基于NLRP3/Caspase-1和Wnt/β-catenin信號(hào)通路探討桃核承氣湯延緩慢性腎衰竭大鼠腎纖維化的機(jī)制

朱為坤，張喜奎，宋昱嬌，蘇明星，李靈輝

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)圖書館，福建 福州 350122）

慢性腎衰竭（chronic renal failure，CRF）是慢性腎臟疾病（chronic kidney disease，CKD）及腎臟相關(guān)性疾病的惡化趨勢［1］。腎纖維化是各種腎臟疾病發(fā)展至終末期腎衰竭的共同病理表現(xiàn)，包括腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）［2］。細(xì)胞焦亡是近年新發(fā)現(xiàn)的一種促炎性程序性細(xì)胞死亡方式，參與腎纖維化過程［3］。NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）寡聚，可誘導(dǎo)半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）活化，激活細(xì)胞焦亡途徑，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（IL）-18 和IL-1β 的活化［4］。Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)通路可通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶-7（matrix metalloproteinase-7，MMP-7）引發(fā)腎纖維化［5］。腎纖維化的中醫(yī)病機(jī)是“本虛標(biāo)實(shí)”，本虛在于腎、脾，標(biāo)實(shí)在于瘀、濁毒、痰濕，而“瘀”貫穿始終［6］。前期研究發(fā)現(xiàn)：桃核承氣湯能減輕CRF 大鼠腎微炎癥狀態(tài)，改善腎纖維化，延緩CRF 發(fā)展進(jìn)程［7］，其機(jī)制可能與調(diào)控腎的轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）/Smad和Wnt/β-catenin 信號(hào)通路有關(guān)［8-12］，但該方是否對(duì)NLRP3/Caspase-1細(xì)胞焦亡通路有影響，尚不明確。本研究以5/6 腎切除大鼠CRF 模型為載體，研究桃核承氣湯對(duì)CRF 大鼠NLRP3/Caspase-1 細(xì)胞焦亡通路及Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的影響，探討該方治療CRF 腎纖維化的可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性7周齡Wistar大鼠80只，體質(zhì)量180～220 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（閩）2020-0002。大鼠自由進(jìn)食與飲水，飼養(yǎng)環(huán)境的溫度為（22±1）℃，濕度為50%，每天光照時(shí)間12 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 桃核承氣湯由桃仁12 g，生大黃（后下）12 g，桂枝6 g，炙甘草6 g，芒硝（沖服）6 g 組成，由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院提供中藥飲片，煎煮并濃縮成生藥量為42 g/100 mL 的桃核承氣湯藥液。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 注射用青霉素鈉（江西科達(dá)動(dòng)物藥業(yè)有限公司）；水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司）；NLRP3 抗體（批號(hào)：A00034-2）、IL-1β 抗體（批號(hào)：A00101-1）均購自武漢博士德生物技術(shù)公司；Caspase-1 抗體（批號(hào)：22915-1-AP）、IL-18 抗體（批號(hào)：1063-1-AP）、Wnt4 抗體（批號(hào)：14371-1-AP）、β-catenin 抗體（批號(hào)：66379-1-lg）、MMP-7 抗體（批號(hào)：10374-2-AP）均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；GAPDH 抗體（美國proteintech 公司，批號(hào)：60004-1-ig）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：R123-01）、qPCR 試劑盒（貨號(hào)：Q311-02）均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 pocH-100i 血液分析儀（日本Sysmex 公司）；JXFTPRP-48 研磨機(jī)（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；DYCP-31DN 瓊脂糖水平電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Alpha 公司）；ND-100c 超微量紫外可見分光光度計(jì)、MV-C155-ov71 梯度PCR 儀均購自杭州米歐儀器有限公司；UC-6 超薄切片機(jī)（德國Leica 公司）；正置光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；H-7650 透射電子顯微鏡（日本Hitachi 公司）；VELETA 電鏡圖像采集分析系統(tǒng)（德國EMSIS 公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模 將80 只Wistar 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、假手術(shù)組、模型組和治療組，每組20 只。模型組與治療組均行5/6 腎切除手術(shù)［13］，用10%水合氯醛于大鼠腹腔內(nèi)注射，麻醉后俯臥位固定在鼠臺(tái)上，手術(shù)切除2/3的左腎組織，術(shù)后注射青霉素3 d；1 周后進(jìn)行第2 次手術(shù)，切除全右腎，同樣予青霉素注射3 d。假手術(shù)組手術(shù)過程同模型組，但不切除腎組織，僅做雙腎被膜剝離；正常組不予任何處理。術(shù)后3 周進(jìn)行眼底靜脈叢采血檢測肌酐（Scr），若Scr 水平明顯增高，提示造模成功。造模過程中，共12 只大鼠死亡，其中假手術(shù)組2 只（麻醉過量）、模型組5 只（麻醉過量2 只、大出血2 只、傷口感染1 只）、治療組5 只（麻醉過量1 只、大出血2 只、傷口感染2 只）。

