基于腫瘤相關(guān)巨噬細胞的子宮內(nèi)膜癌預(yù)后模型建立和驗證*

何心勤,張 霞,陳麗紅,江 洪

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,福州 350001)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma,EC)是最常見的婦科癌癥之一,在女性惡性腫瘤中居第六位,其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢,與疾病相關(guān)的死亡率很高[1]。2020年,全球新增約417367例子宮內(nèi)膜癌病例,其中約97370例死亡病例。發(fā)病年齡、病理分期、腫瘤分化程度和病理類型是EC發(fā)病率和死亡率的重要決定因素[2]。Ⅰ期EC患者的5年生存率可高達80%～90%,Ⅲ期和Ⅳ期患者的5年生存率分別僅為50%～65%和15%～17%[1]。因此,準確的早期診斷和及時的治療是有效治療EC的關(guān)鍵。手術(shù)聯(lián)合輔助治療(如放療和化療)是目前治療EC患者的標準方法。免疫療法作為一種新興的輔助治療方法,有望改善晚期/復(fù)發(fā)患者的預(yù)后,但許多EC患者的預(yù)后仍很差[3]。因此,需要更好、更準確的生物標志物來預(yù)測、診斷和治療EC。

腫瘤微環(huán)境(tumor micro-environment,TME)是一種復(fù)雜而豐富的多細胞介質(zhì),與腫瘤發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。腫瘤微環(huán)境通常包括免疫細胞、間充質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞、炎癥細胞介質(zhì)和細胞外基質(zhì)分子。這些細胞和分子之間的相互作用與腫瘤血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移、免疫抑制、化療耐藥性和臨床預(yù)后密切相關(guān)[4]。在特定類型的實體瘤中,腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor-associated macrophages,TAMs)在腫瘤組織中的占比高達50%,是腫瘤組織中最豐富的免疫細胞類型之一[5]。在不同的腫瘤類型中,包括腦癌、乳腺癌、胰腺癌和肺癌,TAMs表現(xiàn)出明顯的表型和功能異質(zhì)性[5]。在TME內(nèi),TAMs可對各種局部刺激迅速做出反應(yīng)。這些刺激包括細胞因子或治療性擾動,它們隨后會極化為從促炎到抗炎的各種表型。這些表型決定了TAMs是促進還是阻止腫瘤生長。TAMs可執(zhí)行不同的功能,但先前的研究表明,腫瘤組織中TAM豐度的增加與不良臨床預(yù)后和治療效果最常相關(guān)。因此,TAMs可能是重要的潛在癌癥預(yù)后生物標志物和治療靶點[5]。

與正常子宮內(nèi)膜標本相比,人EC標本中TAM浸潤明顯。TAM數(shù)量的增加與EC的惡性進展也呈正相關(guān)。與正常子宮內(nèi)膜相比,EC標本的上皮和基質(zhì)中CD68+TAM密度更高[6]。此外,CD163+M2-TAMs在晚期EC中的聚集程度更高,從EC標本中分離出的TAMs明顯加速血管生成和促進癌癥轉(zhuǎn)移[7]。此外,TAMs似乎在EC中發(fā)揮著雌激素和孕激素介導(dǎo)的作用[8]。靶向抑制TAMs是減少抗腫瘤免疫治療耐藥性的有效方法,為開發(fā)EC的新型療法提供了潛在機會[7]。因此,為了預(yù)測預(yù)后或設(shè)計靶向療法,發(fā)現(xiàn)新型TAM特異性生物標志物至關(guān)重要。目前,針對EC的特異性TAM標記很少,也很少有研究證實EC與TAM相關(guān)的基因預(yù)后模型或特征。

