基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探究黃芪-地黃藥對治療糖尿病的作用機制▲

李杜廉 陶曉靜 程輝標

[1 柳州市中醫(yī)醫(yī)院(柳州市壯醫(yī)醫(yī)院)藥學(xué)部,廣西柳州市 545001;2 廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會辦公室,廣西南寧市 530021]

糖尿病是由胰島素分泌缺陷或胰島素抵抗引起的以高血糖為主要特征的代謝性疾病。流行病學(xué)調(diào)查顯示,中國成人糖尿病標化患病率為10.9%,其中2型糖尿病患者約占90%以上[1-2]。目前,臨床上治療糖尿病主要依靠口服降糖藥或注射胰島素控制血糖,但藥物治療控制率僅為49.2%,仍有部分患者的療效欠佳,且存在個體化藥物治療難實現(xiàn)、副作用多等問題[3]。中醫(yī)藥注重整體辨治,未病先防,在糖尿病的防治中有著極其重大的臨床意義。糖尿病屬于中醫(yī)學(xué)“消渴病”范疇,病機為陰虛燥熱、氣血津液失調(diào),臨床表現(xiàn)多以氣陰兩虛為本、燥熱為標,治療當(dāng)取補氣益陰、清熱潤燥、生津止渴之法[4-5]。劉鑫等[6]對治療2型糖尿病的中藥方劑進行組方規(guī)律分析,發(fā)現(xiàn)使用頻次較高的藥物是黃芪、生地黃、山藥、黃連、麥冬等益氣健脾、養(yǎng)陰生津、清熱瀉火類藥物,高頻藥對組合有黃芪-生地黃、黃芪-山藥、生地黃-麥冬、黃芪-丹參、生地黃-天花粉等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,黃芪、地黃治療糖尿病的療效明確[7-8],但未見有關(guān)黃芪-地黃藥對聯(lián)合使用治療糖尿病的作用靶點及機制的研究報告。基于此,本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù),探討黃芪-地黃藥對治療糖尿病的作用機制,為臨床使用含黃芪-地黃藥對的組方治療糖尿病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 黃芪-地黃藥對的活性化學(xué)成分及其作用靶點的篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP;http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索黃芪的化學(xué)成分,以口服生物利用度≥30%、藥物相似性≥0.18作為篩選標準[9],獲得黃芪的活性化學(xué)成分。在中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine,TCMIP)v2.0(http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/Login/login.html)檢索地黃的活性化學(xué)成分。將黃芪和地黃的活性化學(xué)成分分別輸入PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得對應(yīng)的簡化分子線性輸入規(guī)范名稱后,利用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)獲得活性化學(xué)成分的作用靶點,去除重復(fù)的靶點。

1.2 糖尿病相關(guān)靶點的篩選與黃芪-地黃藥對治療糖尿病相關(guān)靶點的獲取 以“diabetes mellitus”為關(guān)鍵詞,在GeneCards?數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/home/)中檢索糖尿病相關(guān)靶點,匯總并去除兩個數(shù)據(jù)庫檢索到的重復(fù)靶點,得到糖尿病相關(guān)靶點。將黃芪-地黃藥對活性化學(xué)成分的作用靶點與糖尿病相關(guān)靶點上傳至微生信在線平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/),取交集后獲得交集靶點,即黃芪-地黃藥對治療糖尿病的相關(guān)靶點,并繪制韋恩圖。

1.3 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)及藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將交集靶點上傳到 STRING平臺(https://string-db.org/),運用“Multiple Proteins”項,設(shè)置物種為“homo sapiens”、蛋白相互作用最低分數(shù)為0.4進行篩選,構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)。將PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件,篩選出度值最高的前5個靶點作為核心靶點。將黃芪-地黃藥對的活性化學(xué)成分和交集靶點上傳至Cytoscape 3.9.0軟件中,構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò),篩選出度值最高的前6個活性化學(xué)成分作為黃芪-地黃藥對的核心活性化學(xué)成分。

