高劑量組mRNA 相對(duì)表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與陽性組相當(dāng)。見圖3。

圖3 5 組心臟組織ANP、BNP mRNA 相對(duì)表達(dá)水平比較

3.4 5 組血清CK-MB、BNP 含量比較 與對(duì)照組比較，模型組血清 CK-MB、BNP 含量均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組血清CK-MB、BNP含量均明顯降低（P＜0.05），其中低、高劑量組血清CK-MB、BNP含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與陽性組相當(dāng)。見表4。

表4 5 組血清CK-MB、BNP 含量比較 pg/mL

3.5 5 組心臟組織膠原纖維表達(dá)量比較 對(duì)照組膠原纖維表達(dá)較少，與對(duì)照組比較，模型組心臟組織的紅色或黃色Ⅰ型膠原纖維以及綠色Ⅲ型膠原纖維大面積表達(dá)（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組膠原纖維表達(dá)量明顯減弱（P＜0.05），其中低、高劑量組膠原纖維表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與陽性組相當(dāng)。見圖4、圖5。

圖4 5 組心臟組織平均熒光強(qiáng)度比較

圖5 5 組心臟組織天狼星紅染色圖（×40）

4 討 論

Ang Ⅱ作為腎素-血管緊張素-醛固酮（RAAS）系統(tǒng)的重要組成成分，在原發(fā)性高血壓的發(fā)病以及心臟損傷中發(fā)揮著重要作用［8］。心臟過度泵血時(shí)，持續(xù)性的壓力負(fù)荷會(huì)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞適應(yīng)性肥大，引起心肌肥厚。同時(shí)炎癥、RAAS 系統(tǒng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)等激活會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致微循環(huán)障礙，引起間質(zhì)冠狀動(dòng)脈周圍的彌漫性膠原纖維沉積，最終導(dǎo)致心肌纖維化［9-11］。高血壓導(dǎo)致的左心室肥厚、心肌彌漫性纖維化等心臟損傷［12］，是引發(fā)惡性心腦血管疾病的重要誘因［13-14］。

高血壓引起的心臟損傷，臨床表現(xiàn)為呼吸困難、心臟跳動(dòng)節(jié)律異常、胸悶、胸痛等，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其主要由正氣虧虛、情志失調(diào)、飲食不當(dāng)引起氣機(jī)瘀滯，日久化火，可歸屬“眩暈”“頭痛”“心悸”“胸痹”等范疇［2］。QDG 中天麻和鉤藤平肝潛陽、熄風(fēng)清熱；黃芩清肝熱；蓮子心泄心火。諸藥相合，共奏平肝潛陽、清泄心火、舒達(dá)肝氣之功效，能有效預(yù)防并減輕心、腦、腎等靶器官的損傷［15-17］。

ANP、BNP 是由心房肌細(xì)胞與心室肌細(xì)胞合成并分泌的肽類激素，其主要作用是使血管平滑肌舒張和促進(jìn)腎臟排鈉、排水。當(dāng)心臟泵血過多導(dǎo)致心房壁受牽拉時(shí)，則會(huì)刺激細(xì)胞釋放ANP、BNP［18-21］。ANP、BNP 與心臟壓力和容量負(fù)荷的增加有關(guān)，其表達(dá)升高可作為評(píng)估心肌肥厚和心功能損傷的有效指標(biāo)之一［22-23］。CK-MB 是一種細(xì)胞內(nèi)酶，多存在于心肌細(xì)胞內(nèi)，可以敏感反映心肌損傷情況［24］。本研究通過Ang Ⅱ溶液誘導(dǎo)C57BL/6 小鼠，成功建立高血壓小鼠模型。結(jié)果顯示：經(jīng)Ang Ⅱ溶液誘導(dǎo)下，模型組小鼠SBP、DBP 明顯升高，心重指數(shù)與心脛比明顯增加，心臟組織ANP、BNP mRNA 相對(duì)表達(dá)水平明顯升高，血清CK-MB、BNP 的含量也明顯增加，且心臟組織經(jīng)天狼星紅染色后可見膠原纖維表達(dá)量增多，提示小鼠經(jīng)Ang Ⅱ溶液刺激后會(huì)造成血壓升高和心肌肥大纖維化等心臟損傷。而經(jīng)藥物干預(yù)后，小鼠SBP、DBP 均明顯降低，ANP、BNP mRNA 相對(duì)表達(dá)水平明顯降低，血清CK-MB 和BNP 含量明顯降低，心臟膠原纖維表達(dá)量明顯減少，提示低、高劑量QDG 均能明顯降低血壓，抑制心肌細(xì)胞肥大和纖維化，改善心臟損傷。

綜上所述，QDG 能有效改善高血壓引起的心臟損傷，效果與纈沙坦相當(dāng)，但本研究沒有體現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，低、高劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，后續(xù)進(jìn)一步研究QDG 的藥物劑量依賴實(shí)驗(yàn)時(shí)，要增大高、低劑量間的倍數(shù)。今后將結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及測(cè)序方法繼續(xù)探討QDG 調(diào)控心臟肥大和纖維化的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制。