氧化-堿化聯(lián)合活化腐植酸機(jī)制及其對(duì)氮素利用率的影響

沈玉文 李國(guó)棟 林海濤 高文勝 劉兆輝*

1 養(yǎng)分資源高效利用全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部廢棄物基質(zhì)化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省環(huán)保肥料工程技術(shù)研究中心，山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所 濟(jì)南 250100

2 山東省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心 濟(jì)南 250014

近年來(lái)，為了提高風(fēng)化煤中腐植酸的提取效率，并賦予腐植酸鹽其他功能，有研究者對(duì)活化技術(shù)做了進(jìn)一步改進(jìn)，如采用氫氧化鈉和尿素為活化劑制成的腐植酸脲溶液對(duì)肥料進(jìn)行包膜來(lái)制備緩控釋肥料[1]，不但顯著提高了腐植酸的提取率，而且大大降低了氫氧化鈉的用量。此活化技術(shù)的不足之處是，僅將大部分的游離態(tài)腐植酸轉(zhuǎn)化為溶于水的腐植酸鹽，并沒(méi)有顯著提高腐植酸含氧官能團(tuán)數(shù)量，對(duì)風(fēng)化煤活化效果低于氧化法效果[2]。因此，我們準(zhǔn)備采用氧化和堿化法聯(lián)合的方式對(duì)風(fēng)化煤進(jìn)行活化，以顯著提高其水溶性腐植酸含量。

本文采用氧化-堿化聯(lián)合方法活化風(fēng)化煤來(lái)提高水溶性腐植酸含量并明確其活化機(jī)制，進(jìn)一步與尿素結(jié)合得到一種活性腐植酸緩釋肥料——腐植酸尿素，通過(guò)結(jié)構(gòu)表征、土壤培養(yǎng)試驗(yàn)、淋洗等手段明確氧化-堿化聯(lián)合活化腐植酸產(chǎn)品對(duì)提高氮素利用率效果的影響，并進(jìn)一步探討其增效機(jī)理。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選取的風(fēng)化煤來(lái)自內(nèi)蒙古烏海市，粒度小于10 目，含水量約15 ～20 wt%，總腐植酸含量為72.5 wt%，其中的水溶性腐植酸含量為5 wt%。

供試土壤采集于黃河下游濟(jì)陽(yáng)地區(qū)的沖積土，土壤類(lèi)型為潮土。從0 ～20 cm 深度的不同位置隨機(jī)采集土壤樣本，并匯集形成復(fù)合土壤樣本。土壤樣本被放在塑料袋中，用冷卻器送回實(shí)驗(yàn)室，在進(jìn)一步分析之前通過(guò)2 mm 尼龍篩。供試潮土的物理化學(xué)性質(zhì)見(jiàn)表1。

表1 潮土物理化學(xué)性質(zhì)Tab.1 Physical and chemical properties of tidal soil

1.2 活化腐植酸材料及腐植酸尿素制備

將風(fēng)化煤、8 mol/L 濃硝酸和KOH 固體按重量比為1 ∶0.2 ∶0.1 的比例混合，得到混合料，然后將混合料與水按重量比1 ∶0.3 的比例攪拌均勻后置于180 ℃陳化12 h，然后冷卻、干燥、粉碎，得到活性腐植酸。

將活性腐植酸和尿素以1 ∶3 的重量比混合，再在120 ～130 ℃熔融，冷卻后制備出腐植酸尿素產(chǎn)品。

1.3 腐植酸活化前后結(jié)構(gòu)及熱力學(xué)性質(zhì)表征

采用傅里葉紅外光譜儀（FT-IR，VERTEX-70/70v，德國(guó)布魯克光學(xué)公司）獲得400 ～4000 cm-1波長(zhǎng)范圍內(nèi)非常細(xì)的粉末樣品的FT-IR 光譜。

采用熱重分析法（TG，DSC 250）測(cè)定不同物質(zhì)的熱量和質(zhì)量的準(zhǔn)確變化。將樣品加入鋁鍋中，在試驗(yàn)過(guò)程中密封。在25 ～500 ℃的溫度范圍內(nèi)，以10 ℃/min 的加熱速率（由液氮控制）記錄TG譜圖。