2.2 給藥干預(yù) 術(shù)后4 周開始進(jìn)行干預(yù)，治療組按10 mL/（kg·d）給予42 g/100 mL 桃核承氣湯藥液灌胃，正常組、假手術(shù)組和模型組分別給予等體積生理鹽水灌胃，每日1 次，均連續(xù)灌胃8 周。每周對(duì)大鼠進(jìn)行稱重，并根據(jù)最新體質(zhì)量調(diào)整藥量。假手術(shù)組因灌胃不當(dāng)死亡1 只；模型組因腎衰竭死亡3 只。

2.3 取材 灌胃8周后，用10%水合氯醛于大鼠腹腔內(nèi)注射，麻醉后采集腹主動(dòng)脈血液，取3 mL血樣置于不加任何抗凝劑的試管中靜置，在4 ℃、3 000 r/min下離心10 min，吸取上層血清，置于-80 ℃冰箱中保存。采血后，取出大鼠左腎（模型組和治療組為左殘余腎，正常組和假手術(shù)組取左腎并切取相對(duì)應(yīng)的部位），將其置于冰上沿腎長軸切割為2 份，用生理鹽水沖洗后，一部分放入凍存管并儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱，用于Western blot 和qPCR 檢測；另一部分切成1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm 大小的組織塊，置于10%中性福爾馬林溶液中固定，用于光鏡和透射電鏡觀察。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 一般情況 開始給藥起每天觀察并記錄4 組大鼠的一般情況，包括精神活動(dòng)情況、反應(yīng)性、被毛顏色及光澤度、飲食及二便情況等，每周稱量大鼠體質(zhì)量。

2.4.2 腎功能指標(biāo)檢測 從冰箱中取出血清，采用全自動(dòng)生化分析儀按照試劑說明書檢測Scr、尿素氮（BUN）含量。

2.4.3 光鏡觀察 將大鼠腎組織修剪后置入脫水機(jī)脫水，石蠟包埋，而后切成每片厚2 μm 的薄片，置于載玻片上，于60 ℃恒溫箱烤片1 h，進(jìn)行HE 染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察腎組織形態(tài)。

2.4.4 透射電鏡觀察 將大鼠腎組織切成1 mm×1 mm×1 mm 的組織塊，投入2.5%戊二醛及1%鋨酸中雙重固定，乙醇、丙酮梯度脫水，Epon812 環(huán)氧樹脂包埋，LKB 超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾、檸檬酸鋁雙重染色，透射電鏡下觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)。

2.4.5 Western blot 檢測腎組織通路相關(guān)蛋白表達(dá)量 提取各組腎組織總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，經(jīng)蛋白變性、電泳、轉(zhuǎn)膜后TBST 溶液清洗，室溫封閉1 h，置于NLRP3（1∶1 000）、Caspase-1（1∶1 000）、IL-1β（1∶1 000）、IL-18（1∶1 000）、Wnt4（1∶1 000）、β-catenin（1∶1 000）、MMP-7（1∶1 000）和GAPDH（1∶10 000）抗體中4 ℃搖床孵育過夜。TBST 溶液清洗，加入相應(yīng)HRP 標(biāo)記的二抗（1∶2 000），搖床室溫孵育1 h。TBST 溶液清洗，暗室中滴加ECL 發(fā)光劑于膜上，經(jīng)曝光、顯影、定影，采用Quantity One 圖像分析系統(tǒng)檢測各目的蛋白光密度值，以GAPDH 為內(nèi)參，對(duì)比分析各目的蛋白表達(dá)量。

2.4.6 qPCR 檢測腎組織通路相關(guān)mRNA 相對(duì)表達(dá)水平 提取腎臟組織總RNA，檢測RNA 濃度。配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、試劑進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。相關(guān)基因引物序列由上海鉑尚生物工程有限公司設(shè)計(jì)，見表1。各取2 μL PCR 產(chǎn)物于實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀進(jìn)行qPCR 反應(yīng)，檢測各組樣本的mRNA含量。計(jì)算并分析各組樣本及內(nèi)參的2-ΔΔCT值。

表1 相關(guān)基因引物序列

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0 軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊采用LSD-t法，方差不齊采用Games-Howell法。檢驗(yàn)水平α=0.05。

3 結(jié) 果

3.1 4 組一般情況觀察 正常組和假手術(shù)組大鼠精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏，皮毛有光澤，能正常進(jìn)食、飲水，二便正常；模型組大鼠精神較為萎靡，反應(yīng)遲鈍，體質(zhì)量增長緩慢，體毛干枯、無光澤且易脫落；治療組大鼠各項(xiàng)情況介于正常組和模型組之間。