1.4 交集靶點的功能富集分析和通路富集分析 采用Metascape軟件(https://metascape.org/gp/)對交集靶點進行基因本體論(Gene Ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,以P<0.05作為篩選條件。進行GO功能富集分析時按照-lgP值由高到低排序,進行KEGG通路富集分析時按照基因比例從高到低排序,選取GO功能富集分析中排名前10的條目和KEGG通路富集分析中排名前20的條目,應(yīng)用微生信在線平臺對結(jié)果進行可視化處理。

1.5 分子對接分析 將1.3得出的核心靶點和核心活性化學(xué)成分分別作為受體和配體進行分子對接驗證。在PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org)中下載5個核心靶點的.pdb格式文件,先應(yīng)用PyMOL軟件對靶點蛋白進行去水、去溶劑分子、去配體,再利用AutoDock Tools 1.5.7軟件將靶點蛋白加全氫并轉(zhuǎn)換為.pdbqt格式。從PubChem數(shù)據(jù)庫中下載6個核心活性化學(xué)成分的3D結(jié)構(gòu),先使用在線工具Open Babel(http://openbabel.org/wiki/Main_Page)將其轉(zhuǎn)換為.mol2格式,再利用AutoDock Tools 1.5.7軟件進行加全氫、設(shè)置扭轉(zhuǎn)鍵操作并導(dǎo)出為.pdbqt格式。根據(jù)每個受體蛋白結(jié)構(gòu)的大小不同,選擇不同的GridBox,其余選項選擇默認參數(shù),采用拉馬克遺傳算法(Lamarckian GA4.2)將受體蛋白和配體分子進行半柔性對接,獲取對接的結(jié)合能(結(jié)合能為負值時表明配體與受體可以自由結(jié)合,絕對值越大代表兩組結(jié)合的程度越高),最后利用PyMOL 2.6軟件制作受體與配體的結(jié)合模式圖。

2 結(jié) 果

2.1 黃芪-地黃藥對治療糖尿病的相關(guān)靶點 通過TCMSP和TCMIP數(shù)據(jù)庫分別獲得13個黃芪活性化學(xué)成分和12個地黃活性化學(xué)成分(見表1),經(jīng)SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫檢索并去重后得到上述25個活性成分的作用靶點共582個。通過GeneCards?和DisGeNET數(shù)據(jù)庫獲取糖尿病相關(guān)靶點共1 646個。通過微生信在線平臺,對黃芪-地黃藥對活性化學(xué)成分的作用靶點和糖尿病相關(guān)靶點取交集并繪制韋恩圖,共獲得176個黃芪-地黃藥對治療糖尿病的相關(guān)靶點,見圖1。

表1 黃芪-地黃藥對的活性化學(xué)成分

2.2 交集靶點的PPI網(wǎng)絡(luò) 利用STRING平臺和Cytoscape 3.9.0軟件構(gòu)建交集靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖2),去除孤立節(jié)點后,該PPI網(wǎng)絡(luò)由1 977條邊和175個節(jié)點組成。度值排名前5位的靶點分別為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase,AKT)1、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、GAPDH、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、原癌基因酪氨酸蛋白激酶(proto-oncogene tyrosine-protein kinase,SRC)。

圖2 黃芪-地黃藥對治療糖尿病相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.3 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò) 通過Cytoscape 3.9.0軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)(見圖3),該網(wǎng)絡(luò)共有204個節(jié)點、963條邊。度值排名前6位的核心活性化學(xué)成分為異鼠李素、華良姜素、山柰酚、槲皮素、3,9-di-O-美迪紫檀素、京尼平苷。

圖3 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果 GO功能富集分析結(jié)果顯示,交集靶點主要涉及的生物過程包括對激素的反應(yīng)、對無機物的反應(yīng)、細胞對含氮化合物的反應(yīng)等,涉及的細胞組分包括膜筏、膜微區(qū)、細胞質(zhì)的核周區(qū)域等,涉及的分子功能包括以醇基為受體的磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、蛋白激酶活性、激酶活性等,見圖4。

圖4 GO功能富集分析結(jié)果柱狀圖

KEGG通路富集分析顯示,交集靶點主要涉及癌癥通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/AKT信號通路、化學(xué)致癌-受體活化、胰島素信號通路、前列腺癌、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、胰島素抵抗、乙型肝炎、內(nèi)分泌抵抗、TNF信號通路、低氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor 1,HIF-1)信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、雌激素信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end product,AGE)-AGE受體(receptor for AGE,RAGE)信號通路等,見圖5。