本研究通過加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)、單變量Cox分析和Lasso回歸算法篩選出EC中與TAMs相關(guān)的六個生物標志物。使用單細胞RNA測序(scRNA-seq)和TCGA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),這些數(shù)據(jù)來自EC患者樣本。此外,行基因本體(GO)和京都基因和基因組百科全書(KEGG)富集分析,以探索EC中與TAM相關(guān)的候選生物標志物所涉及的生物學(xué)功能和信號通路。通過從多個數(shù)據(jù)集中構(gòu)建風(fēng)險評分模型和預(yù)后預(yù)測提名圖,研究了六種生物標志物在EC不同臨床表型中的預(yù)后價值。本研究揭示了TAM相關(guān)生物標志物在預(yù)測EC預(yù)后中的潛在作用,并通過闡明TAM相關(guān)基因在TME中的功能,揭示了該疾病的潛在治療靶點。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集 EC相關(guān)單細胞測序(scRNA-seq)數(shù)據(jù)從基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載以下數(shù)據(jù):將包含5個EC樣本scRNA-seq數(shù)據(jù)的GSE173682和包含10個健康子宮內(nèi)膜組織樣本scRNA-seq數(shù)據(jù)的GSE111976合并為scRNA-seq數(shù)據(jù)集,用于進一步的scRNA-seq分析。此外,癌癥基因組圖譜(TCGA)-EC隊列中547個腫瘤樣本和35個正常樣本的RNA測序數(shù)據(jù)(RNA-seq),其中543個EC樣本具有完整的存活信息。

1.2 scRNA-seq分析 使用R軟件包“Seurat”(4.1.0版)篩選基因少于200個的細胞和涉及少于3個細胞的基因。按100

1.3 差異分析 基于scRNA-seq數(shù)據(jù)集,根據(jù)adj.P<0.05和|avg log2 FC| >0.5,檢測聚焦的細胞類型中腫瘤樣本和健康樣本之間的差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs)。使用“DESeq2”軟件包獲取TCGA-EC隊列中EC與正常樣本之間的DEGs。利用單樣本基因組富集分析(single sample gene set enrichment analysis,ssGSEA)計算28種免疫細胞的ssGSEA得分,并比較EC和正常樣本的得分。

1.4 加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA) 利用“WGCNA”軟件包(1.70.3版),以26個差異免疫細胞的ssGSEA分數(shù)為特征進行加權(quán)基因表達網(wǎng)絡(luò)分析(Weighted gene co-expression network analysis,WGCNA),對EC和正常樣本進行聚類,以檢測和剔除離群樣本[9]。隨后,選擇合適的軟閾值功率構(gòu)建無標度網(wǎng)絡(luò),并將基因劃分為不同的模塊。對這些模塊和ssGSEA得分進行相關(guān)性分析,篩選出模塊中與巨噬細胞ssGSEA得分相關(guān)性最高的中心基因。將這些中樞基因與巨噬細胞DEGs和DEGs相交,以獲得候選基因,供進一步分析。

1.5 候選基因的富集分析 基于基因本體(geneontology,GO)和京都基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes,KEGG)數(shù)據(jù)庫的富集分析由“clusterProfiler”軟件包(4.2.2版)執(zhí)行,以檢測候選基因的相關(guān)通路或功能[10]。

1.7 基于風(fēng)險模型的臨床分析和富集分析 在訓(xùn)練集的基礎(chǔ)上,對比不同臨床特征(年齡、腫瘤分期和組織學(xué)分級)分組之間以及漿液性囊腺癌和子宮內(nèi)膜樣腺癌分組之間的風(fēng)險評分。利用“GSVA”軟件包(1.42.0版),根據(jù)從MSigDB數(shù)據(jù)庫中獲得的KEGG基因組,進行基因組變異分析(Gene Set Variation Analysis,GSVA)https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/,比較兩個風(fēng)險組的通路。

1.8 基于風(fēng)險模型的免疫分析 利用表達數(shù)據(jù)估算惡性腫瘤組織中的基質(zhì)細胞和免疫細胞,ESTIMATE算法計算EC樣本的免疫和基質(zhì)評分,并檢測其與風(fēng)險評分之間的相關(guān)性。用ssGSEA算法計算免疫細胞評分,并對兩個風(fēng)險組的評分進行對比。比較兩個風(fēng)險組之間46個免疫檢查點的表達情況。

1.9 繪圖 通過對風(fēng)險評分和臨床特征(年齡、腫瘤分期和組織學(xué)分級)進行單變量和多變量Cox分析,得出獨立的預(yù)后因素。應(yīng)用這些因素構(gòu)建EC模型圖,同時繪制校準曲線以評估模型圖的性能。

