人乳寡糖的結(jié)構(gòu)及其分離分析*

馬心悅 黃純翠 趙 耀 李 巖**

（1）中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所，北京 100101；2）中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3）重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，重慶 400015）

人 乳 寡 糖 （human milk oligosaccharides，HMOs）是乳汁中除乳糖和脂肪外的第三大固體成分。成熟乳和初乳中分別含有12～13 g/L 和22～24 g/L的HMOs［1］。母乳中游離的HMOs 雖然大部分無(wú)法被嬰兒消化吸收，卻是一種天然益生元，可以促進(jìn)雙歧桿菌等有益菌的增殖，調(diào)節(jié)嬰兒腸道菌群平衡［2］。不僅如此，HMOs 發(fā)揮多種生理功能，競(jìng)爭(zhēng)性抑制病原體與腸道上皮細(xì)胞的表面聚糖結(jié)合，阻礙病原菌黏附，增強(qiáng)腸道屏障功能，預(yù)防壞死性小腸結(jié)腸炎，防止諾如病毒感染［3］。HMOs可以發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，減輕免疫應(yīng)激反應(yīng)［4］。在小鼠和乳豬的認(rèn)知功能研究中發(fā)現(xiàn)，含唾液酸的HMOs對(duì)神經(jīng)發(fā)育有重要作用，有助于增強(qiáng)學(xué)習(xí)能力和記憶力［5］。為了研究HMOs 對(duì)嬰兒健康發(fā)揮的作用，需要對(duì)HMOs進(jìn)行深入表征。母乳基質(zhì)復(fù)雜，HMOs 種類繁多、豐度跨度大，并且結(jié)構(gòu)多樣、存在眾多異構(gòu)體，這都使得檢測(cè)面臨諸多挑戰(zhàn)?；谧贤饣驘晒鈾z測(cè)的液相色譜和毛細(xì)管電泳在分離HMOs方面效果顯著，耦合質(zhì)譜分析極大提高檢測(cè)靈敏度。隨著糖組學(xué)技術(shù)的逐漸發(fā)展，特別是生物質(zhì)譜在表征聚糖方面的突破，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)大約200 種不同的HMOs 分子，表征了150 種低聚糖結(jié)構(gòu)［6-7］。此外，核磁共振、質(zhì)譜、紅外多光子解離光譜實(shí)現(xiàn)了對(duì)HMOs 結(jié)構(gòu)的完整解析。本文擬對(duì)HMOs分離和結(jié)構(gòu)解析的多種技術(shù)手段進(jìn)行綜述。

1 HMOs結(jié)構(gòu)

HMOs 是聚合度為3～20 的直鏈或支鏈聚糖，基本組成單位是5種單糖：D-葡萄糖（Glc）、D-半乳糖（Gal）、L-巖藻糖（Fuc）、N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）、N-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac）。HMOs的還原端是一個(gè)乳糖（Galβ1-4Glc）核心，其后連接不同數(shù)量的乳糖胺單元Galβ1-3GlcNAc（Ⅰ型）或Galβ1-4GlcNAc（ⅠⅠ型）延伸糖鏈。人乳中Ⅰ型結(jié)構(gòu)HMOs含量高于ⅠⅠ型結(jié)構(gòu)，這與其他哺乳動(dòng)物的情況恰好相反［8］。隨著聚合度增加，不同類型的糖苷鍵使得HMOs 立體構(gòu)型更為復(fù)雜。Ⅰ型乳糖胺通過(guò)β1-3/6連接時(shí)，糖鏈延長(zhǎng)發(fā)生中止［9］。ⅠⅠ型乳糖胺可以通過(guò)β1-3 連接不斷延長(zhǎng)直鏈骨架，若β1-6連接同時(shí)存在，則形成分支型寡糖結(jié)構(gòu)。

不同位置或數(shù)量的巖藻糖基化、唾液酸化修飾使得HMOs 結(jié)構(gòu)更具多樣性。根據(jù)修飾糖基的不同，HMOs被分為3類：含唾液酸的酸性寡糖、僅有巖藻糖修飾的中性寡糖和非巖藻糖基化中性寡糖。酸性寡糖中Neu5Ac 通過(guò)α2-3/6 連接到Gal 非還原端，或α2-6 連接到GlcNAc。巖藻糖基化大多是Fuc以α1-2形式連接非還原性的Gal。此外，F(xiàn)uc也可以通過(guò)α1-3連接在Glc還原端，或α1-3/4鍵添加到GlcNAc上［10］。