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖

2.5 分子對接分析結(jié)果 分子對接分析結(jié)果顯示,所有核心活性化學(xué)成分與核心蛋白的結(jié)合能均<-2.0 kcal/mol,見圖6,說明配體與受體對接結(jié)果良好。將結(jié)合能絕對值由高到低進行排序,排名前4的對接組合為3,9-di-O-美迪紫檀素與GAPDH、山柰酚與GAPDH、3,9-di-O-美迪紫檀素與TNF、3,9-di-O-美迪紫檀素與SRC。其中,3,9-di-O-美迪紫檀素可與GAPDH上的ALA-238、ASN-239殘基發(fā)生相互作用,山柰酚可與GAPDH上的ASN-239、ASN-287、PRO-236、LEU-203、GLN-204殘基發(fā)生相互作用,3,9-di-O-美迪紫檀素可與TNF上的GLY-148、VAL-150殘基發(fā)生相互作用,3,9-di-O-美迪紫檀素可與SRC上的MET-341、SER-345、THR-338殘基發(fā)生相互作用,見圖7。

圖6 分子對接結(jié)合能熱圖

圖7 結(jié)合能絕對值排名前4的分子對接結(jié)果模式圖

3 討 論

本研究結(jié)果顯示,黃芪-地黃藥對治療糖尿病的核心活性化學(xué)成分為3,9-di-O-美迪紫檀素、異鼠李素、山柰酚、槲皮素、京尼平苷、華良姜素。研究顯示,黃芪中的活性化學(xué)成分3,9-di-O-美迪紫檀素與2型糖尿病腎病密切相關(guān),其可通過作用于3-羥酰輔酶A脫氫酶和乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶來影響丁酸和丙酸代謝,從而使2型糖尿病腎病大鼠模型的短鏈脂肪酸恢復(fù)至正常水平,起到調(diào)節(jié)脂肪組織、骨骼肌和肝組織功能的作用,進而改善葡萄糖穩(wěn)態(tài)和胰島素敏感性[10]。異鼠李素不僅可通過抑制IκB激酶/核因子κB抑制蛋白/核因子κB/誘導(dǎo)型一氧化氮合酶信號通路,來減輕高糖高脂誘導(dǎo)的胰島β細胞損傷,還可抑制α-葡萄糖苷酶活性并增加胰島素抵抗HepG2細胞的葡萄糖消耗量[11-12]。山柰酚與槲皮素結(jié)構(gòu)相似,藥理作用相近,可有效降低空腹血糖水平,改善胰島素抵抗和糖脂代謝紊亂[13-15]。京尼平苷能減輕高糖對胰島β細胞系INS-1細胞的損傷,抑制INS-1細胞的凋亡,保護胰島功能,從而起到降糖的作用[16]。研究表明,華良姜素對異常血管新生具有較強的抑制作用,可用于治療血管新生引發(fā)的癌癥、糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變等疾病[17]。上述研究表明黃芪-地黃藥對主要通過上述核心活性化學(xué)成分發(fā)揮降血糖作用,是該藥對治療糖尿病的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