2 結(jié) 果

2.1 通過scRNA-seq分析共篩選了七種細胞類型 初步篩選中,排除了基因少于200個的細胞和表達基因少于3個的細胞后,剩下106900個細胞和28689個基因。進一步篩選,得到65385個符合分析標準的細胞和28689個基因。篩選出表達變化程度最高的前2000個基因行進一步分析(圖1A)。主成分分析(principal component analysis,PCA)結(jié)果顯示,批量效應(yīng)校正處理的結(jié)果更佳(圖1B、C)。通過流形理論與拓撲分析(uniform manifold approximation and projection,UMAP)檢測出17個細胞簇。在健康樣本和EC樣本之間,大多數(shù)細胞簇的水平不同(圖1D、E)。然后,對這些細胞簇進行了注釋,得到了七種細胞類型,包括內(nèi)皮細胞、上皮細胞、成纖維細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞、T細胞和組織干細胞(圖1F)。發(fā)現(xiàn)成纖維細胞是EC樣本中的主要細胞類型(圖1F)。為了描述不同細胞類型的特征,計算每個樣本中前10個標記基因的富集得分(圖1G)。

圖1 EC相關(guān)scRNA-seq數(shù)據(jù)集中的細胞聚類和注釋A:用紅色標出細胞間前2000個可變基因,并標出前10個可變基因;B、C:使用主成分分析(PCA)對原始數(shù)據(jù)(B)、和諧(C)進行定性評估;D:識別17個具有顯著差異(P<0.05)的主成分(PC);E:通過統(tǒng)一流形理論與拓撲分析(UMAP)鑒定出七個細胞簇;F:7個細胞群在scRNA-seq數(shù)據(jù)集中腫瘤樣本和健康樣本中的比例柱狀圖;G:scRNA-seq數(shù)據(jù)集中腫瘤樣本和健康樣本之間7個細胞簇的GSVA富集得分熱圖

2.2 差異分析和WGCNA篩選出733個樞紐基因 通過差異分析檢測TCGA-EC隊列中腫瘤樣本和健康樣本之間的805個巨噬細胞DEGs(圖2A、B)以及EC樣本和健康樣本之間的5691個DEGs(圖2C、D)。計算EC和健康樣本之間的ssGSEA免疫細胞得分,發(fā)現(xiàn)其中包括巨噬細胞在內(nèi)的26種免疫細胞含量不同(圖2E、F)。為了篩選樞紐基因,以26個差異免疫細胞的ssGSEA得分作為性狀,實施了WGCNA。EC和健康樣本被聚類,剔除四個離群樣本(圖3A、B)。通過選擇閾值9,得到16個模塊,并發(fā)現(xiàn)黑色模塊與巨噬細胞ssGSEA評分的顯著相關(guān)性最高(圖3C)。黑色模塊中的733個基因被定義為中心基因。這些基因與巨噬細胞DEGs及其他DEGs相互交叉,從而篩選出43個候選基因(圖4A)。富集分析發(fā)現(xiàn)633個GO術(shù)語,包括巨噬細胞的分化和活化,它們參與了免疫反應(yīng)和其他過程(圖4B)。13個KEGG通路與候選基因相關(guān),其中包括細胞因子-細胞因子受體相互作用、抗原處理和呈遞以及其他通路(圖4C)。

圖2 scRNA-seq數(shù)據(jù)和TCGA-EC隊列中差異表達基因(DEGs)的鑒定A、B:火山圖和scRNA-seq數(shù)據(jù)集中腫瘤樣本和健康樣本中805個巨噬細胞DEGs的熱圖;C、D:火山圖和TCGA-EC隊列中EC和正常樣本間5691個DEGs的熱圖;E、F:TCGA-EC隊列中EC和正常樣本之間26個差異免疫細胞的ssGSEA評分熱圖和箱線圖

圖3 識別與巨噬細胞的ssGSEA得分相關(guān)的模塊A:分析無標度擬合指數(shù)(左)和平均連通性(右)以篩選最佳軟閾值功率;B:基于相似表達模式用不同顏色表示的所有DEG的聚類樹枝圖;C:模塊與26個差異免疫細胞的ssGSEA評分之間的相關(guān)性熱圖

圖4 EC中43個候選基因的鑒定和分析A:黑色模塊中巨噬細胞DEGs、DEGs和樞紐基因共享的43個候選基因維恩圖;B:候選基因的基因本體(GO)分析;C:候選基因中最富集的京都基因組百科全書(KEGG)術(shù)語

