他克莫司調(diào)節(jié)YAP/TAZ信號通路對卵巢癌細胞增殖、凋亡和侵襲的影響*

李冬梅,孟維合,康 聰

(衡水市人民醫(yī)院 a.藥學(xué)部;b.婦科,衡水 053000)

卵巢癌主要包括性索間質(zhì)腫瘤、上皮癌及生殖細胞腫瘤三種類型,在婦科惡性腫瘤中死亡率最高,全世界每年約有14萬人死亡,其中90%以上的卵巢癌具有上皮組織學(xué)特征[1]。卵巢癌的治療方法主要是細胞減滅術(shù)聯(lián)合鉑/紫杉醇化療,但由于大多數(shù)卵巢癌患者易復(fù)發(fā),故其5年生存率仍不足一半[2]。他克莫司(FK506)是一種免疫抑制劑,主要通過抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶發(fā)揮作用[3]。近年研究發(fā)現(xiàn),FK506在腫瘤防治方面有良好的效果,Li等[4]發(fā)現(xiàn)FK506通過抑制上皮細胞增殖阻斷口腔癌發(fā)生,而不依賴于其免疫抑制作用,是一種較為安全的治療口腔潛在惡性疾病的方法。在肝癌中,FK506可通過上調(diào)Bcl2-相關(guān)X蛋白(Bax)表達誘導(dǎo)細胞凋亡,并通過下調(diào)VEGF減少血管生成,以及下調(diào)PCNA和細胞周期蛋白D1(CyclinD1)表達抑制細胞周期進程[5]。然而,FK506在卵巢癌中的作用尚不明確。Hippo通路是一種新興的信號通路,與細胞分化、組織穩(wěn)態(tài)及各種類型的人類癌癥有關(guān),Yes相關(guān)蛋白(YAP)和轉(zhuǎn)錄共激活因子PDZ結(jié)合基序(TAZ)是Hippo通路下游兩個核心輔助轉(zhuǎn)錄因子,YAP和TAZ可以入核,與TEAD轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成復(fù)合物,促進靶基因的轉(zhuǎn)錄,進而促進細胞增殖和存活[6]。研究顯示,YAP和TAZ過表達可促進卵巢癌發(fā)生,與患者不良預(yù)后相關(guān),并且是抗腫瘤藥物的新型潛在靶點[7]。本研究旨在探討FK506能否通過調(diào)節(jié)YAP/TAZ信號通路影響卵巢癌細胞的增殖、凋亡和侵襲。

1 材料與方法

1.1 細胞來源 NTCC典型培養(yǎng)物保藏中心提供人正常卵巢上皮細胞系(IOSE80);美國典型培養(yǎng)物保藏中心提供卵巢癌細胞系(SKOV3、OVCAR3、UWB1.289)。上述細胞置于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基、95%空氣和5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 主要材料、儀器 FK506(陜西馨康),PrimeScript RT試劑盒(大連生物),過表達YAP質(zhì)粒(pcDNA-YAP)、沉默YAP載體(si-YAP)及陰性對照(pcDNA-NC、si-NC)(上海基因制藥),凋亡檢測試劑盒(BioVision公司),CCK-8試劑(北京太陽生物);YAP、TAZ、GAPDH、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、Bax及CyclinD1一抗(Abcam公司)。流式細胞儀(BD Biosciences),Transwell室(Millipore公司),Matrigel基質(zhì)膠(BD Bioscience公司),PVDF膜(Bio-Rad),BX41倒置顯微鏡(奧林巴斯公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞分組及處理 選取對數(shù)生長期SKOV3細胞,分為對照組、si-NC組、si-YAP組、pcDNA-NC組、pcDNA-YAP組;對照組、FK506組、FK506+si-NC組、FK506+si-YAP組、FK506+pcDNA-NC組、FK506+pcDNA-YAP組。對照組無需處理;si-NC組、si-YAP組、pcDNA-NC組、pcDNA-YAP組分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-YAP、pcDNA-NC、pcDNA-YAP至SKOV3細胞。參考文獻[8]及預(yù)實驗,FK506組以500μg/L FK506處理細胞;FK506+si-NC組、FK506+si-YAP組分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-YAP至SKOV3細胞后,給予500μg/L FK506處理;FK506+pcDNA-NC組、FK506+pcDNA-YAP組分別轉(zhuǎn)染pcDNA-NC、pcDNA-YAP至SKOV3細胞后,給予500μg/L FK506處理。每組設(shè)置6個復(fù)孔。