1.4 土壤理化性質(zhì)及酶活性表征

將112 組風(fēng)干土樣（各200 g）分別放入300 mL塑料容器中，與去離子水混合，使土壤持水率達(dá)到40%。所有容器都覆蓋有10 個(gè)孔的塑料薄膜，以允許氣體交換，同時(shí)將水分損失降至最低。這些樣品在25 ℃下預(yù)培養(yǎng)1 周，以減少由于試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)干燥土壤的復(fù)濕而引起的微生物活性變化。平衡期結(jié)束后，建立4 個(gè)處理，分別為不施氮肥（CK）、尿素（U）、腐植酸（F，0.278 mg HA/g 土壤）和腐植酸尿素（FU）。U 和FU 處理氮素濃度一致，均為500 μg N/g 土壤。在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，每4天補(bǔ)充一次水分，使土壤含水量保持在土壤持水量的60%左右。采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，評(píng)估4 組土壤理化和微生物特性的顯著差異。所有土壤樣品在25 ℃下培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第0、1、3、7、15、30和90 d 測(cè)定脲酶活性和理化性質(zhì)。

采用自動(dòng)流動(dòng)注射分析儀（Foss FIA 5000，丹麥）測(cè)定土壤樣品中硝態(tài)氮（NO3--N）和銨態(tài)氮（NH4+-N）含量；用96 孔微孔板法測(cè)定土壤樣品的酶活性[3，4]；以尿素為底物，測(cè)定脲酶活性；在578 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定了光強(qiáng)。

1.5 土壤室內(nèi)淋洗試驗(yàn)

主體是PVC 管柱、土柱、定制不銹鋼架。玻璃柱的內(nèi)徑、外徑和高分別為11、12、50 cm。在淋溶柱底部放置濾紙和1 層200 目的濾布。每柱中裝入4 kg 過(guò)2 mm 篩后的風(fēng)干土壤的土肥混合物。淋溶時(shí)用醫(yī)用輸液管，減緩水在土壤中的滲透速度增強(qiáng)淋溶的效果，加水時(shí)可起到緩沖作用，以防止土壤沖散影響淋溶效果。

采用間歇淋溶法，淋溶前加1200 mL 水使土壤水分接近飽和持水量，室溫下放置1 d，使土肥充分混合。首次淋溶加入500 mL 水，收集24 h 淋溶液，每次淋溶過(guò)程相同，在培養(yǎng)第2、8、14、20 和26 d 時(shí)進(jìn)行連續(xù)5 次淋溶。

1.6 數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016 匯總整理后，采用方差分析法（ANOVA）研究了不同處理對(duì)土壤理化性質(zhì)和酶活性的影響。采用Duncan 試驗(yàn)來(lái)確定不同處理方法之間的差異。用OriginPro 8.0 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 活化前后腐植酸含量變化

與傳統(tǒng)堿化活化方法相比（表2），采用氧化-堿化聯(lián)合活化方法可使風(fēng)化煤中水溶性腐植酸鹽的活化率提高26%～38%，提取的大部分水溶性腐植酸鹽在陳化12 h 后仍能穩(wěn)定存在，不僅顯著提高了水溶性腐植酸含量，還解決了氨化法效果不穩(wěn)定的問(wèn)題，便于后續(xù)的肥料造粒工藝。

表2 風(fēng)化煤中水溶性腐植酸提取量Tab.2 Extraction amount of water soluble humic acid from weathered coal

2.2 活化前后腐植酸結(jié)構(gòu)及熱力學(xué)性質(zhì)分析

濃硝酸作用下，風(fēng)化煤中芳核上氫可以被硝基離子取代而硝化，從而提高活化后風(fēng)化煤水溶性腐植酸含量，但風(fēng)化煤中羧基含量較多，羧基無(wú)法被硝化，但可通過(guò)加入KOH，生成羧酸鹽的方式提高水溶性腐植酸鹽的含量。在氧化-堿化聯(lián)合作用下，風(fēng)化煤中腐植酸在活化前后必定產(chǎn)生官能團(tuán)變化以及隨之而來(lái)的熱力學(xué)穩(wěn)定性變化。因此，我們采用FT-IR 和TG 分析表征了風(fēng)化煤中腐植酸活化前后官能團(tuán)及熱力學(xué)穩(wěn)定性變化，并進(jìn)一步明確活化后腐植酸水溶性提高的原因。