2.3 構(gòu)建了一個包括六種生物標志物的風(fēng)險模型 以 HR≠1 &P<0.05 作為篩選條件,對上述43個基因進行單因素Cox回歸分析,最終得到7個預(yù)后相關(guān)基因(圖5A)。使用R包glmnet,對單因素Cox回歸分析得到的7個預(yù)后相關(guān)基因進行Lasso回歸分析。通過Lasso回歸分析,最優(yōu)lambda值為0.01459(圖5B)。最佳lambda值的最低標準是通過10倍交叉驗證確定的,重復(fù)100次,最終得到回歸系數(shù)沒有被懲罰為0的基因共6個,分別為FBP1、LTB、 PTGER4、PARVG、CCR7、HLA-DMB(圖5C)。根據(jù)生物標記物計算出的中位風(fēng)險評分,將訓(xùn)練集和測試集中的EC樣本分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組(圖5D、E)。訓(xùn)練集和測試集的Kaplan-Meier(K-M)曲線顯示,高風(fēng)險組的預(yù)后明顯低于低風(fēng)險組(圖6A、B)。ROC的曲線下面積(AUC)值大多大于0.65。這一結(jié)果表明風(fēng)險模型的預(yù)測效果更佳(圖6C、D)。EC樣本中五種生物標志物(CCR7、FBP1、HLA-DMB、LTB和PARVG)表達水平明顯高于健康供體樣本,而PTGER4表達則呈相反趨勢(圖6E)。相關(guān)性分析結(jié)果表明,CCR7和LTB水平與巨噬細胞水平高度相關(guān)(圖6F)。此外,LTB、PTGER4和PARVG也在T細胞中高表達(圖6G)。

圖5 篩選EC的6個生物標志物以構(gòu)建風(fēng)險模型A:單變量Cox分析篩選與生存相關(guān)的候選基因;B、C:構(gòu)建最小絕對收縮和選擇算子(LASSO)模型以篩選生物標志物,包括LASSO系數(shù)圖(B)和用于調(diào)整參數(shù)選擇的交叉驗證圖(C);D、E:訓(xùn)練集(380例)(D)和測試集(163例)(E)中EC樣本的風(fēng)險評分和生存狀態(tài)分布

圖6 六種生物標志物的綜合分析A、B:訓(xùn)練集(A)和測試集(B)中不同風(fēng)險評分隊列的Kaplan-Meier(K-M)生存分析;C、D:訓(xùn)練集(C)和測試集(D)中風(fēng)險模型預(yù)測性能的接收者操作特征(ROC)分析;E:TCGA-UCEC隊列中EC與正常樣本之間生物標志物的表達;F:生物標志物與巨噬細胞之間的相關(guān)棒棒糖圖;G:scRNA-seq數(shù)據(jù)集中七種細胞中生物標志物表達的點陣圖;***P<0.001,****P<0.0001

2.4 篩選差異免疫細胞和檢查點 根據(jù)腫瘤分期和組織學(xué)分級劃分的各組之間以及漿液性囊腺癌和子宮內(nèi)膜樣腺癌樣本之間的風(fēng)險評分存在明顯差異(圖7A～C)。在兩個風(fēng)險組,基因組變異分析(GSVA)結(jié)果發(fā)現(xiàn)了186條不同程度激活的KEGG通路,如錯配修復(fù)、抗原處理和表達等(圖7D)。根據(jù)ESTIMATE,高風(fēng)險組的免疫和基質(zhì)評分明顯低于低風(fēng)險組。而且,這些分數(shù)與風(fēng)險分數(shù)呈顯著負相關(guān)(圖7E)。在兩個風(fēng)險組發(fā)現(xiàn)了26種不同表達的免疫細胞類型,包括巨噬細胞、活化的CD8T細胞、肥大細胞和其他細胞類型(圖7F)。發(fā)現(xiàn)38個不同調(diào)控的免疫檢查點,在兩個風(fēng)險組顯示出顯著差異(圖7G)。

圖7 EC風(fēng)險模型的臨床相關(guān)性分析和免疫相關(guān)性分析A～C:不同臨床特征組的風(fēng)險評分方框圖,包括腫瘤分期(A)、組織學(xué)分級(B)和不同疾病類型(C);D:以KEGG基因組為背景基因組的基因組變異分析(GSVA);E:風(fēng)險評分和免疫評分以及基質(zhì)評分的相關(guān)散點圖;F:不同風(fēng)險評分隊列中免疫細胞的ssGSEA評分差異方框圖;G:兩個風(fēng)險組間46個免疫檢查點表達差異的方框圖;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001

