不同采樣方法在子宮內(nèi)膜癌甲基化檢測(cè)輔助診斷中的效能比較*

李 莉,謝 涵,胡 婷,周 虎,李 希,陳 剛

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科,武漢 430030)

子宮內(nèi)膜癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)腫瘤之一。據(jù)2019年國(guó)家癌癥中心統(tǒng)計(jì)發(fā)病率為10.28/10萬,死亡率為1.9/10萬[1]。近年來,隨著人口老齡化、肥胖比例的增加和良性子宮切除術(shù)的減少,其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)[1]。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)水平的提升,肥胖、高血壓、糖尿病發(fā)生率增加,中國(guó)子宮內(nèi)膜癌的粗發(fā)病率及標(biāo)化發(fā)病率均呈上升趨勢(shì)[2]。有研究預(yù)測(cè),2020年至2030年,我國(guó)子宮內(nèi)膜癌標(biāo)化發(fā)病率將持續(xù)上升,2030年時(shí)發(fā)病人數(shù)將突破13萬人,同時(shí)標(biāo)化死亡率出現(xiàn)小幅上升[2]。因此,提前優(yōu)化疾病防治策略、提高篩查水平至關(guān)重要。

子宮內(nèi)膜癌的主要癥狀是異常子宮出血或絕經(jīng)后陰道出血,在約90%的患者中可能出現(xiàn)。但是,絕經(jīng)后陰道出血患者中,僅5%～10%可能是子宮內(nèi)膜癌或子宮內(nèi)膜不典型增生[1];在異常子宮出血的患者中,最終診斷子宮內(nèi)膜癌的比例更低,僅0.3%[1]。目前,診斷性刮宮或?qū)m腔鏡下活檢是診斷子宮內(nèi)膜癌的常用方法,但作為侵入性操作,可能導(dǎo)致子宮穿孔、感染和出血等并發(fā)癥,臨床依從性低。由于缺乏無創(chuàng)性的檢測(cè)方法,患有異常子宮出血或絕經(jīng)后陰道出血的婦女不得不通過刮宮和宮腔鏡下活檢來排除子宮內(nèi)膜癌及癌前病變。大多數(shù)子宮內(nèi)膜癌為I型雌激素依賴型,可能從子宮內(nèi)膜增生發(fā)展到不典型增生并持續(xù)數(shù)年,最后才進(jìn)展到子宮內(nèi)膜癌。在疾病進(jìn)展的漫長(zhǎng)過程中,患者需反復(fù)多次接受侵入性檢查,給患者造成身體上、心理上的巨大壓力。

大量研究表明,DNA甲基化在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用,在基因表達(dá)的調(diào)控中起著重要作用,發(fā)生在基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化通常導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄沉默,而基因體內(nèi)的甲基化導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄激活[3]。過去幾十年,DNA甲基化與早期癌癥檢測(cè)和診斷的相關(guān)研究不斷增加[4]。大量研究表明,無創(chuàng)的DNA甲基化檢測(cè)在子宮內(nèi)膜癌早期診斷中可起到重要作用,但目前在臨床中的應(yīng)用仍非常有限[5-8]。本課題組前期研究篩選出3個(gè)有顯著敏感性和特異性的甲基化位點(diǎn),分別采用宮腔刷(Tao)和宮頸刷(Pap)采樣方式進(jìn)行檢測(cè)。本研究旨在比較兩種采樣方法在子宮內(nèi)膜癌輔助診斷中的檢測(cè)效能,為臨床進(jìn)一步的應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料與方法 2023年7月13日至2023年10月26日在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院門診招募了517例懷疑子宮內(nèi)膜病變,擬行診斷性刮宮或?qū)m腔鏡下子宮內(nèi)膜活檢的患者。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡35歲及以上;(2)絕經(jīng)后陰道出血,高度懷疑子宮內(nèi)膜癌;(3)經(jīng)陰道B超(TVS)、磁共振(MRI)或?qū)m腔鏡檢查,提示內(nèi)膜病變(增厚、異?；芈暤?,高度懷疑子宮內(nèi)膜癌。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他婦科癌前病變或惡性腫瘤疾病(如CIN、宮頸癌或卵巢癌等);(2)術(shù)后病檢提示宮頸腺癌轉(zhuǎn)移至子宮內(nèi)膜;(3)合并宮頸管狹窄,子宮內(nèi)膜采樣器無法順利進(jìn)入宮腔;(4)研究人員認(rèn)為其他原因不適合臨床試驗(yàn)者;(5)妊娠或哺乳期婦女。按納入與排除標(biāo)準(zhǔn),最終納入499例患者。