巖藻糖基化的類型受到巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（fucosyl transferase，F(xiàn)UT）催化介導(dǎo)，該酶受到乳腺內(nèi)2 個(gè)編碼巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的調(diào)控。Secretor基因編碼巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶2（FUT2），控制α1-2 鍵形成。Lewis基因編碼巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3（FUT3），該酶作用于α1-3/4 修飾的巖藻糖基化。根據(jù)基因表達(dá)情況，母乳可以分為分泌型Lewis陽(yáng)性（Se+Le+）、分泌型Lewis 陰性（（Se+Le-）、非分泌型Lewis 陽(yáng)性（Se-Le+）和非分泌型Lewis 陰性（Se-Le-）4 種類型［11］。不同分泌型母乳的HMOs對(duì)嬰兒健康的影響存在差異，如分泌型母乳能增強(qiáng)針對(duì)大腸桿菌和彎曲桿菌的保護(hù)［12］。常見(jiàn)HMOs如圖1所示。

2 HMOs分離分析

HMOs是一系列具有生物活性的低聚糖，極性大并且不含發(fā)色團(tuán)。經(jīng)過(guò)化學(xué)衍生后，HMOs通過(guò)高 效 液 相 色 譜 （high performance liquid chromatography，HPLC）或毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）實(shí)現(xiàn)有效分離，傳統(tǒng)的紫外檢測(cè)或熒光檢測(cè)簡(jiǎn)單、有效，但只能依靠標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定性分析，標(biāo)準(zhǔn)品不可用或價(jià)格昂貴時(shí)會(huì)受到限制。目前，親水相互作用色譜和多孔石墨化碳色譜常 用 于 分 離HMOs， 并 通 過(guò) 質(zhì) 譜 （mass spectrometry，MS）依據(jù)保留時(shí)間和準(zhǔn)確質(zhì)量確定寡糖成分，從而對(duì)HMOs進(jìn)行有效的成分分析。

2.1 液相色譜

2.1.1 陰離子色譜

陰離子交換色譜（high performance anion exchange chromatography，HPAEC）是分離天然低聚糖的傳統(tǒng)方法。強(qiáng)堿性溶液中，弱酸性的人乳寡糖以陰離子形式存在，其分子的結(jié)構(gòu)和大小與在陰離子交換柱上的保留密切相關(guān)。分離后HMOs通過(guò)脈沖安培檢測(cè)（pulsed amperometric detector，PAD），該方法檢測(cè)線性范圍較寬，但靈敏度低于熒光檢測(cè)。HPAEC-PAD 方法定量HMOs 簡(jiǎn)單、可靠，可用于開(kāi)展大隊(duì)列母乳樣本中HMOs 系統(tǒng)表征，追蹤不同泌乳時(shí)間和母體分泌型中HMOs濃度變化［13-14］。HPAEC-PAD 法無(wú)需衍生，能夠同時(shí)分析中性和酸性HMOs。由于不能在線與質(zhì)譜聯(lián)用，該方法只能依靠標(biāo)準(zhǔn)品定性［15］。受限于陰離子色譜的分離能力，長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行也無(wú)法完全分離HMOs到基線，寡糖異構(gòu)體如p-LNnH 和LNnH 出現(xiàn)共洗脫現(xiàn)象。

