重組人IL-17D對人卵巢癌SKOV3細胞增殖及VEGF-C表達的影響*

劉式浩,范元春,劉萬川,趙江靜,付亞偉,楊家慧,王春洋,張 輝**

(河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院 a.婦科;b.生殖醫(yī)學科,石家莊 050010)

卵巢癌是死亡率最高的婦科腫瘤,70%的卵巢癌患者在2年內(nèi)出現(xiàn)復發(fā)或轉(zhuǎn)移,目前5年生存率仍低于40%[1]。血管內(nèi)皮生長因子C(vascular endothelial growth factor C,VEGF-C)可誘導淋巴管生成,從而促進淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[2]。VEGF-C表達、腫瘤相關(guān)的淋巴管生成與腫瘤預后不良有關(guān)[3]。上皮性卵巢癌中,腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與腫瘤組織中VEGF-C高表達有關(guān)[4]。白細胞介素17(IL-17)由Th17細胞分泌,共有6個亞型:IL-17A(IL-17)、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E和IL-17F。研究顯示,IL-17A、IL-17B、和IL-17C促進腫瘤進展,IL-17E有抗腫瘤的能力,而IL-17F有抑瘤與促瘤的雙向作用[5]。目前針對IL-17D的研究較少,IL-17D對腫瘤作用的各項研究不盡相同。研究顯示,IL-17D基因在卵巢癌組織中高表達,并且與期別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[6]。轉(zhuǎn)染IL-17D基因到卵巢癌SKOV3細胞,在體外及裸鼠移植瘤中均顯示出促進腫瘤生長的作用[7]。此外,研究還發(fā)現(xiàn),外源性添加rh-IL-17D后,NF-κB信號通路可得到活化,下游產(chǎn)物增加[8]。研究顯示,IL-17A可促進癌癥細胞VEGF-C表達,同時促進淋巴管內(nèi)皮的遷移和管樣結(jié)構(gòu)的形成,繼而對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移起到促進作用[9]。然而,IL-17D能否直接促進卵巢癌細胞增殖及是否在卵巢癌細胞中促進VEGF-C表達,目前尚未有研究報道。本研究通過在人卵巢癌SKOV3細胞培養(yǎng)基中外源性添加r-hIL-17D,模擬Th17分泌的IL-17D對SKOV3細胞的作用,研究了r-hIL-17D對SKOV3細胞增殖及VEGF-C表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 R-hIL-117D購自美國PEPROTECH公司,新生牛血清購自美國BI公司,RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素雙抗溶液購自美國GIBCO公司,MTS試劑購自美國Promega公司,RNA提取試劑盒購自天津中實基因,GAPDH引物、Strand cDNA合成試劑盒購自上海GENERAY公司,實時熒光定量RT-qPCR試劑盒購自北京莊盟公司,VEGF-C特異性引物由上海GeneCoppoemy Company合成,VEGF-C ELISA試劑盒購自美國OriGene Technologies,卵巢癌SKOV3細胞由河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院婦科凍存,酶標儀(美國Thermo 2000),PCR儀(美國ABI9902),熒光定量PCR儀(美國ABI7500),搖床(中國Haimen,Kylin Bell TS-2),酶標儀(美國Thermo FC)。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制、細胞培養(yǎng)及分組 用新生牛血清、雙抗的培養(yǎng)基配制空白培養(yǎng)基,將相應(yīng)量的r-hIL-17D加至空白培養(yǎng)基,獲得含IL-17D濃度為10、50ng/mL和100ng/mL的培養(yǎng)基。復蘇卵巢癌SKOV3細胞,用空白培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。將細胞用含不同濃度r-hIL-17D培養(yǎng)基培養(yǎng),分為0ng/mL組、10ng/mL組、50ng/mL組和100ng/mL組。

1.2.2 MTS法檢測SKOV3細胞增殖 將SKOV3細胞制成單細胞懸液,按4×103細胞/孔接種于96孔板,過夜。棄原培養(yǎng)基,每孔加100μL含不同濃度r-hIL-17D的培養(yǎng)基,每濃度設(shè)5個復孔。繼續(xù)培養(yǎng),分別在0、24、48、72、96、120h取出96孔板,加MTS試劑20μL,孵育2h,酶標儀上以490nm波長檢測每孔的吸光度值,記錄結(jié)果。