2.5 繪制了EC的列線圖 單變量和多變量Cox分析結(jié)果表明,風(fēng)險評分、年齡和腫瘤分期(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期)可作為EC的獨立預(yù)后因素(圖8A、B)。因此,這些因素被用來構(gòu)建一個列線圖。校準曲線的斜率更接近于1,這表明列線圖具有更好的預(yù)后預(yù)測性能(圖8C、D)。見表1、2。

表1 單因素Cox模型中各變量參數(shù)

表2 多因素Cox模型中各變量的參數(shù)

圖8 構(gòu)建臨床列線圖A、B:單變量(A)和多變量(B)Cox回歸分析篩選獨立預(yù)后因素;C:根據(jù)風(fēng)險模型、年齡和腫瘤分期構(gòu)建的列線圖;D:直方圖的校準曲線

3 討 論

越來越多的研究表明,TAMs的豐度與EC的進展及不良預(yù)后有關(guān),并可能在抑制抗腫瘤免疫和治療耐藥方面調(diào)節(jié)其治療效果[6]。因此,發(fā)現(xiàn)用于EC預(yù)后和治療的TAM特異性生物標記物勢在必行。然而,在EC中,復(fù)雜的細胞異質(zhì)性給TAMs的生物學(xué)功能和臨床價值帶來了挑戰(zhàn)。應(yīng)用scRNA-seq可評估單細胞之間的基因表達差異,并為闡明與腫瘤及其TME相關(guān)的細胞異質(zhì)性提供了可能。本研究首次利用scRNA-seq轉(zhuǎn)錄組分析鑒定了EC中與TAM相關(guān)的生物標志物,并根據(jù)這些基因構(gòu)建了一個新的預(yù)后模型。

本研究通過scRNA-seq分析獲得了七種細胞類型,包括內(nèi)皮細胞、巨噬細胞等。與之前的研究一致,與健康供體樣本相比,UCEC樣本中巨噬細胞的豐度更高。此外,通過一系列生物信息學(xué)分析和算法,發(fā)現(xiàn)了六個與TAM相關(guān)的生物標志物,包括FBP1、LTB、PTGER4、PARVG、CCR7和HLA-DMB。為了構(gòu)建風(fēng)險模型,根據(jù)這六個與TAM相關(guān)的生物標志物計算了與UCEC患者預(yù)后相關(guān)的風(fēng)險分數(shù)。風(fēng)險分數(shù)越高,預(yù)后越差,且與EC腫瘤分期和分級越高有關(guān)。此外,與低風(fēng)險組相比,高風(fēng)險組的EC樣本與較低的免疫浸潤水平相關(guān)。通過單變量和多變量Cox分析篩選了風(fēng)險評分、年齡和腫瘤分期Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ),得出了UCEC的列線圖。本研究結(jié)果表明TAM相關(guān)DEGs在UCEC中的潛在價值,并為其預(yù)后和治療潛力帶來了新的見解。

與正常子宮內(nèi)膜相比,CCR7、FBP1、HLA-DMB、LTB和PARVG在UCEC樣本中明顯上調(diào)。之前的研究也報道了較高的CCR7[12]、LTB[13]和PARVG[14-15]表達水平與EC較好的預(yù)后相關(guān)。本研究表明,CCR7和LTB與巨噬細胞水平高度相關(guān)。Liu等[15]在EC中發(fā)現(xiàn)了γ-Parvin(PARVG)的低甲基化和較高的mRNA表達水平。此外,PARVG表達減弱與EC患者較短的無病生存期(disease-free survival,DFS)和總生存期(overall survival,OS)相關(guān)[14]。Feng等[14]進一步發(fā)現(xiàn),PARVG基因表達水平與TME中的免疫細胞浸潤相關(guān)。更具體地說,PARVG上調(diào)與EC TME中CD4+T細胞、B細胞和樹突狀細胞(dendriticcells,DCs)的浸潤呈正相關(guān)。表明PARVG有可能通過抗原遞呈細胞(antigen-presenting cells,APC)、T細胞和B細胞啟動針對EC的免疫反應(yīng)。由于目前缺乏對PARVG的相關(guān)研究,其在EC中潛在的預(yù)后和功能調(diào)節(jié)價值有待進一步探討。