2.1.2 親水相互作用色譜

親水相互作用色譜（hydrophilic interaction chromatography，HⅠLⅠC）對(duì)于分離極性化合物十分有優(yōu)勢(shì)，已廣泛應(yīng)用于N/O-聚糖的分析。HⅠLⅠC適合分離唾液酸化寡糖，保留能力受單糖殘基數(shù)量的影響，分離長(zhǎng)鏈寡糖效果較好，但對(duì)于較小的三糖分離效果不佳。熒光檢測(cè)（fluorescent detection，F(xiàn)L）分離物是一種快速簡(jiǎn)單的方法，不過(guò)HMOs缺少熒光基團(tuán)，通常需要在酰胺柱分離前采用2-氨基苯甲酰胺衍生，這也增加了樣本處理步驟［16］。許多報(bào)道通過(guò)HPLC-FL大規(guī)模測(cè)定了母乳樣本中HMOs含量，包括巴西、美國(guó)、西班牙、中國(guó)等國(guó)際隊(duì)列，分析了HMOs含量變化與人群、哺乳期、地理位置、母親狀況之間的聯(lián)系［17-19］。HⅠLⅠC 使用的流動(dòng)相是甲酸銨-乙腈緩沖體系，可與質(zhì)譜兼容，使檢測(cè)靈敏度進(jìn)一步提高。HⅠLⅠC和三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式監(jiān)控離子對(duì)以明確HMO成分［20-22］。兩級(jí)質(zhì)量選擇極大地減少了背景基質(zhì)的干擾，具有出色的靈敏度。

2.1.3 多孔石墨化色譜

多孔石墨化碳色譜（porous graphitized carbon chromatography，PGC）具有顯著的寡糖異構(gòu)體分離能力，PGC 與質(zhì)譜結(jié)合使用已成為分析母乳樣品中HMOs 的強(qiáng)有力工具。PGC 出色的分離能力可以從高度異構(gòu)化的HMOs 中將α/β 端基差向異構(gòu)體分開(kāi)。同種寡糖因此產(chǎn)生兩個(gè)峰，反而為譜圖解析造成麻煩，通常使用NaBH4將天然HMOs還原為相應(yīng)的糖醇從而避免這個(gè)問(wèn)題［23］。Tonon 等［24］開(kāi)發(fā)PGC-ESⅠ-MS 方法，成功分離6 對(duì)異構(gòu)體。但該方法運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)達(dá)60 min，另一個(gè)限制是無(wú)法分離乳酰-N-四糖（lacto-N-tetraose，LNT）和乳酰-N-新四糖（lacto-N-neotetraose，LNnT）。Mank 等［25］開(kāi)發(fā)負(fù)離子模式的LC-ESⅠ-MS2方法，通過(guò)PGC 柱分離后，對(duì)20 多種重要寡糖進(jìn)行選擇離子監(jiān)控，實(shí)現(xiàn)對(duì)多種HMOs豐度的快速測(cè)定。同樣也有研究在ESⅠ正離子模式下通過(guò)選擇離子監(jiān)控模式成功分析HMOs 異構(gòu)體［26-27］。另外，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，已有廣泛應(yīng)用的同位素標(biāo)記的質(zhì)譜分析策略被引入HMOs 的分析。Robinson 等［28］用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（TMT）標(biāo)記人乳寡糖還原端，PGC 分離后通過(guò)ESⅠ-Q-TOF 在一次運(yùn)行中同時(shí)對(duì)5 個(gè)樣本的15種HMOs分析。TMT標(biāo)記擴(kuò)展了多路復(fù)用的能力，極大地縮短運(yùn)行時(shí)間，減緩了儀器性能漂移引起的電離差異。

2.2 毛細(xì)管電泳

毛細(xì)管電泳利用帶電粒子在電場(chǎng)中的遷移作用，分離純化蛋白質(zhì)、多肽、核酸等多種物質(zhì)。天然形式的酸性寡糖本身帶有電荷，無(wú)需衍生可直接經(jīng)CE 在飛摩爾水平測(cè)定。中性寡糖經(jīng)過(guò)2-氨基吖啶酮衍生后通過(guò)CE的分離度得到了提高［29-30］。CE分離所需樣品量少，快速簡(jiǎn)便，分離能力強(qiáng)?；诤?jiǎn)單的毛細(xì)管電泳-紫外檢測(cè)方法可同時(shí)定量17種HMOs，即使在乳糖含量較高的干擾下，仍能得到較 好 分 離［31］。 激 光 誘 導(dǎo) 熒 光（laser-induced fluorescence，LⅠF）是CE 分離寡糖后常用的檢測(cè)手段，研究使用CE-LⅠF調(diào)查了20周哺乳期中國(guó)母乳的HMOs譜，并發(fā)現(xiàn)Lewis陽(yáng)性分泌亞群［32］。