1.3.2 qRT-PCR檢測YAP、TAZ mRNA表達水平 用TRIzol試劑提取總RNA。使用PrimeScript RT試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。合成條件:37℃ 15min,85℃ 5s。用SYBR Green PCR試劑盒進行qPCR:95℃ 30s,95℃ 5s,60℃ 19s,共40個擴增循環(huán)。以GAPDH為參照,2-ΔΔCt法分析YAP、TAZ mRNA表達水平。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 CCK-8法檢測細胞增殖 按1000細胞/孔接種于96孔板,37℃和5% CO2條件下培養(yǎng)分別持續(xù)0、24、48h。將10μL CCK8試劑加至每孔,37℃孵育1.5h,450nm處檢測吸光度(OD)。

1.3.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取生長較好的細胞,按上述分組處理48h,胰蛋白酶消化,1000r/min離心5min。PBS洗滌2次,重新懸浮細胞,制備成1×106個/mL細胞懸浮液。取100μL細胞懸液,黑暗中與5μL膜聯(lián)蛋白V/FITC室溫孵育5min,用10μL碘化丙啶染色,流式細胞儀檢測凋亡率。

1.3.5 Transwell實驗檢測細胞侵襲 Transwell上室預(yù)涂Matrigel基質(zhì)膠,將SKOV3細胞按3×104個密度細胞懸浮在無血清培養(yǎng)基,加至上室,將含10% FBS的培養(yǎng)基加至下室。孵育24h,4%多聚甲醛室溫固定侵入涂有基質(zhì)膠濾膜的細胞30min,0.1%結(jié)晶紫室溫染色20min,倒置顯微鏡計數(shù)細胞侵襲數(shù)。

1.3.6 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達水平 通過RIPA裂解從細胞中提取總蛋白,BCA試劑盒定量。將20μg蛋白質(zhì)進行10% SDS-PAGE并轉(zhuǎn)移到PVDF膜,封閉1h,加一抗(YAP、TAZ、CyclinD1、MMP-2、Bax,均為1∶1000稀釋;GAPDH,1∶2000稀釋)4℃過夜。TBST洗滌,膜印跡與辣根過氧化物酶(HRP)綴合的二級抗體(1∶5000稀釋)室溫孵育1h,化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色,用Image J軟件對條帶強度進行定量。

2 結(jié) 果

2.1 卵巢癌細胞系及IOSE80細胞中YAP、TAZ mRNA和蛋白表達 與IOSE80相比,SKOV3、OVCAR3、UWB1.289細胞中YAP、TAZ mRNA和蛋白表達水平均顯著增加(P<0.05),SKOV3細胞變化最顯著,故以SKOV3細胞作為后續(xù)研究對象。見圖1。

圖1 各細胞中YAP、TAZ mRNA和蛋白表達水平A:qRT-PCR檢測YAP、TAZ mRNA表達;B、C:Western blot法檢測YAP、TAZ蛋白表達;*P<0.05 vs IOSE80細胞

2.2 轉(zhuǎn)染效率驗證 與si-NC組相比,si-YAP組YAP、TAZ mRNA和蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與pcDNA-NC組相比,pcDNA-YAP組YAP、TAZ mRNA和蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組細胞中YAP、TAZ mRNA和蛋白表達A:qRT-PCR檢測YAP、TAZ mRNA表達;B、C:Western blot法檢測YAP、TAZ蛋白表達;*P<0.05 vs si-NC組;#P<0.05 vs pcDNA-NC組

2.3 YAP沉默或過表達對SKOV3細胞活力、凋亡和侵襲能力的影響 與si-NC組相比,si-YAP組OD450值(24、48h)、侵襲細胞數(shù)顯著下降(P<0.05),細胞凋亡率顯著增加(P<0.05);與pcDNA-NC組相比,pcDNA-YAP組OD450值(24、48h)、侵襲細胞數(shù)顯著增加(P<0.05),細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖3。