3.2 4 組血清Scr、BUN 含量比較 見表2。

表2 4 組血清Scr、BUN 含量比較（±s）

表2 4 組血清Scr、BUN 含量比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與假手術(shù)組比較，2） P＜0.05；與模型組比較，3） P＜0.05。

BUN/（mmol/L）7.42±0.91 7.87±1.28 25.84±8.431）2）11.84±1.943）組別正常組假手術(shù)組模型組治療組n 20 17 12 15 Scr/（μmol/L）42.96±5.77 42.43±5.57 132.29±17.551）2）71.05±10.773）

3.3 4 組大鼠腎組織組織形態(tài)比較 正常組和假手術(shù)組腎組織形態(tài)及結(jié)構(gòu)完整，均未見腎小球、腎小管及間質(zhì)的病理改變。模型組腎小球數(shù)量減少，腎組織結(jié)構(gòu)紊亂，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，腎小球結(jié)構(gòu)固縮，基膜增厚，腎小管擴(kuò)張，腎間質(zhì)纖維增生嚴(yán)重。治療組病理改變程度介于正常組和模型組之間。見圖1。

圖1 4 組腎組織HE 染色圖（×400）

3.4 4 組大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)比較 正常組和假手術(shù)組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞及各級(jí)足突細(xì)胞排列整齊，未見系膜及基底膜增生，未見沉積物，足突未見融合；細(xì)胞核完整，線粒體嵴明顯，且分布均勻；腎小管上皮細(xì)胞完整，微絨毛均勻分布。模型組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞水腫，足突廣泛融合，系膜及基底膜增生肥厚，可見沉淀物沉積；細(xì)胞核變形固縮，線粒體嵴模糊，結(jié)構(gòu)不完整；腎小管上皮細(xì)胞水腫，細(xì)胞形態(tài)排列紊亂，微絨毛分布不均或脫落，大量炎癥細(xì)胞浸潤。與模型組比較，治療組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞水腫減輕，足突融合減少，系膜及基底膜輕度增生，有少量沉淀物；大部分細(xì)胞核完整，線粒體嵴輕度模糊。見圖2。

圖2 4 組腎組織雙重染色電鏡圖（×10 000）

3.5 4 組大鼠腎組織通路相關(guān)蛋白表達(dá)量比較 與正常組和假手術(shù)組比較，模型組腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、Wnt4、β-catenin 和MMP-7 蛋白表達(dá)量均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，治療組腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、Wnt4、β-catenin 和MMP-7 蛋白表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05）。見表3、圖3。

圖3 4 組大鼠腎組織通路相關(guān)蛋白條帶圖

表3 4 組大鼠腎組織通路相關(guān)蛋白表達(dá)量比較（±s）

表3 4 組大鼠腎組織通路相關(guān)蛋白表達(dá)量比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與假手術(shù)組比較，2） P＜0.05；與模型組比較，3） P＜0.05。

組別正常組假手術(shù)組模型組治療組MMP-7 0.058±0.018 0.071±0.017 0.947±0.0161）2）0.567±0.0773）n 20 17 12 15 NLRP3 0.373±0.042 0.382±0.044 0.952±0.0331）2）0.656±0.1373）Caspase-1 0.151±0.011 0.159±0.023 0.605±0.0271）2）0.368±0.0113）IL-1β 0.326±0.045 0.324±0.042 0.803±0.0411）2）0.528±0.0023）IL-18 0.247±0.007 0.244±0.012 0.740±0.0431）2）0.520±0.0283）Wnt4 0.230±0.059 0.253±0.062 1.092±0.0971）2）0.734±0.0323）β-catenin 0.169±0.025 0.170±0.029 0.592±0.0721）2）0.343±0.0113）

3.6 4 組大鼠腎組織通路相關(guān)mRNA 相對(duì)表達(dá)水平比較 與正常組和假手術(shù)組比較，模型組NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、Wnt4、β-catenin 和MMP-7mRNA 相對(duì)表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，治療組NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、Wnt4、β-catenin 和MMP-7 mRNA相對(duì)表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05）。見表4。

表4 4 組大鼠腎組織通路相關(guān)mRNA 相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）

表4 4 組大鼠腎組織通路相關(guān)mRNA 相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與假手術(shù)組比較，2） P＜0.05；與模型組比較，3） P＜0.05。