寡糖在CE 中的遷移時(shí)間具有極高重現(xiàn)性，多路毛細(xì)管并用能夠高通量表征HMOs［33］。相較于色譜分離30～60 min運(yùn)行時(shí)間，CE分離HMOs的速度明顯更快［34］。由于分析物在毛細(xì)管中的遷移率與分子尺寸和所帶電荷有關(guān)，異構(gòu)體容易出現(xiàn)共洗脫現(xiàn)象，例如LNT/LNnT，3'-唾液酸化乳糖（3'-sialyllactose， 3'-SL）/6'- 唾 液 酸 化 乳 糖（6'-sialyllactose，6'-SL）無(wú)法分離［35］。與其他分離技術(shù)相比，CE 的主要缺陷在于共洗脫水平突出，優(yōu)化設(shè)置可在一定程度改善［36］。此外，CE 與MS在連接處存在一定困難，需要引入揮發(fā)性分離緩沖液，延長(zhǎng)毛細(xì)管長(zhǎng)度以接入MS 入口。Albrecht等［37］嘗試將CE-LⅠF-MS在線聯(lián)合，明確了母乳和嬰兒糞便樣本中21 個(gè)寡糖峰，由此關(guān)注HMOs 在腸道的代謝命運(yùn)。不過(guò)CE 與MS 聯(lián)用時(shí)，分辨率和分離時(shí)間通常都會(huì)受到影響。

分離技術(shù)與紫外/熒光檢測(cè)聯(lián)用為HMOs 分析提供了簡(jiǎn)便快速的方法（表1）。分離技術(shù)中不可避免的共洗脫現(xiàn)象，使得樣品中的信號(hào)識(shí)別不明確，結(jié)合質(zhì)譜法能通過(guò)離子的準(zhǔn)確質(zhì)量確定HMOs組成。分離技術(shù)與質(zhì)譜的結(jié)合為HMOs混合物的分析提供了理想工具，已應(yīng)用于真實(shí)樣本的深入分析。

Table 1 The separation methods of human milk oligosaccharides表1 人乳寡糖分離方法

2.3 離子遷移譜

此外， 新型離子遷移譜（ion mobility spectrometry，ⅠMS）的出現(xiàn)，為異構(gòu)體分離增添另一個(gè)維度。差異微小的異構(gòu)寡糖在ⅠMS中由于碰撞界面不同，在施加電場(chǎng)的漂移管中以不同的漂移率實(shí)現(xiàn)毫秒級(jí)快速分離。遷移率與離子的碰撞截面（CCS）有關(guān)，一般離子越小、電荷越高、CCS 越小，遷移速度越快。ⅠMS-MS作為一種新型的糖化合物分析技術(shù)，使得質(zhì)譜表征未知寡糖的能力更進(jìn)一步，極好地補(bǔ)充了傳統(tǒng)LC-MS 方法。LNH/LNnH 在行波離子遷移譜（TWⅠMS）中的［M-H］-遷移率顯著不同，輕松實(shí)現(xiàn)基線分離［41］。新技術(shù)捕集離子遷移譜（TⅠMS）、循環(huán)離子遷移譜（cⅠMS）的出現(xiàn)，足以分離差異很小的異構(gòu)寡糖，極大改善了ⅠMS在糖組學(xué)中的應(yīng)用。TⅠMS-TOF聯(lián)合已應(yīng)用于實(shí)際樣本中4 對(duì)異構(gòu)體分離表征［42］。cⅠMS-MS 對(duì)［M+Na］+或［M-H］-離子分析，成功識(shí)別了7對(duì)HMOs異構(gòu)體，實(shí)現(xiàn)人乳二糖和三糖中不同糖苷鍵類型的鑒別［43］。ⅠMS-MS雖然增強(qiáng)了聚糖異構(gòu)體的分離能力，但是異頭物分離以及復(fù)雜的遷移率曲線給異構(gòu)寡糖的鑒定增加了難度。