圖3 YAP沉默或過表達對SKOV3細胞活力、凋亡和侵襲能力的影響A:CCK-8法檢測細胞活力;B:各組細胞凋亡水平;C:各組細胞侵襲數(shù)比較;*P<0.05 vs si-NC組;#P<0.05 vs pcDNA-NC組;1:Control;2:si-NC;3:si-YAP;4:pcDNA-NC;5:pcDNA-YAP

2.4 FK506對SKOV3細胞活力的影響 與對照組相比,FK506組24、48h的OD450值顯著下降(P<0.05);與FK506+si-NC組相比,FK506+si-YAP組24、48h的OD450值顯著下降(P<0.05);與FK506+pcDNA-NC組相比,FK506+pcDNA-YAP組24、48h的OD450值顯著增加(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組SKOV3細胞活力比較*P<0.05 vs 對照組;#P<0.05 vs FK506+si-NC組;&P<0.05 vs FK506+pcDNA-NC組

2.5 FK506對SKOV3細胞凋亡的影響 與對照組相比,FK506組細胞凋亡率顯著增加(P<0.05);與FK506+si-NC組相比,FK506+si-YAP組細胞凋亡率顯著增加(P<0.05);與FK506+pcDNA-NC組相比,FK506+pcDNA-YAP組細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組細胞凋亡變化*P<0.05 vs 對照組;#P<0.05 vs FK506+si-NC組;&P<0.05 vs FK506+pcDNA-NC組;1:Control;2:FK506;3:FK506+si-NC;4:FK506+si-YAP;5:FK506+pcDNA-NC;6:FK506+pcDNA-YAP

2.6 FK506對SKOV3細胞中YAP、TAZ mRNA表達的影響 與對照組相比,FK506組YAP、TAZ mRNA表達水平顯著下降(P<0.05);與FK506+si-NC組相比,FK506+si-YAP組YAP、TAZ mRNA表達水平顯著下降(P<0.05);與FK506+pcDNA-NC組相比,FK506+pcDNA-YAP組YAP、TAZ mRNA表達水平顯著增加(P<0.05)。見圖6。

圖6 各組SKOV3細胞中YAP、TAZ mRNA表達水平比較*P<0.05 vs 對照組;#P<0.05 vs FK506+si-NC組;&P<0.05 vs FK506+pcDNA-NC組

2.7 FK506對SKOV3細胞侵襲能力的影響 與對照組相比,FK506組細胞侵襲數(shù)顯著下降(P<0.05);與FK506+si-NC組相比,FK506+si-YAP組細胞侵襲數(shù)顯著下降(P<0.05);與FK506+pcDNA-NC組相比,FK506+pcDNA-YAP組細胞侵襲數(shù)顯著增加(P<0.05)。見圖7。

圖7 各組SKOV3細胞侵襲情況*P<0.05 vs 對照組;#P<0.05 vs FK506+si-NC組;&P<0.05 vs FK506+pcDNA-NC組;1:Control;2:FK506;3:FK506+si-NC;4:FK506+si-YAP;5:FK506+pcDNA-NC;6:FK506+pcDNA-YAP

2.8 FK506對SKOV3細胞中YAP、TAZ、CyclinD1、MMP-2、Bax表達的影響 與對照組相比,FK506組YAP、TAZ、CyclinD1、MMP-2表達水平顯著下降,Bax表達顯著增加(P<0.05);與FK506+si-NC組相比,FK506+si-YAP組YAP、TAZ、CyclinD1、MMP-2表達水平顯著下降,Bax表達顯著增加(P<0.05);與FK506+pcDNA-NC組相比,FK506+pcDNA-YAP組YAP、TAZ、CyclinD1、MMP-2表達水平顯著增加,Bax表達顯著降低(P<0.05)。見圖8。

圖8 各組SKOV3細胞中YAP、TAZ、CyclinD1、MMP-2、Bax蛋白表達*P<0.05 vs 對照組;#P<0.05 vs FK506+si-NC組;&P<0.05 vs FK506+pcDNA-NC組;1:Control;2:FK506;3:FK506+si-NC;4:FK506+si-YAP;5:FK506+pcDNA-NC;6:FK506+pcDNA-YAP