MMP-7 1.00±0.09 1.03±0.18 2.33±0.311）2）1.36±0.133）組別正常組假手術(shù)組模型組治療組n 20 17 12 15 NLRP3 1.00±0.05 1.04±0.17 3.52±0.371）2）1.68±0.213）Caspase-1 1.00±0.07 1.04±0.16 3.50±0.411）2）1.99±0.223）IL-1β 1.00±0.10 0.96±0.15 3.61±0.391）2）1.69±0.143）IL-18 1.00±0.06 1.03±0.14 3.22±0.421）2）1.89±0.203）Wnt4 1.01±0.10 1.00±0.19 2.19±0.221）2）1.57±0.123）β-catenin 1.00±0.08 1.03±0.12 2.59±0.281）2）1.78±0.143）

4 討 論

CRF 的病理過程存在高凝狀態(tài)，與凝血因子水平異常和血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、抗凝系統(tǒng)等功能異常相關(guān)，“瘀”貫穿腎纖維化的全過程［6］。桃核承氣湯出自《傷寒論》，主治瘀熱結(jié)于下焦證，臨床上可見少腹疼痛、脹滿、拘急和煩躁不安、如狂等癥狀。方中桃仁活血祛瘀、潤腸通便；大黃瀉下攻積、清熱瀉火解毒、化瘀止血，二者合用，氣血通行，使瘀熱從下而走，共為君藥；芒硝可助大黃泄熱通便；桂枝可助桃仁活血化瘀、通利血脈，又防大黃、芒硝苦寒太過，二者為臣；炙甘草為佐使，既可調(diào)和諸藥，又能補(bǔ)中護(hù)中。全方共奏活血化瘀、通腑泄?jié)嶂ΑＥR床研究發(fā)現(xiàn)：桃核承氣湯聯(lián)合西醫(yī)常規(guī)療法輔助治療早中期CRF 能改善中醫(yī)癥狀和腎功能，較單純應(yīng)用西醫(yī)常規(guī)治療的療效更好［14］。

細(xì)胞焦亡主要依賴Caspase 蛋白酶、細(xì)胞腫脹破裂、炎性因子（如IL-1β、IL-18）外釋引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)等，造成細(xì)胞的損傷。研究表明：在腎臟非免疫性實(shí)質(zhì)細(xì)胞中，小管上皮細(xì)胞可通過激活NLRP3 炎性體表達(dá)和釋放IL-18［15］，導(dǎo)致炎性反應(yīng)和焦亡。在缺血再灌注大鼠模型中，焦亡相關(guān)蛋白Caspase-1 和IL-1β 顯著上調(diào)，證實(shí)了焦亡發(fā)生于腎小管上皮細(xì)胞［16］，NLRP3/Caspase-1 通路的激活，會(huì)引起腎細(xì)胞焦亡。本研究結(jié)果顯示：桃核承氣湯能降低CRF 大鼠Scr、BUN 水平，改善腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，保護(hù)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞及其細(xì)胞核、線粒體，保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞及其微絨毛，減少炎癥細(xì)胞浸潤，減輕腎小球硬化及RIF；治療組腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和IL-18 蛋白表達(dá)量及其mRNA相對(duì)表達(dá)水平較模型組均明顯降低，提示桃核承氣湯可能通過調(diào)控NLRP3/Caspase-1 通路來阻斷細(xì)胞焦亡，延緩腎纖維化。

腎纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），Wnt/β-catenin 信號(hào)通路影響EMT 的過程［17］。Wnt 蛋白通過激活下游的各種因子促進(jìn)目的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，引起β-catenin 降解減少，產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)成分，促進(jìn)EMT 的發(fā)生與發(fā)展，觸發(fā)管狀上皮細(xì)胞向間充質(zhì)過渡或衰老，并促進(jìn)腎纖維化［18-19］。β-catenin 蛋白可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡［20-21］，促進(jìn)RIF。Wnt/β-catenin 途徑可通過調(diào)節(jié)MMP-7 的表達(dá)而破壞腎小管上皮細(xì)胞基底膜，推進(jìn)細(xì)胞遷移，促使腎小管間質(zhì)纖維化進(jìn)展［22］。腎纖維化的中醫(yī)病機(jī)為“虛、濕、瘀、毒”，其形成的中醫(yī)微型癥積與Wnt/β-catenin 信號(hào)通路激活后導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積引起腎纖維化形成的病理過程極其相似［23］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與模型組比較，治療組腎組織中Wnt4、β-catenin 和MMP-7 蛋白表達(dá)量及其mRNA 相對(duì)表達(dá)水平均明顯降低，提示桃核承氣湯還可能通過抑制Wnt4、β-catenin 和MMP-7等因子來調(diào)控Wnt/β-catenin 通路，減輕腎纖維化。

綜上，桃核承氣湯可減輕CRF 大鼠腎臟炎癥，改善腎功能和腎纖維化，其機(jī)制可能與調(diào)控NLRP3/Caspase-1 細(xì)胞焦亡通路和Wnt/β-catenin 信號(hào)通路有關(guān)。