1.2.3 RT-qPCR法檢測SKOV3細胞中VEGF-C mRNA表達 將SKOV3細胞用4mL含不同濃度的r-hIL-17D培養(yǎng)基重懸,培養(yǎng)48h。分別收集上清及各組細胞。使用RNA提取試劑盒提取總RNA。檢測RNA的濃度及純度。使用Strand cDNA合成試劑盒對分離的RNA進行逆反轉(zhuǎn)錄為cDNA,并用2XSYBR-qPCR-Mix試劑盒完成擴增。每個樣品做3個復孔重復檢驗,內(nèi)參為GAPDH。引物序列:GAPDH-F:AATCCCATCACCATCTTCCAG和GAPDH-R:CCTTCATCCATGGTGGAAGAC。VEGF-C特異性引物由GeneCoppoemy Company合成,Cat#HQP018483。采用CT法(2-??CT)測定VEGF-C轉(zhuǎn)錄物相對水平。

1.2.4 ELISA法檢測細胞上清VEGF-C濃度 收集上清并離心。在酶標準板上設(shè)置了標準孔、待測樣品孔和空白孔。每個樣品設(shè)5個復孔,加稀釋的待測樣品,孵育,洗板,加生物素化VEGF-C抗體工作溶液,覆膜并孵育,洗板甩干,加抗生物素-生物素-過氧化物酶混合物工作溶液,覆蓋孵育。洗滌甩干,加基質(zhì)溶液,覆膜孵育顯色。加終止液,震蕩混勻。用酶標儀在450nm波長下測量每個孔的光密度(OD值)。根據(jù)標準濃度和相應(yīng)的OD值繪制標準曲線。使用該回歸方程計算每個待測樣品中VEGF-C的濃度。

2 結(jié) 果

2.1 MTS法檢測細胞增殖 在不同濃度r-hIL-17D作用下,SKOV3細胞的增殖能力差異有統(tǒng)計學意義,不同觀測時間的細胞增殖差別有統(tǒng)計學意義,并且不同濃度r-hIL-17D與觀測時間存在交互作用(P<0.001)。見表1。

表1 r-hIL-17D對SKOV3細胞增殖(OD)的影響

2.2 RT-qPCR檢測SKOV3細胞中VEGF-C mRNA表達 10、50、100ng/mL r-hIL-17D組的VEGF-C mRNA相對表達量高于0ng/mL r-hIL-17D組,50、100ng/mL r-hIL-17D組的VEGF-C mRNA相對表達量高于10ng/mL r-hIL-17D組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 r-hIL-17D對SKOV3細胞VEGF-C mRNA表達和VEGF-C濃度的影響

2.3 ELISA檢測SKOV3細胞上清中VEGF-C濃度 10、50、100ng/mL r-hIL-17D組的VEGF-C濃度高于0ng/mL r-hIL-17D組,50、100ng/mL r-hIL-17D組的VEGF-C濃度高于10ng/mL r-hIL-17D組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

3 討 論

在腫瘤微環(huán)境中,由炎癥細胞、各種炎性因子構(gòu)成的炎性環(huán)境是重要的組成部分,也是炎癥影響惡性腫瘤進展的基礎(chǔ),而炎性因子是發(fā)揮因素的關(guān)鍵。白介素(Interleukin)家族就是炎性因子中重要的組成部分,由CD4+T細胞亞群Th17細胞分泌的IL-17便是其中的一種。IL-17A可在非小細胞肺癌中促進腫瘤的發(fā)生[10],并且通過刺激癌細胞增加VEGF-C表達來促進淋巴管生成[9]。IL-17B升高與胰腺癌、胃癌、肺癌和乳腺癌患者的不良預后相關(guān)[11]。IL-17C通過介導先天性炎癥反應(yīng)促進肺癌的進展[12]。IL-17E在多種人類腫瘤異種移植模型中,包括黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和胰腺癌中表現(xiàn)出抗腫瘤作用[13]。IL-17F在不同研究里顯示出促瘤以及抑瘤的不同作用[5]。