宮腔和宮頸脫落細(xì)胞采集在子宮內(nèi)膜活檢前進(jìn)行,均由有同濟(jì)醫(yī)院具有資質(zhì)的醫(yī)生完成。同時(shí)收集相關(guān)臨床信息,包括年齡、既往史、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、子宮內(nèi)膜活檢前1個(gè)月內(nèi)子宮內(nèi)膜厚度(經(jīng)陰道超聲評(píng)估)等。以子宮內(nèi)膜活檢病理結(jié)果為診斷金標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(批號(hào):TJ-IRB20220801),檢測(cè)前患者均簽署知情同意書。

1.2 采樣方法 活檢前均采用宮頸刷和宮腔刷采樣進(jìn)行DNA甲基化檢測(cè),先行宮頸刷采樣,再行宮腔刷采樣。宮頸刷采樣方法:用棉簽擦去宮頸分泌物,將無菌毛刷伸入宮頸口2cm收集子宮頸管細(xì)胞,將無菌毛刷沿同一方向旋轉(zhuǎn)360度5次,取出宮頸刷,放入細(xì)胞保存液中。宮腔刷采樣方法:患者截石位,消毒外陰陰道,輕輕將宮腔刷插入到宮底水平,按同一方向旋轉(zhuǎn)4～5圈,取出宮腔刷,浸入細(xì)胞保存液中。

1.3 DNA甲基化檢測(cè)及判斷 將細(xì)胞保存液中的細(xì)胞離心分離,用細(xì)胞DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取,用DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒將提取的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化,立即行PCR檢測(cè)。按照“人CDO1/AJAP1/GALR1基因甲基化檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)”(武漢凱德維斯)產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0軟件,計(jì)數(shù)資料用率(%)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。計(jì)量資料兩組間比較采用t檢驗(yàn)。宮腔刷和宮頸刷兩組間檢測(cè)效能率的比較采用McNemar卡方檢驗(yàn)。利用受試者工作特征(receiveroperator characteristic,ROC)曲線下面積(area under curve,AUC)評(píng)估各指標(biāo)診斷子宮內(nèi)膜癌的效果,并計(jì)算靈敏度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、OR值及其各自的95%CI。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者一般情況 共納入499例患者,其中正常對(duì)照組222例,病例組277例(子宮內(nèi)膜不典型增生37例,子宮內(nèi)膜癌240例)。240例子宮內(nèi)膜癌患者,Ⅰa期123例,Ⅰb期82例,Ⅱ～Ⅲ期35例;組織學(xué)分級(jí)G1 125例,G2 91例,G3 24例;病理類型子宮內(nèi)膜樣腺癌228例,其他類型12例。病例組和對(duì)照組的年齡、絕經(jīng)情況、BMI比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),兩組的平均子宮內(nèi)膜厚度、高血壓病史、糖尿病病史比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 病例組和對(duì)照組的基線信息比較

2.2 兩種不同采樣方式的邏輯回歸分析 宮腔刷采樣組的三靶點(diǎn)組合模式下靈敏度最高[96.03%(93.03%～97.77%)]。宮頸刷采樣組,不論是單靶點(diǎn)還是三靶點(diǎn)模式下靈敏度均在59.21%～75.45%之間,低于宮腔刷采樣組的單靶點(diǎn)和三靶點(diǎn)模式。三靶點(diǎn)模式下,宮腔刷采樣組的特異性為91.89%(87.55%～94.81%),高于宮頸刷采樣組[76.58%(70.58%～81.67%)]。ROC曲線提示,宮腔刷采樣組的三靶點(diǎn)模式下AUC最高[96.81%(95.09%～98.53%)]。宮頸刷采樣組不論是單靶點(diǎn)還是三靶點(diǎn)模式下AUC均在65.27%～81.33%之間,低于宮腔刷采樣組的單靶點(diǎn)和三靶點(diǎn)模式。見表2和圖1。

