不同病理類型宮頸癌類器官的培養(yǎng)與鑒定

李春波,李宇祺,張旭垠,華克勤**

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院,上海 200000;2.復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院,上海 200000)

宮頸癌是臨床常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤,發(fā)病率居女性惡性腫瘤第四位[1]。隨著宮頸細(xì)胞學(xué)篩查及HPV疫苗的廣泛應(yīng)用,宮頸癌和癌前病變得以早期發(fā)現(xiàn)和治療,其發(fā)生率呈下降趨勢(shì)[2]。2018年,WHO倡議“宮頸癌消除計(jì)劃”,力爭(zhēng)在2030年全球范圍內(nèi)消除宮頸癌。但是,目前宮頸癌仍是全球女性癌癥發(fā)病率和死亡率最主要的原因之一[3]。對(duì)于早期宮頸癌,手術(shù)結(jié)合放化療可獲得不錯(cuò)的治療效果。對(duì)于晚期或復(fù)發(fā)性宮頸癌,治療手段極其有限,預(yù)后較差。如何針對(duì)不同宮頸癌患者采用精準(zhǔn)治療,根據(jù)特定的標(biāo)記基因或蛋白提出個(gè)體化的診療方案,是復(fù)發(fā)性或晚期宮頸癌所面臨的巨大挑戰(zhàn)[4]。

長(zhǎng)期以來,腫瘤細(xì)胞系模型被用作腫瘤研究的標(biāo)準(zhǔn)化工具,但細(xì)胞在長(zhǎng)期的體外培養(yǎng)中,逐漸喪失親本腫瘤組織的遺傳學(xué)特征及腫瘤異質(zhì)性,這是許多藥物研發(fā)失敗的關(guān)鍵因素之一[5]。類器官(PDO)是一種三維體系培養(yǎng)的具有自我擴(kuò)增與自我組織能力的多細(xì)胞團(tuán),是保留原器官組織結(jié)構(gòu)和生物信息的“微組織”[6]。這種三維體外培養(yǎng)系統(tǒng)可模擬患者體內(nèi)的組織或微環(huán)境,使腫瘤細(xì)胞形成類似器官的組織結(jié)構(gòu),很好地保留了細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的作用情況[7]。培養(yǎng)的類器官可直接測(cè)試藥物的敏感性,服務(wù)于腫瘤研究和新藥篩選。相對(duì)于傳統(tǒng)腫瘤細(xì)胞系模型,腫瘤類器官具有更高的臨床相關(guān)性和個(gè)體多樣性。本研究建立不同病理類型的宮頸癌類器官模型,并對(duì)其進(jìn)行組織病理學(xué)和生物標(biāo)志物鑒定,為后續(xù)宮頸癌研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基,Y-27632,IntestiCult類器官培養(yǎng)基,溫和細(xì)胞裂解液(Stem Cell公司);Ⅰ型膠原酶(美國(guó)伯樂公司);Matrigel基質(zhì)膠(Corning公司);胎牛血清(Gibco公司);Wnt3a、R-spondin-1(Stem Cell公司);磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(Thermo Fisher公司);CD31抗體,p16抗體,Ki67抗體,SOX2抗體(Cell Signaling Technology公司)。24孔平底組織培養(yǎng)板,50mL離心管(Corning公司);70μm濾網(wǎng)(Stem Cell公司);倒置光學(xué)顯微鏡(日本奧利巴斯公司);正置顯微鏡(日本尼康公司);細(xì)胞培養(yǎng)箱,電動(dòng)移液器(Thermo Fisher公司)。

1.2 樣本收集 收集2017年12月至2018年12月復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院收治的17例宮頸癌患者的腫瘤標(biāo)本,患者均接受廣泛全子宮切除術(shù)+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù),診斷基于病理學(xué)。排除標(biāo)準(zhǔn):病理不能明確診斷;合并其他類型腫瘤并充分治療;臨床相關(guān)資料不全。

1.3 宮頸癌類器官培養(yǎng)

1.3.1 樣本洗滌 術(shù)中取新鮮宮頸癌組織大小約0.5cm×0.5cm×0.5cm,快速轉(zhuǎn)移至無菌操作臺(tái)。將樣本置于6cm無菌培養(yǎng)皿,用3mL含1%雙抗的PBS緩沖液浸泡3次,每次10min。