3 討 論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中最致命的癌癥,傳統(tǒng)的治療方法是最大限度地切除腫瘤,然后通過聯(lián)合紫杉醇和鉑類進行化療[9]。70%的患者最初對化療反應(yīng)良好,但5年生存率仍不盡如人意,同時耐藥性和副作用限制了目前化療藥物的使用[10],因此探索新的有效治療藥物有重大意義。

FK506是一種主要的鈣調(diào)磷酸酶抑制劑,已被成功地用作同種異體器官移植后的免疫抑制劑,以防止器官排斥反應(yīng)[11-12]。此外,FK506在腫瘤方面表現(xiàn)出抗癌活性,如在肝癌HepG2和Huh7細胞中,FK506表現(xiàn)出較強的促凋亡和抗增殖特性[13]。在膀胱癌細胞系及異種移植小鼠中,FK506可顯著抑制腫瘤生長,阻止癌細胞集落形成、遷移/侵襲及增加其凋亡[14]。FK506可增強黑色素瘤小鼠的抗腫瘤免疫能力并抑制腫瘤生長[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),FK506處理后,細胞活力、侵襲數(shù)降低,凋亡率增加,表明FK506可抑制SKOV3細胞的增殖和侵襲,促進細胞凋亡。Bax是促進細胞凋亡的重要蛋白;CyclinD1是一種原癌基因,其過度表達可致細胞增殖失控而惡性化;MMP-2主要作用是降解細胞外基質(zhì)蛋白,參與各種癌癥的腫瘤進展和轉(zhuǎn)移,為癌癥的生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示,FK506可降低SKOV3細胞中CyclinD1、MMP-2表達,升高Bax表達,提示FK506可阻止SKOV3細胞的惡性行為的發(fā)展。

YAP及其旁系同源物TAZ是Hippo信號的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)子,作為促癌基因參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[16-17]。先前的研究表明,YAP在人卵巢癌組織中高表達,并且YAP高表達與卵巢組織惡性程度密切相關(guān),可作為該疾病的不良預(yù)后指標(biāo)[18]。TAZ是哺乳動物細胞中YAP的旁系同源物,TAZ mRNA和蛋白水平在卵巢癌中上調(diào),其過度表達與卵巢癌發(fā)展相關(guān),可作為潛在藥物靶點[7]。本研究發(fā)現(xiàn),卵巢癌細胞系(SKOV3、OVCAR3、UWB1.289細胞)中YAP、TAZ mRNA和蛋白表達水平均高于IOSE80細胞,且敲低YAP表達可降低SKOV3細胞活力和侵襲能力,促進細胞凋亡;而上調(diào)YAP表達則呈相反變化,提示卵巢癌發(fā)展可能與YAP/TAZ通路被激活相關(guān)。Feng等[19]發(fā)現(xiàn)YAP/TAZ抑制劑-維替泊芬可防止YAP在細胞核中積累,阻斷YAP的轉(zhuǎn)錄共激活劑活性,有效減少卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲,抑制卵巢癌細胞在體外和體內(nèi)的生長。本研究中,經(jīng)FK506處理后,qRT-PCR及Western blot檢測顯示YAP、TAZ表達均下調(diào),推測FK506可能通過抑制YAP/TAZ通路的激活實現(xiàn)對SKOV3細胞惡性行為的抑制。為驗證該推測,實驗引入si-YAP、pcDNA-YAP及相應(yīng)的陰性對照來敲低或上調(diào)YAP表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低YAP可在FK506處理的基礎(chǔ)上進一步阻止SKOV3細胞增殖、侵襲,促進其凋亡,而上調(diào)YAP表達則逆轉(zhuǎn)了FK506對SKOV3細胞惡性行為的抑制作用,進一步表明FK506通過抑制YAP/TAZ信號通路阻止SKOV3細胞增殖、侵襲,誘導(dǎo)其凋亡。

綜上所述,FK506可抑制SKOV3細胞增殖、侵襲,誘導(dǎo)其凋亡,可能通過抑制YAP/TAZ信號通路完成,成為治療卵巢癌的潛在藥物靶點,但僅在體外細胞中進行驗證,有待進一步開展體內(nèi)研究,以更好地應(yīng)用于臨床。