C-C趨化因子受體7型(CCR7)是一種能與CCL19和CCL21配體結(jié)合的趨化因子受體,其最重要的生理功能包括T細胞向淋巴結(jié)歸巢。CCR7通過平衡TME中免疫細胞的販運調(diào)節(jié)免疫和耐受性[16]。在免疫攻擊過程中,CCR7一旦與其配體結(jié)合,就調(diào)節(jié)體腔內(nèi)的同源循環(huán),并啟動T細胞的胞內(nèi)過程,引導(dǎo)T細胞趨化歸巢至淋巴結(jié)、腫瘤組織和靶細胞。以往研究中,CCR7表達水平與腫瘤預(yù)后之間的關(guān)系在不同腫瘤類型中存在差異。在結(jié)直腸癌、肝細胞癌和頸部鱗狀細胞癌等癌癥類型中,CCR7可抑制血管生成,并通過細胞毒性腫瘤浸潤淋巴細胞發(fā)揮抗癌作用[16]。淋巴毒素β(Lymphotoxin Beta,LTB)是一種TNF超家族蛋白,可激活NF-κB,并參與形成異三聚體LT-α1/LT-β2配體[17]。異三聚配體進一步與單核細胞、巨噬細胞和DC表面高表達的LTβ受體(LTβR)結(jié)合,并通過這些細胞發(fā)出信號。LTβR信號與I型IFN的產(chǎn)生有關(guān),已被證實在自身免疫中發(fā)揮重要作用。此外,LTβR的激活被證明可介導(dǎo)細胞毒性效應(yīng)。LTβR已被證明參與了CD169+巨噬細胞的分化。LTβR缺失導(dǎo)致病毒特異性CD8+T細胞擴增減少,從而顯示出在多種腫瘤類型中抗癌治療的潛力[18]。HLA-DMB是HLA Ⅱ類基因之一,是HLA-DM家族的成員,屬于非肽結(jié)合型MHC Ⅱ分類。HLA-DM的功能是催化肽交換酶,將內(nèi)體肽有效地負載到MHC-Ⅱ分子。腫瘤特異性抗原和抗原遞呈MHC分子對于在腫瘤組織間質(zhì)中有效開展免疫活動至關(guān)重要。HLA Ⅱ類抗原主要表達在B細胞、巨噬細胞和活化的T細胞等APC的表面。HLA Ⅱ類基因的上調(diào)與輔助性T細胞介導(dǎo)的免疫功能密切相關(guān),可通過激活TME中的T細胞,增強細胞溶解活性和抗腫瘤免疫功能[19]。根據(jù)Callahan等研究,在晚期漿液性卵巢癌患者中,腫瘤細胞中較高的HLA-DMB表達水平與較高的腫瘤浸潤性CD8+T淋巴細胞數(shù)量和較高的生存率相關(guān)[20]。已經(jīng)證實,CCR7、LTB和HLA-DMB在TME中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究揭示了其與TAMs的相關(guān)性,以及作為EC預(yù)后靶點的可能性。然而,關(guān)于其在EC中的相關(guān)功能和機制的研究很有限,尤其是關(guān)于其參與EC-TME中腫瘤細胞和免疫細胞相互調(diào)控的研究。

據(jù)報道,果糖-1,6-二磷酸酶(FBP1)是糖酵解的負調(diào)控因子,在多種腫瘤中發(fā)揮著重要的抑瘤作用[21]。除乳腺癌外,FBP1在多種實體瘤中被下調(diào)。FBP1通常被認為是多種癌癥的保護性預(yù)后因子,包括胃癌、胰腺癌、卵巢癌、宮頸癌[22]。FBP1的抗腫瘤機制包括抑制糖酵解和直接抑制腫瘤生長[23]。FBP1過表達可抑制腫瘤細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)及其增殖、自噬、侵襲和轉(zhuǎn)移,還可促進細胞凋亡[23]。最近,越來越多的證據(jù)揭示了FBP1在調(diào)節(jié)免疫細胞功能方面的新功能。Wang等發(fā)現(xiàn),FBP1表達缺失會抑制程序性死亡配體1(programmed death ligand-1,PD-L1)的表達,增強癌癥免疫力,從而促進腫瘤生長,并對免疫檢查點阻斷療法產(chǎn)生抗藥性[24]。Zhu等[25]證實,在關(guān)節(jié)炎中,FBP1可通過與促激肽原受體(PKR)的蛋白-物理相互作用調(diào)節(jié)巨噬細胞的活化。Cong等[26]證實,FBP1通過損害NK細胞的糖代謝和活力,導(dǎo)致NK細胞功能障礙。肥胖和高脂血癥等代謝紊亂可改變TME,影響抗腫瘤免疫并促進腫瘤遷移。代謝紊亂也會影響UCEC的預(yù)后[26]。本研究表明,FBP1表達越高,EC的預(yù)后越好,這在一個獨立的數(shù)據(jù)集中得到了驗證。因此,認為FBP1可作為未來EC抗腫瘤免疫代謝研究的靶點。