1.3.2 消化及細(xì)胞計(jì)數(shù) 用無菌眼科剪將組織剪碎成糊狀,加等體積(約2mL)1%的Ⅰ型膠原酶,將混懸液置于50mL離心管,37℃恒溫?fù)u床上震蕩消化2h。待混懸液中無明顯塊狀物殘留時(shí),加等體積(約4mL)DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化。用70μm濾網(wǎng)將混懸液過濾至15mL離心管,4℃ 300～400g離心5min,棄上清。加1mL PBS重懸細(xì)胞,吸管輕輕吹打充分混勻,細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),臺(tái)盼藍(lán)染色判斷細(xì)胞活力。

1.3.3 Matrigel準(zhǔn)備 已分裝的Matrigel置于-80℃保存,提前一天將Matrigel取出,4℃過夜。Matrigel需冰上轉(zhuǎn)移及操作,如培養(yǎng)過程中Matrigel凝固呈固體,則棄去。

1.3.4 接種培養(yǎng) 用類器官培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果,調(diào)整細(xì)胞數(shù)量,使500μL類器官培養(yǎng)基中含約5000個(gè)細(xì)胞。輕輕混勻,使用提前預(yù)冷的移液器槍頭加等體積(500μL)Matrigel,輕輕吹打混勻(常規(guī)槍頭可在無菌條件下剪去槍頭尖部)。按150μL/孔接種于提前放置37℃培養(yǎng)箱預(yù)熱的24孔板。將接種后的24孔板,輕輕置于37℃培養(yǎng)箱,促進(jìn)Matrigel凝固。待凝固完成后,每孔加300μL提前預(yù)熱的類器官培養(yǎng)基,輕輕晃動(dòng),保證培養(yǎng)基完全覆蓋Matrigel球體,輕輕置于37℃培養(yǎng)箱維持培養(yǎng),隔天換液1次。宮頸癌類器官培養(yǎng)基成分:DMEM/F-12,FGF10(100ng/mL),FGF7(25ng/mL),FGF2(12.5ng/mL),B27(2%),A83-01(5μmol/L),N-acetylcysteine(1.25mmol/L),nicotinamide(10mmol/L)和Y-27632 10μmol/L。

1.4 宮頸癌類器官傳代 培養(yǎng)12d左右,鏡下測(cè)量類器官長(zhǎng)到直徑普遍為200～300μm時(shí),可按1∶2或1∶3(根據(jù)類器官活性決定)進(jìn)行類器官傳代。Matrigel處理過程同上。棄培養(yǎng)基,加1mL PBS,洗滌2～3次(注意輕柔操作)。加1mL細(xì)胞裂解液打碎類器官,將混懸液轉(zhuǎn)移至新的15mL離心管,利用機(jī)械法對(duì)類器官混懸液進(jìn)行反復(fù)吹打,4℃ 300～400g離心5min,棄上清。重復(fù)2～3次,確保Matrigel完全洗去,同時(shí)可打碎類器官使其呈單細(xì)胞狀態(tài)。接種過程同上。

1.5 宮頸癌類器官明場(chǎng)觀察 對(duì)原代培養(yǎng)宮頸癌類器官進(jìn)行體外培養(yǎng),每隔3d明視野顯微鏡下觀察類器官的形態(tài),可見細(xì)胞數(shù)量逐漸增多、體積不斷增大,測(cè)量并記錄其直徑。

1.6 HE染色及免疫組化檢測(cè) 鏡下觀察類器官生長(zhǎng)情況,待鋪滿培養(yǎng)皿至80%～90%,類器官直徑達(dá)200～300μm時(shí),收集類器官行組織學(xué)染色。棄培養(yǎng)基,PBS輕柔沖洗3遍,沖洗過程中避免損傷打破Matrigel。加lmL細(xì)胞裂解液,用剪去吸頭的吸管輕輕吹打,將混合物轉(zhuǎn)移至15mL離心管,4℃ 200～300g離心5min。冷PBS輕柔沖洗1遍。加5mL冷的1×PBS,置于冰上30min,期間將離心管上下顛倒5～10次或輕輕吹打3～5次,重復(fù)操作,進(jìn)一步促使Matrigel與類器官分離。新鮮配制的4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,切片,以及后續(xù)HE、免疫組化染色。免疫組化檢測(cè):CD31判斷類器官的血管生成情況;p16和Ki67判斷宮頸鱗狀細(xì)胞的惡性潛能及增殖能力。