圖1 各檢測(cè)靶點(diǎn)及不同采樣方法對(duì)子宮內(nèi)膜病變輔助診斷的受試者工作特征曲線圖A:宮腔刷采樣組;B:宮頸刷采樣組

表2 兩種采樣方式下不同檢測(cè)靶點(diǎn)診斷效能的ROC曲線分析對(duì)比

2.3 不同采樣方式檢測(cè)性能對(duì)比分析 采用McNemar方法進(jìn)行分組配對(duì),病例組及對(duì)照組CDO1、GALR1、AJAP1單靶點(diǎn)及三個(gè)靶點(diǎn)聯(lián)合檢測(cè)中兩種采樣方式進(jìn)行比較,除對(duì)照組AJAP1外,宮腔刷與宮頸刷采樣的檢測(cè)性差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),宮腔刷采樣組的檢測(cè)效能均顯著優(yōu)于宮頸刷采樣組,見表3～6。

表4 GALR1靶點(diǎn)檢測(cè)中兩種采樣方式檢測(cè)性能對(duì)比分析

表5 AJAP1靶點(diǎn)檢測(cè)中兩種采樣方式檢測(cè)性能對(duì)比分析

表6 CDO1/AJAP1/GALR1三個(gè)靶點(diǎn)聯(lián)合檢測(cè)中兩種采樣方式檢測(cè)性能對(duì)比分析

3 討 論

陰道出血是子宮內(nèi)膜癌的常見癥狀,但絕經(jīng)前異常子宮出血女性中僅0.33%最終確診為子宮內(nèi)膜癌,絕經(jīng)后陰道出血患者中僅5%～10%最終診斷為子宮內(nèi)膜癌[9-10]。目前臨床常用的檢測(cè)方法,如診斷性刮宮和宮腔鏡下子宮內(nèi)膜活檢術(shù),均為有創(chuàng)操作,給患者帶來較大的身體、心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。隨著全球老齡化和肥胖女性增加,子宮內(nèi)膜發(fā)病率呈上升趨勢(shì),尤其以育齡期婦女發(fā)病率升高最顯著[11]。這將給臨床工作帶來新的挑戰(zhàn),亟需開發(fā)新的、無創(chuàng)輔助診斷方法。

宮頸刷和宮腔刷都屬于無創(chuàng)的采樣方式,常規(guī)就診時(shí)方便獲得,無需麻醉。宮腔刷允許取樣器插入宮腔,離腫瘤解剖位置最近,不會(huì)損傷子宮肌層,理論上檢測(cè)效能更高。回顧既往發(fā)表文獻(xiàn),Wang等[12]開發(fā)了一種名為PapSEEK的檢測(cè),使用宮腔刷(Tao刷)和宮頸刷(Pap刷)分別進(jìn)行取樣進(jìn)行突變和非整倍體的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)用Tao刷進(jìn)行子宮內(nèi)膜取樣比用Pap刷進(jìn)行宮頸內(nèi)取樣能明顯提高子宮內(nèi)膜癌的檢出率。2022年Wang等采用宮腔刷采集子宮內(nèi)膜細(xì)胞進(jìn)行CDO1和ZNF454基因的DNA甲基化檢測(cè),靈敏度和特異性分別達(dá)到90.91%和86.84%,顯示出良好的檢測(cè)性能[13]。文獻(xiàn)報(bào)道,與有創(chuàng)子宮內(nèi)膜活檢相比,宮腔刷進(jìn)入子宮容易且相對(duì)無痛,患者接受度更高[12,14-15]。本研究結(jié)果顯示,宮腔刷的靈敏度、特異性、一致性方面均優(yōu)于宮頸刷。一般來說,在輔助診斷中需要良好的靈敏度以避免假陰性,在有癥狀的患者和無癥狀高危婦女中,都需要良好的特異性以避免過多有創(chuàng)檢查,因此宮腔刷更適宜進(jìn)行臨床推廣。

綜上所述,本文通過研究DNA甲基化在子宮內(nèi)膜癌輔助診斷中的作用,以及不同采樣方式的效能對(duì)比,為臨床疑似子宮內(nèi)膜癌患者提供一種客觀、無創(chuàng)、準(zhǔn)確度高的檢測(cè)方式。目前,該采樣方法聯(lián)合DNA甲基化檢測(cè)的策略也正在大規(guī)模的隊(duì)列研究中進(jìn)行驗(yàn)證,在未來可望顯著減少子宮內(nèi)膜活檢的有創(chuàng)性操作,有效提高患者的依從性,緩解醫(yī)療資源緊缺等問題。