3 HMOs結(jié)構(gòu)表征

真實(shí)樣本中識(shí)別特定HMOs時(shí)，主要通過(guò)檢索文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分配，有些情況下只能獲得單糖組成信息，無(wú)法明確異構(gòu)體類型。然而，完整的結(jié)構(gòu)解析對(duì)于研究HMOs生理功能以及理解生物合成路徑十分重要。核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、MS和紅外多光子解離（infrared multiple photon dissociation，ⅠRMPD）光譜是解析糖鏈結(jié)構(gòu)的常用技術(shù)。此外，聚合度大的復(fù)雜寡糖解析起來(lái)往往有一定難度，通常需要不同技術(shù)的結(jié)合才能表征完整結(jié)構(gòu)。

3.1 NMR

人乳寡糖結(jié)構(gòu)解析的一個(gè)重要工具是NMR。NMR 顯著優(yōu)勢(shì)在于沒(méi)有可用標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，通過(guò)化學(xué)位移即可解析單糖連接序列和糖苷鍵類型，甚至可以分辨α/β 異頭構(gòu)型［44］。NMR 可以在混合物中識(shí)別抗原表位等特異性的結(jié)構(gòu)信息［45］，但是在解析完整結(jié)構(gòu)時(shí)要求樣品純度較高，需要相對(duì)大量（微摩爾量級(jí)）的寡糖，限制了其應(yīng)用范圍。NMR 測(cè)定時(shí)存在的譜峰重疊現(xiàn)象，有時(shí)無(wú)法完全表征HMOs結(jié)構(gòu)。有報(bào)道在NMR添加第三個(gè)13C維度，采用3D HSQC-TOCSY 結(jié)合2D 光譜的策略解決了2D NMR中光譜重疊問(wèn)題，成功分配LNDFH Ⅰ結(jié)構(gòu)。Chai 等［46］將ESⅠ-MS/MS 與1H-NMR 信息結(jié)合，首次分離并鑒定了雙分支的十糖核心寡糖，解決了NMR 鑒定高聚合度的分支寡糖時(shí)，因相同單糖殘基信號(hào)重疊無(wú)法確定分支模式的難題，兩種技術(shù)的互補(bǔ)實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜聚糖的從頭測(cè)序。

3.2 MS

MS 具有高分辨率、高靈敏度、所需樣品量少等特點(diǎn)，是解析HMOs 結(jié)構(gòu)的主流方法。MS 解析HMOs 結(jié)構(gòu)，主要是依據(jù)一級(jí)MS 中準(zhǔn)分子離子測(cè)得的相對(duì)分子質(zhì)量推測(cè)其單糖組成，并結(jié)合多級(jí)MS 中產(chǎn)生的碎片離子進(jìn)一步分配詳細(xì)的結(jié)構(gòu)。Domon和Costello［47］建立的在多級(jí)MS中糖鏈碎片離子命名方法被沿用于HMOs，離子碎片包括糖苷鍵處斷裂產(chǎn)生的B/Y離子、C/Z離子，以及糖環(huán)環(huán)內(nèi)碎裂產(chǎn)生的A/X離子，并采用數(shù)字標(biāo)記表示斷裂位置。目前，基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜和電噴霧電離質(zhì)譜主要用于HMOs的結(jié)構(gòu)表征。

3.2.1 電噴霧電離質(zhì)譜

電噴霧電離質(zhì)譜（electrospray ionization mass spectrometry，ESⅠ-MS）表征聚糖結(jié)構(gòu)的能力十分強(qiáng)大，可以確定寡糖的組成和連接信息。高靈敏度ESⅠ-MS 結(jié)合碰撞誘導(dǎo)解離（CⅠD）僅需飛摩爾量級(jí)的未衍生寡糖就能獲得碎片信息。ESⅠ正離子模式產(chǎn)生的碎片離子信息較少，需要多級(jí)MS才能確定完整結(jié)構(gòu)［48］。已證實(shí)未衍生的中性寡糖由于其半縮醛羥基帶有弱酸性，完全能夠在MS中產(chǎn)生脫質(zhì)子離子［M-H］-。ESⅠ負(fù)離子模式下［M-H］-產(chǎn)生豐富的碎片離子，同時(shí)較低的化學(xué)背景噪音和較少的陽(yáng)離子加合物，對(duì)于結(jié)構(gòu)解析極為有利。許多研究利用ESⅠ-CⅠD-MSn方法完成了HMOs標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)構(gòu)解析，總結(jié)出詳細(xì)的斷裂規(guī)律和特征碎片，可以判斷HMOs 序列、分支點(diǎn)、修飾連接、糖苷鍵類型［49-50］。