2 結(jié) 果

2.1 宮頸癌類器官的光鏡觀察 宮頸癌標(biāo)本17例,其中宮頸鱗狀細(xì)胞癌10例,宮頸腺癌3例,子宮內(nèi)膜樣腺癌2例,腺鱗癌2例。累計(jì)成功培養(yǎng)出腫瘤類器官7例,其中鱗癌3例、腺癌2例、內(nèi)膜樣腺癌2例。鏡下大體所見原代培養(yǎng)的宮頸腺癌類器官,大者200～300μm,細(xì)胞呈大小不均一的球形排列,內(nèi)部呈空泡狀。原代培養(yǎng)宮頸癌類器官每隔3d鏡下觀察,隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)(D3至D12),鏡下可見類器官的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多、體積不斷增大。傳代后,可見宮頸癌類器官形態(tài)大小不一,形態(tài)多種多樣,呈極度不規(guī)則細(xì)胞團(tuán)塊狀。繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)日后,可見類器官體積不斷增大、細(xì)胞數(shù)量增多(圖1)。培養(yǎng)12d,類器官直徑可達(dá)200～300μm。

圖1 宮頸癌類器官培養(yǎng)光鏡觀察及Wnt3a+R-spondin-1對(duì)類器官生長(zhǎng)的影響

2.2 宮頸癌類器官培養(yǎng)基的優(yōu)化 類器官培養(yǎng)6d后,繼續(xù)培養(yǎng)3d。一組撤去Wnt3a+R-spondin-1,可見類器官的直徑較小,且形態(tài)略不規(guī)則;一組包含Wnt3a+R-spondin-1,可見類器官形態(tài)較圓,直徑較大。表明含有這兩種物質(zhì)的類器官培養(yǎng)基可更好地促進(jìn)類器官的生長(zhǎng)(圖1)。

2.3 宮頸癌類器官HE染色 將類器官分離后行HE染色,普通型腺癌的類器官形態(tài)規(guī)則,較圓;鱗癌類器官形態(tài)多不規(guī)則,細(xì)胞密度較大;內(nèi)膜樣腺癌類器官的細(xì)胞形態(tài)較大,但數(shù)量較少。表明不同類型宮頸癌類器官具有不同的形態(tài)學(xué)特征。明場(chǎng)觀察也證實(shí)了這一觀點(diǎn)(圖2)。宮頸腺癌組織和腺癌類器官有著相似的形態(tài)特點(diǎn)(圖3)。

圖2 不同病理類型腫瘤類器官的HE染色及光鏡圖

2.4 宮頸癌類器官免疫組化鑒定 免疫組化結(jié)果顯示,CD31在宮頸癌類器官中的表達(dá)較弱;Ki67在類器官中的表達(dá)弱于原腫瘤組織,兩者的p16表達(dá)類似(圖3)。

3 討 論

宮頸癌是一種高度異質(zhì)性疾病,腫瘤細(xì)胞在不同患者之間,從基因型到表型都存在很大差異。所以不同患者對(duì)同樣的臨床治療模式反應(yīng)差異很大[8]。近年來,大量研究利用細(xì)胞系與在體模型對(duì)腫瘤的治療機(jī)制進(jìn)行了大量探索,但研究結(jié)果仍有爭(zhēng)議。這可能與疾病模型的限制有關(guān):細(xì)胞系為體外2D培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞脫離腫瘤實(shí)際環(huán)境生長(zhǎng),其形態(tài)、基因表達(dá)與原發(fā)腫瘤產(chǎn)生較大差異;而在體模型多采用小鼠,相較人體也存在巨大的種系差異[9]。因此,如何建立基于人體自身的腫瘤模型對(duì)其進(jìn)行機(jī)制研究和藥物開發(fā)都具有重要意義。隨著腫瘤類器官的出現(xiàn),可通過分析維持癌組織內(nèi)在特征的體外模型,驗(yàn)證藥物治療敏感性靶點(diǎn)。本研究成功培養(yǎng)出不同病理類型的宮頸癌類器官,詳細(xì)介紹了類器官的培養(yǎng)過程,從而推動(dòng)宮頸癌類器官在宮頸癌研究中的應(yīng)用。