前列腺素E受體4(PTGER4)是四種前列腺素E2(PGE2)受體之一,表達于腫瘤細胞、成纖維細胞和TME中的免疫細胞表面。先前的研究表明,腫瘤組織中PGE2高表達水平會抑制TME中的抗腫瘤免疫,導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸和疾病進展[27]。如TAMs表達PTGER4并進一步促進VEGF-C和D的原位生成,從而促進淋巴管生成,這表明TAMs中的PTGER4在腫瘤進展和轉(zhuǎn)移的多個細胞事件中發(fā)揮關(guān)鍵作用[28]。選擇性抑制PTGER4可抑制腫瘤生長,恢復(fù)腫瘤免疫反應(yīng),達到抗腫瘤的目的[28]。PTGER4還可轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤細胞生存和進展的重要通路,如PI3K/AKT、ERK1/2、EGRF-1和cAMP/PKA/CREB[27]。本研究與前期研究在PTGER4表達水平上存在不一致。前期研究顯示,EC和正常子宮內(nèi)膜樣本中PTGER4表達水平明顯升高[29-30]。造成這些不同結(jié)果的原因之一可能是樣本的異質(zhì)性。本研究納入了TCGA隊列中的547個腫瘤樣本,利用scRNA-seq數(shù)據(jù)在單細胞水平上證明了PTGER4在腫瘤巨噬細胞中的低表達水平。盡管表達趨勢截然不同,但與本研究結(jié)果一致的是,Catalano等在體內(nèi)證明了PTGER4在EC中的腫瘤促進作用,這表明PTGER4是EC的潛在治療靶點[29]。

本研究發(fā)現(xiàn)的6個與TAM相關(guān)的生物標志物中,有4個基因(CCR7、LTB、PARVG和PTGER4)已被報道與EC的預(yù)后相關(guān),這凸顯了它們作為預(yù)后標志物和風(fēng)險模型的可靠性。此外,發(fā)現(xiàn)兩個與UCEC預(yù)后相關(guān)的新分子:FBP1和HLA-DMB。更重要的是,首次發(fā)現(xiàn)了它們與EC TME中TAMs的關(guān)聯(lián)。基于這六個TAM相關(guān)基因,計算了TCGA-EC患者的風(fēng)險評分,并構(gòu)建了一個預(yù)后風(fēng)險模型。高風(fēng)險評分組與較低的免疫浸潤水平、晚期腫瘤分期和分級、差(漿液性)組織型和預(yù)后有關(guān)。因此,從TAM的角度來看,風(fēng)險預(yù)測模型可為EC高危人群提供更精確的個體化治療策略。

本研究存在以下局限性:(1)六個TAM相關(guān)基因可能有不同的作用。這些基因可能與促進或抑制腫瘤發(fā)生有關(guān),也可能與TAM在TME中的不同功能相對應(yīng)。然而,本研究并未發(fā)現(xiàn)TAM亞群有任何獨特的基因功能。(2)沒有進行體外和體內(nèi)實驗來驗證這些生物標志物的有效性。未來將考慮構(gòu)建基因敲除小鼠,以進一步驗證生物標志物的表達水平、潛在功能和機制,尤其是在巨噬細胞亞群中的表達水平、潛在功能和機制。

綜上所述,本研究結(jié)合使用了scRNA-seq數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和TCGA-EC隊列的生存信息,首次確定了六個TAM相關(guān)生物標志物的預(yù)后作用,并構(gòu)建了一個風(fēng)險模型。高風(fēng)險評分組與較低水平的免疫浸潤、晚期腫瘤分期和分級、不良(漿液性)組織型和預(yù)后有關(guān)。本研究為TAMs在TME中的作用提供了新的見解,也為EC患者的精準醫(yī)療提供了潛在的預(yù)后和治療靶點。