Chai 等［51-52］在ESⅠ-CⅠD-MS/MS 負(fù)離子模式對(duì)于未衍生中性寡糖碎片進(jìn)行總結(jié)，HMOs的單糖序列信息可由［M-H］-產(chǎn)生的一系列C 型離子推出，而A/X 離子則顯示部分連接信息，如1-4 連接的GlcNAc/Glc發(fā)生0,2A環(huán)內(nèi)裂解。不同類型糖苷鍵連接的糖環(huán)在斷裂時(shí)產(chǎn)生的獨(dú)特碎片可用于區(qū)分異構(gòu)體，推導(dǎo)詳細(xì)結(jié)構(gòu)信息。例如，Glc/GalNAc 在相鄰1-3 糖苷鍵連接時(shí)易發(fā)生C/Z 雙斷裂，產(chǎn)生特有D 型離子m/z=202、m/z=348、m/z=364（表2）。對(duì)于具有分支的中性寡糖結(jié)構(gòu)，需要結(jié)合［M-H］-和［M-2H］2-兩個(gè)產(chǎn)物離子的碎裂信息，確定分支點(diǎn)和完整結(jié)構(gòu)。［M-H］-雙斷裂C2β/C3產(chǎn)生D2β-3碎片為1-6分支，D2β-3離子二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)一步確認(rèn)1-6分支結(jié)構(gòu)；［M-2H］2-一級(jí)譜獲得D1β-2β離子可推測(cè)1-3分支內(nèi)部信息。

Table 2 Characteristic fragments of oligosaccharide isomers in the negative mode electrospray ionization表2 ESI負(fù)離子模式中寡糖異構(gòu)體特征碎片

酸性HMOs中2種唾液酸的連接方式表現(xiàn)出不同碎裂模式。若Neu5Ac 修飾以α2-6 連接在Gal，易出現(xiàn)特異性的跨環(huán)斷裂，產(chǎn)生脫羧離子0,4A2-CO2（m/z=306）；唾液酸α2-3 連接則易脫羧形成B2-CO2離子，或特征D離子（m/z=493）［53-54］。相同碰撞能量條件下，同種人乳寡糖的碎裂模式具有相似性。Remoroza 等［55］使 用HⅠLⅠC 分 餾 混 合 物，通 過(guò)Orbitrap MS 對(duì)從100 位母親乳汁中匯集的74 種HMOs結(jié)構(gòu)完全表征，利用譜圖匹配和混合搜索全面注釋MS2子離子。LC-ESⅠ-MS2也可以采用代表特定結(jié)構(gòu)的特征離子作為監(jiān)測(cè)離子，增強(qiáng)了結(jié)構(gòu)選擇性，從而區(qū)分異構(gòu)體類型，正確辨別分泌組［56］。

3.2.2 基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜

基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionizationmass spectrometry，MALDⅠ MS）優(yōu)勢(shì)在于靈敏度高、速度快、動(dòng)態(tài)范圍寬，適合于高分子質(zhì)量聚糖的檢測(cè)［58］。HMOs的MALDⅠ譜圖相比ESⅠ MS更為簡(jiǎn)單，通常顯示為單電荷準(zhǔn)分子離子，依據(jù)分子質(zhì)量推測(cè)單糖組成可獲得寡糖指紋譜。盡管在快速分析方面取得了進(jìn)展，MALDⅠ MS 由于電離效率低，對(duì)結(jié)構(gòu)相似的異構(gòu)寡糖表征存在一定局限性。ESⅠ鑒定中性寡糖時(shí)，［M-H］-在負(fù)離子模式的碎裂提供了豐富的結(jié)構(gòu)信息，但這在MALDⅠ中難以實(shí)現(xiàn)。不過(guò)最近有研究展示了MALDⅠ解析HMOs 結(jié)構(gòu)的潛力。［M+Cl］-被證明在MALDⅠ中容易形成前體離子，其產(chǎn)物離子譜可用于寡糖表征［59］。此外，MALDⅠQ-TOF中［M+Na］+可作為前體離子，產(chǎn)生診斷離子和條件診斷離子可用于推測(cè)HMOs存在的異構(gòu)體結(jié)構(gòu)。MALDⅠ Q-TOF 中CⅠD 能量低，且缺少跨環(huán)碎裂，因此表征完整結(jié)構(gòu)的能力有限［60］。