IL-17D是IL-17家族中研究最少的一種,其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用還尚不明確。Seelige等[14]研究顯示,IL-17D可通過募集NK細胞抑制腫瘤生長來保護宿主細胞。Huang等[15]發(fā)現(xiàn),17d-/-小鼠比野生型小鼠更易患急性結(jié)腸炎、細菌感染和實驗誘導的結(jié)腸癌。一些研究還顯示了IL-17D的腫瘤促進作用。Lin等[16]發(fā)現(xiàn),IL-17D通過p38 MAPK信號通路誘導TAM浸潤,從而促進肺癌的發(fā)展。本課題組前期研究中,IL-17D基因在卵巢癌中的表達高于卵巢良性腫瘤[6],在體外及裸鼠體內(nèi)都促進卵巢癌細胞生長[7]。本研究結(jié)果顯示,IL-17D促進腫瘤增殖,這與前期研究結(jié)果一致。因此,IL-17D可能在不同種類癌細胞中發(fā)揮不同的作用。

在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生的過程中,淋巴管生成是其中一個關(guān)鍵事件。VEGF-C作為一種有絲分裂原,與主要表達在淋巴管內(nèi)皮細胞LEC上的VEGFR-3結(jié)合,刺激LEC的分裂并促進淋巴管的生成。研究顯示,過度表達的VEGF-C可促進腎臟、胰腺、前列腺、肺、皮膚、胃、結(jié)直腸、宮頸、白血病、間皮瘤、卡波西肉瘤和子宮內(nèi)膜癌等腫瘤的轉(zhuǎn)移,這種轉(zhuǎn)移主要通過淋巴管生成造成的淋巴管轉(zhuǎn)移[17]。Kuerti等[4]研究顯示,腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與卵巢癌VEGF-C高表達有關(guān),并且VEGF-C可作為淋巴轉(zhuǎn)移風險高患者的分子標志物。VEGF-C轉(zhuǎn)染的黑色素瘤細胞在腫瘤體內(nèi)產(chǎn)生顯著的淋巴管生成。原發(fā)性腫瘤周圍的淋巴管大量擴張,淋巴管的數(shù)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

研究表明,淋巴管生成和VEGF-C表達在炎性環(huán)境中得到增強。Tang等[18]在體外成功使用IL-1α和IL-6誘導并增加CAPAN-1和COLO-357胰腺癌癥細胞系中VEGF-C的表達。Tsai發(fā)現(xiàn)生長因子HRGβ1(heregulin-β1)可刺激癌癥細胞表達和分泌VEGF-C[19]。Chen等[9]研究表明,IL-17A可在體外增加非小細胞肺癌細胞中VEGF-C mRNA和蛋白表達。本研究中,在培養(yǎng)基中外源性加入rh-IL-17D,卵巢癌SKOV3細胞中VEGF-C mRNA表達和分泌到培養(yǎng)基中的VEGF-C濃度均較空白對照組增加。這表明IL-17D對卵巢癌SKOV3細胞的VEGF-C表達起到了促進作用。VEGF-C表達增加,可能促進了淋巴轉(zhuǎn)移,這可解釋IL-17D基因高表達與淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)的結(jié)論[7]。

研究表明,ERK1/2、PI3K、p38 MAPK和NF-κB等信號通路參與了HRGβ1介導的VEGF-C表達。Zhao等[20]發(fā)現(xiàn),IL-6可通過該途徑增加癌癥細胞中VEGF-C表達。前期研究顯示,rh-IL-17D可增強癌細胞中NF-κB信號通路表達,從而增加下游產(chǎn)物表達[9]。既往研究表明,NF-κB信號通路參與了VEGF-C的表達過程,推斷IL-17D可通過NF-κB信號通路,上調(diào)VEGF-C mRNA表達,并增加VEGF-C分泌。然而,IL-17D的特異性受體仍未知。一些研究報道了IL-17D和IL-17RA之間的相互作用,表明IL-17RA可能是其的潛在受體。Huang等[15]發(fā)現(xiàn),IL-17D通過與腸上皮細胞中的CD93受體結(jié)合發(fā)揮作用。

血行和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要機制。目前多種抗血管生成藥物已進入臨床。已有研究在小鼠模型中通過抑制淋巴管生成來減少腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移,但抗淋巴管生成的藥物目前仍未面世。針對IL-17D的靶向抑制治療,或可開拓一條抑制細胞增長、減少VEGF-C產(chǎn)生,遏制轉(zhuǎn)移的新途徑。