2.2.1 活化前后腐植酸FT-IR

采用氧化-堿化聯(lián)合方法活化前后腐植酸FT-IR 如圖1 所示?；罨螅瑯悠返腇T-IR 發(fā)生了多處顯著變化，證明活化后腐植酸分子結(jié)構(gòu)變化顯著。如圖1b，在3694.87 cm-1新出現(xiàn)的峰為硝酸氧化下與腐植酸分子形成伯胺或伯酰胺的N-H 伸縮振動(dòng)峰；在2919.04 和2849.98 cm-1處新出現(xiàn)的峰為羧酸羥基伸縮振動(dòng)峰，說(shuō)明硝酸氧化后，不僅硝酸中的氮進(jìn)入了腐植酸分子中，腐植酸分子中羧基數(shù)量顯著增加，這也是活化后水溶性腐植酸含量顯著增加的重要原因。在圖1b 中新出現(xiàn)在1191.08、1107. 81 和1034.10 cm-1處的峰均屬于C-N 拉伸振動(dòng)峰，證明硝酸中的氮不僅與腐植酸分子端基發(fā)生反應(yīng)，還進(jìn)一步進(jìn)入了腐植酸碳鏈中。

圖1 氧化-堿化聯(lián)合活化前（a）和活化后（b）腐植酸FT-IRFig.1 FT-IR of humic acid before (a) and after (b) activation by oxidation-alkalization combination

2.2.2 活化前后腐植酸熱力學(xué)性質(zhì)變化

采用氧化-堿化聯(lián)合方法活化前后TG 分析曲線如圖2 所示。圖2a 中，在35 ～298 ℃范圍產(chǎn)生23.61%的失重量，主要是由風(fēng)化煤中水分喪失造成，在298 ～500 ℃產(chǎn)生16.03%的熱失重，主要是由于有機(jī)分子鏈脫氫和氨基、羰基和烷氧基官能團(tuán)的分解所致。圖2b 中，發(fā)現(xiàn)有機(jī)分子鏈脫氫和氨基、羰基和烷氧基官能團(tuán)的熱失重起始溫度降低到220 ℃，說(shuō)明活化后腐植酸分子熱穩(wěn)定性降低，很可能是活化后腐植酸分子量減小導(dǎo)致的。

圖2 氧化-堿化聯(lián)合活化前（a）和活化后（b）TG 分析曲線Fig.2 TG analysis curves before (a) and after (b) activation by oxidation-alkalization combination

綜上所述，活化后腐植酸分子由原來(lái)的大分子變?yōu)槎鄠€(gè)小分子，胺基、羧基、羥基等親水官能團(tuán)增多，氮原子不僅進(jìn)入端基，也進(jìn)入了分子碳鏈，從而提高了水溶性腐植酸含量。

2.3 腐植酸尿素對(duì)土壤脲酶活性影響

脲酶是一種催化尿素水解生成氨和碳酸鹽的酶。大量研究表明，脲酶活性與合成氮肥的施用量成反比[5]。脲酶活性的降低可以解釋為硝化和反硝化作用的激活抑制了脲酶的產(chǎn)生[6]。氮肥對(duì)脲酶活性的抑制作用可能是由于最終產(chǎn)物NH4+-N所致。

Bollmann 等[7]曾報(bào)道，褐煤作為腐植酸的原料摻入土壤抑制了土壤中的脲酶活性。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著尿素與活化后腐植酸結(jié)合成腐植酸尿素產(chǎn)品的施入，土壤中的脲酶活性顯著降低。如圖3 所示，向土壤單施尿素，會(huì)顯著抑制土壤中脲酶活性，而施用腐植酸尿素處理（FU），土壤脲酶活性比單施尿素處理還要低，說(shuō)明施用腐植酸尿素產(chǎn)品具有緩釋氮肥的效果。

圖3 4 種處理土壤脲酶活性隨時(shí)間變化趨勢(shì)Fig.3 Variation trend of soil urease activity under four treatments with time

2.4 腐植酸尿素對(duì)土壤氮素淋溶影響

尿素施入土壤后，在脲酶的作用下水解為銨態(tài)氮，并進(jìn)一步被土壤中硝化細(xì)菌氧化成硝態(tài)氮。由于土壤帶負(fù)電，因此對(duì)硝態(tài)氮不會(huì)產(chǎn)生吸附作用，大量的硝態(tài)氮會(huì)通過(guò)土壤淋溶作用進(jìn)入地下水，產(chǎn)生嚴(yán)重的地下水硝酸鹽污染，是引起農(nóng)業(yè)面源污染的重要原因。近年來(lái)，科學(xué)家們通過(guò)多種途徑提高氮素利用率，減少氮素淋溶[8~13]，本研究將腐植酸尿素產(chǎn)品替代傳統(tǒng)尿素進(jìn)行農(nóng)業(yè)生產(chǎn)就是一種有效減少土壤氮素淋溶的方法。