MALDⅠ與其他方法組合允許對(duì)鑒定到的寡糖分配唯一結(jié)構(gòu)。Amano 等［61］利用MALDⅠ-QⅠTTOF MSn分析1-芘丁酰肼標(biāo)記的中性寡糖，在負(fù)離子模式觀察到2,4A4、D4β-3、Yα/β/γ碎片離子，幫助鑒定分支內(nèi)部結(jié)構(gòu)，確定巖藻糖連接方式。聯(lián)合特異性外切糖苷酶，α2-巖藻糖苷酶和β4-半乳糖苷酶消化，解析了具有三分支的十糖核心HMO 完整結(jié)構(gòu)，共鑒定到22 種不同數(shù)量巖藻糖修飾的十糖核心寡糖異構(gòu)體。Lebrilla 等［62-64］聯(lián)合多種技術(shù)開(kāi)發(fā)了基于微芯片液相色譜HPLC-Chip/TOF MS平臺(tái)的HMOs注釋策略，構(gòu)建了包括精確質(zhì)量、單糖組成和保留時(shí)間的200多種HMOs注釋文庫(kù)。該策略被進(jìn)一步擴(kuò)展到傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜MALDⅠ-FT ⅠCR MS，采用紅外多光子解離聯(lián)合外切糖苷酶消化方法，確定了70 多種HMOs 的糖苷鍵連接和分支結(jié)構(gòu)。

由于糖苷鍵的弱鍵合，B/Y、C/Z 離子是傳統(tǒng)CⅠD碎裂時(shí)的主要碎片離子。為了獲得分支和連接信息，交叉環(huán)片段對(duì)于完整的結(jié)構(gòu)表征也很重要。HMOs 鏈在MS 中的碎裂遵循一定的斷裂規(guī)律，這為高聚合度寡糖結(jié)構(gòu)解析提供了思路，相似的碎裂模式可對(duì)未知寡糖從頭表征。特征離子可以實(shí)現(xiàn)對(duì)真實(shí)母乳樣本的快速分型和寡糖鑒定。必須注意的是，CⅠD碰撞中可能發(fā)生聚糖重排，往往采取全甲基化衍生防止巖藻糖重排，改善電離中不穩(wěn)定的唾液酸部分，提供豐富的診斷離子。

3.3 紅外多光子解離光譜

LC-MS 作為分析HMOs 主流方法，滿足了常規(guī)分析的需要，但當(dāng)出現(xiàn)共洗脫或缺乏診斷離子的情況，依靠保留時(shí)間、前體離子和特征碎片鑒定寡糖結(jié)構(gòu)會(huì)受到限制。識(shí)別寡糖異構(gòu)體的另一種新型技術(shù)是ⅠRMPD 光譜，它可以在離子阱中實(shí)施，其本質(zhì)可以看作是一種特殊的二級(jí)MS［65］。選定的離子經(jīng)特定波長(zhǎng)的紅外線照射時(shí)才能發(fā)生共振，從而吸收多個(gè)紅外光子的能量，出現(xiàn)結(jié)構(gòu)特異性的解離［66］。根據(jù)吸收光譜的特征吸收峰可以識(shí)別物質(zhì)結(jié)構(gòu)，有報(bào)道使用ⅠRMPD 直接鑒定HMOs 中唾液酸的修飾類型，如α2-6 連接的唾液酸在3 600 cm-1附近有3 個(gè)吸收峰，α2-3 連接顯示在3 500 cm-1附近具有最大吸收。二級(jí)MS不產(chǎn)生特征碎片的加鈉離子也可以通過(guò)ⅠRMPD譜進(jìn)行識(shí)別［67］。