類器官(PDO)是一種體外3D培養(yǎng)的具有自我更新和組織能力的多細(xì)胞團(tuán),是保留原器官組織結(jié)構(gòu)和生物信息的“微組織”[10]。這種三維體外培養(yǎng)系統(tǒng)可模擬患者體內(nèi)的組織或微環(huán)境,使腫瘤細(xì)胞形成類似器官的組織結(jié)構(gòu),很好地保留了細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的作用情況。類器官模型在腫瘤研究中存在巨大潛力,但培養(yǎng)技術(shù)較為繁瑣,國(guó)際缺乏統(tǒng)一有效的標(biāo)準(zhǔn),尚未建立起完善的生物樣本庫,因此目前仍處于基礎(chǔ)研究階段。類器官培養(yǎng)過程復(fù)雜、培養(yǎng)條件苛刻,保證宮頸癌類器官的不斷生長(zhǎng)最為重要[11]。Maru等[12]報(bào)道了1例宮頸透明細(xì)胞癌患者的腫瘤類器官,并進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月的培養(yǎng)。并證實(shí)該類器官模型和原發(fā)腫瘤組織具有相同的突變類型,可用于化療藥物的篩選及放療敏感性的測(cè)試。Gurumurthy等[13]利用人和鼠宮頸成功構(gòu)建了類器官模型,并探索利用類器官研究HPV感染所致宮頸癌的發(fā)病過程,證實(shí)了該方法的可行性及有效性,這些研究豐富了宮頸癌研究的方法和手段。本研究詳細(xì)介紹了宮頸癌類器官的培養(yǎng)過程,并進(jìn)行了優(yōu)化。在最初條件摸索階段,對(duì)消化時(shí)間、消化程度、培養(yǎng)基中細(xì)胞接種密度等反復(fù)調(diào)整,從而從部分樣本中獲得了原代類器官。另外,類器官體外培養(yǎng)階段易出現(xiàn)因缺乏營(yíng)養(yǎng)及氧供而凋亡的狀況,因此需密切注意類器官生長(zhǎng)狀態(tài),及時(shí)傳代。培養(yǎng)方法逐漸成熟后,后期獲得的腫瘤標(biāo)本建成率提高。本研究發(fā)現(xiàn),宮頸癌類器官在培養(yǎng)過程中,細(xì)胞數(shù)量不斷增多,類器官的體積不斷增大。培養(yǎng)12d后,類器官直徑可達(dá)200～300μm,可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。一個(gè)重要的特征是類器官在培養(yǎng)過程中,即使經(jīng)數(shù)次傳代,仍保留著腫瘤細(xì)胞的形態(tài)。3D培養(yǎng)條件下的類器官保留了宮頸癌組織的高度復(fù)雜性,可很好地體現(xiàn)腫瘤異質(zhì)性,能模擬腫瘤體外生物學(xué)行為。

腫瘤類器官能成功構(gòu)建的前提條件是腫瘤組織中含有腫瘤干細(xì)胞。在三維培養(yǎng)體系中,腫瘤干細(xì)胞可自我更新和多向分化,從而形成可模擬原器官組織的結(jié)構(gòu)。因此,為了實(shí)現(xiàn)宮頸癌類器官的長(zhǎng)期培養(yǎng),需在培養(yǎng)基中引入多種生長(zhǎng)因子。并且多數(shù)因子與腫瘤干細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化相關(guān),并抑制干細(xì)胞的凋亡[14]。其中R-spondin-1和Wnt5a對(duì)腫瘤干細(xì)胞的附著和生長(zhǎng)過程中的信號(hào)激活至關(guān)重要。R-spondin-1是G蛋白偶聯(lián)受體4/5(G-protein coupled receptor 4/5,LGR4/5)配體,一種Wnt通路激動(dòng)劑,富含亮氨酸重復(fù)序列,可在體外長(zhǎng)期保持干細(xì)胞種群增長(zhǎng)[15]。Wnt5a是Wnt蛋白家族成員之一,通過與膜蛋白受體或共受體復(fù)合物結(jié)合激活細(xì)胞中的磷酸化蛋白信號(hào),激活Wnt信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控多種細(xì)胞功能包括促進(jìn)干細(xì)胞的增殖[16]。本研究對(duì)比缺乏和加入R-spondin-1和Wnt5a對(duì)腫瘤類器官的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些因子對(duì)維持宮頸癌類器官的生長(zhǎng)至關(guān)重要。

類器官培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展,為惡性腫瘤的研究開辟了新途徑。通過類器官模型,可獲得更多的診斷與治療的信息。但是關(guān)于類器官在宮頸癌相關(guān)研究中的應(yīng)用仍較少,特別是關(guān)于晚期宮頸癌對(duì)放療敏感性的研究更是缺乏。因此,類器官技術(shù)可否應(yīng)用于宮頸癌的研究和治療需進(jìn)一步證實(shí)。本研究詳細(xì)介紹了不同病理類型的宮頸癌類器官培養(yǎng)方法,并進(jìn)行了組織學(xué)驗(yàn)證。初步明確了宮頸癌類器官在反映原位腫瘤性質(zhì)的有效性,為宮頸癌的研究提供了新的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>