圖4 、圖5 顯示的是土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮淋溶量隨時(shí)間變化趨勢(shì)。結(jié)果表明，與單施尿素相比，施用腐植酸尿素產(chǎn)品可以顯著降低土壤NH4+-N 和NO3--N 含量。初步認(rèn)為是腐植酸尿素抑制脲酶（圖3）和尿素與腐植酸之間的化學(xué)反應(yīng)（氫鍵等）的結(jié)果[14]，二者都可以降低尿素水解。腐植酸具有豐富的羧基、羥基和酚羥基，可以提供大量的陽(yáng)離子交換位點(diǎn)來(lái)保留NH4+[15]。因此，腐植酸尿素處理的土壤中，NH4+-N 淋出量遠(yuǎn)低于僅施用尿素處理的土壤，它還具有減少土壤中NH3揮發(fā)的潛力。4 個(gè)處理中土壤NO3--N 淋出量均在培養(yǎng)的第7 天達(dá)到最大值。單施尿素土壤中NO3--N 淋出量在幾乎所有處理中最高，施用腐植酸尿素處理NO3--N 淋出量顯著低于尿素處理。在腐植酸尿素處理中，NH4+-N 轉(zhuǎn)化為NO3--N 的速率降低，這是由于NH4+-N 在腐植酸尿素處理中被固定了，減少了其轉(zhuǎn)化為NO3--N 的總量。

圖4 4 種處理土壤NH4+-N 淋失量隨時(shí)間變化趨勢(shì)Fig.4 Variation trend of the content of NH4+-N leaching soil under four treatments with time

圖5 4 種處理土壤NO3--N 淋失量隨時(shí)間變化趨勢(shì)Fig.5 Variation trend of the content of NO3--N leaching soil under four treatments with time

綜上所述，與單施尿素相比，腐植酸尿素處理能夠降低土壤氮素淋溶量，提高氮素利用率。

3 結(jié)論

風(fēng)化煤中腐植酸的高效活化可以通過(guò)以下3種措施實(shí)現(xiàn)[2]：（1）增加結(jié)構(gòu)單元上的活性官能團(tuán)數(shù)量；（2）使官能團(tuán)處于親電或親核狀態(tài)，或通過(guò)引入相關(guān)原子或原子團(tuán)，提高官能團(tuán)反應(yīng)能力；（3）切斷化學(xué)鍵，降低分子量。本文通過(guò)氧化-堿化聯(lián)合方法活化風(fēng)化煤，一方面通過(guò)硝基引入，取代風(fēng)化煤中腐植酸芳核上氫而硝化，同時(shí)通過(guò)硝酸氧化作用，切斷化學(xué)鍵，將復(fù)雜的大分子腐植酸變?yōu)楸容^簡(jiǎn)單的小分子量物質(zhì)，從而提高活化后風(fēng)化煤水溶性腐植酸含量；另一方面，風(fēng)化煤腐植酸中羧基含量較多，羧基無(wú)法被硝化，通過(guò)加入KOH，生成羧酸鹽的方式提高水溶性腐植酸鹽的含量。通過(guò)FI-IR、TG 表征結(jié)果證明，活化后腐植酸分子量降低，羧基、羥基等水溶性官能團(tuán)增多，氧化劑硝酸中的氮不僅進(jìn)入腐植酸端基，還進(jìn)入到腐植酸碳鏈，從而提高了腐植酸分子的水溶性，驗(yàn)證了我們的假設(shè)，明確了其氧化-堿化相協(xié)同的活化機(jī)制。

將得到的活性腐植酸產(chǎn)品與熔融尿素制備成腐植酸尿素，通過(guò)土壤培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)尿素相比，腐植酸尿素可以顯著抑制土壤中脲酶活性。已有研究證明[16]，腐植酸中官能團(tuán)與脲酶中硫醇基作用形成復(fù)合物，從而抑制脲酶活性，減緩?fù)寥乐絮０窇B(tài)氮向銨態(tài)氮、銨態(tài)氮向硝態(tài)氮的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化。土壤淋洗試驗(yàn)表明，施用腐植酸尿素，土壤淋溶中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量均低于常規(guī)尿素處理。因此，通過(guò)氧化-堿化聯(lián)合活化腐植酸進(jìn)一步制成的腐植酸尿素，能顯著抑制土壤脲酶活性并顯著降低土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的淋溶量，從而提高氮素在土壤中利用率，具有作為增效氮肥的廣泛應(yīng)用市場(chǎng)。