低溫紅外光譜和ⅠMS-MS 兩種技術(shù)的組合對(duì)HMOs異構(gòu)體高特異性區(qū)分意義重大，即使對(duì)于在ⅠMS中漂移時(shí)間相差不大的異構(gòu)寡糖，借助于其不同的振動(dòng)光譜能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)健的區(qū)分，已應(yīng)用于現(xiàn)有技術(shù)特別難以區(qū)分的三糖至六糖的寡糖異構(gòu)對(duì)［68］。Abikhodr 等［69］使用一組LNFP 寡糖純品創(chuàng)建了小型光譜數(shù)據(jù)庫(kù)。在該數(shù)據(jù)庫(kù)支持下，寡糖混合物即使不能被完全分離，通過(guò)算法分解紅外光譜可成功區(qū)分異構(gòu)體。振動(dòng)光譜利用分子的自身屬性，能夠高靈敏度地分辨微小結(jié)構(gòu)變化。結(jié)合分離技術(shù)、機(jī)器學(xué)習(xí)方法減少掃描范圍和光譜采集時(shí)間，ⅠRMPD技術(shù)進(jìn)一步推動(dòng)了聚糖結(jié)構(gòu)的解析。

HMOs在酶促合成過(guò)程中產(chǎn)生巨大的結(jié)構(gòu)多樣性和異質(zhì)性，極大地增加了結(jié)構(gòu)解析的難度。多種技術(shù)手段如NMR、MS、ⅠRMPD，通過(guò)不同方式成功解析HMOs的結(jié)構(gòu)，并且多種方法組合提供了解析復(fù)雜糖鏈結(jié)構(gòu)的完整信息。其中MS方法應(yīng)用最為廣泛，通過(guò)耦聯(lián)LC、ⅠMS 等分離方法，能夠在混合物中依據(jù)生物合成規(guī)則，結(jié)合前體離子、特征離子分配HMOs結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)未知寡糖結(jié)構(gòu)的從頭表征。早期糖鏈結(jié)構(gòu)解析完全依賴人工經(jīng)驗(yàn)手動(dòng)完成?，F(xiàn)如今借助多種算法策略，可以實(shí)現(xiàn)高通量糖組 學(xué) 的MS 譜 圖 解 析 工 作。 FragLib［70］、Kameyama’s Method［71］軟件將實(shí)驗(yàn)MS 與數(shù)據(jù)庫(kù)中真實(shí)譜圖比對(duì)，從而報(bào)告糖鏈結(jié)構(gòu)。此外，GlycosidⅠQ［72］、GlycoFragment/GlycoSearchMS［73］等軟件可通過(guò)糖結(jié)構(gòu)庫(kù)搜索的方式實(shí)現(xiàn)寡糖結(jié)構(gòu)的快速解析。

4 總結(jié)與展望

HMOs表征一直是具有挑戰(zhàn)性的難題。隨著糖組學(xué)分析技術(shù)的發(fā)展，特別是LC-MS 的應(yīng)用，減輕了對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品的依賴，可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中HMOs成分的常規(guī)分析。質(zhì)譜通過(guò)斷裂規(guī)律和特征離子解析糖鏈結(jié)構(gòu)，分辨異構(gòu)寡糖類型。對(duì)于HMOs快速分析和無(wú)偏測(cè)量的通用平臺(tái)還有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。雖然沒(méi)有統(tǒng)一的分析技術(shù)，但是多技術(shù)的交叉應(yīng)用可以滿足不同目的的研究需要，為理解HMOs 生物學(xué)功能，探究構(gòu)效關(guān)系提供技術(shù)支持。多種技術(shù)的聯(lián)合進(jìn)一步提升了對(duì)于異構(gòu)寡糖快速分離和高特異性分析的能力，有助于探究HMOs在嬰兒體內(nèi)的代謝命運(yùn)、腸道菌群與HMOs的聯(lián)系、嬰兒配方奶粉開(kāi)發(fā)等問(wèn)題。此外，生物MS等技術(shù)的不斷進(jìn)步，推動(dòng)了HMOs分析向著高通量、自動(dòng)化方向發(fā)展，為下一步HMOs研究提供有力幫助。