本研究通過PPI網(wǎng)絡(luò)得到黃芪-地黃藥對治療糖尿病的5個核心靶點,分別為AKT1、TNF、GAPDH、EGFR和SRC。GO功能富集分析結(jié)果表明,黃芪-地黃藥對治療糖尿病的相關(guān)靶點涉及膜筏、膜微域、細胞質(zhì)的核周區(qū)域等細胞組分,通過調(diào)節(jié)以醇基為受體的磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、蛋白激酶活性、激酶活性等分子功能,在對激素、無機物及含氮化合物的反應(yīng)等生物過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,黃芪-地黃藥對治療糖尿病的相關(guān)靶點涉及多個信號通路,包括PI3K/AKT信號通路、胰島素信號通路、胰島素抵抗、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路等。研究顯示,胰島素發(fā)揮降血糖作用主要是通過與胰島素受體底物(insulin receptor substrate,IRS)結(jié)合,引起下游信號通路級聯(lián)反應(yīng),即激活PI3K和AKT1,將信號傳導(dǎo)至葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白成員4(glucose transporter member 4,GLUT4)以開啟葡萄糖轉(zhuǎn)運,因此IRS-1/PI3K/AKT/GLUT4信號通路是胰島素信號傳導(dǎo)通路中的“主干道”,PI3K/AKT信號通路及下游靶蛋白功能障礙均會引起糖脂代謝異常,導(dǎo)致胰島素抵抗,在胰島素抵抗的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[18]。EGFR能夠與胰島素受體形成嵌合體,從而激活胰島素抵抗相關(guān)的下游信號通路如PI3K/AKT信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信號通路,參與血糖的調(diào)節(jié)[19]。AGE與其主要的細胞受體RAGE結(jié)合后,可激活核因子κB、經(jīng)典MAPK、非受體酪氨酸激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子、轉(zhuǎn)化生長因子β等信號通路,調(diào)節(jié)各種轉(zhuǎn)錄因子和細胞因子的表達,參與炎癥、氧化應(yīng)激與β細胞損傷過程,進而影響糖尿病及其并發(fā)癥的進程[20]。HIF-1信號通路是影響代謝性疾病的關(guān)鍵信號通路,該通路信號傳導(dǎo)失調(diào)會導(dǎo)致胰島、視網(wǎng)膜、腎臟、脂肪和皮膚等組織對低氧的適應(yīng)性反應(yīng)出現(xiàn)障礙,進一步促進糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展[21]。此外,炎癥因子如TNF-α、白細胞介素6等可增強胰高血糖素、腎上腺皮質(zhì)激素等的升糖作用,并促進脂解過程,抑制IRS-1 的酪氨酸磷酸化,使IRS-1/PI3K/AKT信號通路受阻,GLUT4表達水平及活性降低,脂肪組織攝取葡萄糖障礙,機體氧化供能受損,導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生與發(fā)展[22]。綜上,黃芪-地黃的活性化學(xué)成分主要通過作用于AKT1、TNF、GAPDH、EGFR和SRC等核心靶點,調(diào)控PI3K/AKT信號通路、胰島素信號通路、胰島素抵抗糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路等,影響葡萄糖代謝、糖酵解、脂質(zhì)代謝和炎癥等相關(guān)病理生理過程,進而起到治療糖尿病的作用。

GAPDH為糖酵解過程中的關(guān)鍵酶,催化甘油醛-3-磷酸生成甘油酸酯1,3-二磷酸。2007年,Min等[23]首次報告了GAPDH激活磷酸酶的活性,發(fā)現(xiàn)其通過拮抗磷酸酰肌醇-3,4,5-三羥甲基氨基甲烷磷酸鹽和磷酸酰肌醇-4,5-二羥甲基氨基甲烷磷酸鹽,進而調(diào)節(jié)胰島素信號通路,且其與視網(wǎng)膜病變、血管內(nèi)皮組織損傷等糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)為糖尿病的防治提供了新的藥理靶點。有研究表明,GAPDH與糖尿病、年齡相關(guān)性神經(jīng)退行性疾病、腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切,其中60%的2型糖尿病患者的GAPDH發(fā)生可逆性抑制[24-25]。GAPDH的表達過程不存在剪接及同工酶翻譯,而是通過一系列翻譯后修飾機制參與正常細胞的相關(guān)活動和疾病的發(fā)生[24]。在高血糖狀態(tài)下,視網(wǎng)膜微血管細胞中GAPDH的共價修飾受到抑制,從而激活與糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病相關(guān)的多條通路,如AGE信號通路、蛋白激酶C信號通路、己糖胺信號通路和多元醇信號通路等,促進葡萄糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜毛細血管細胞凋亡[26]。美迪紫檀素及其衍生物潛在的藥理作用涉及抗腫瘤、抗炎、促骨骼生長、抗抑郁、促肌細胞增殖、保護神經(jīng)元等方面[27]。其中,3,9-di-O-美迪紫檀素可通過改善葡萄糖穩(wěn)態(tài)和胰島素敏感性,治療2型糖尿病腎病[10]。本研究分子對接結(jié)果顯示,與核心靶點配對的活性化學(xué)成分中,3,9-di-O-美迪紫檀素與GAPDH的結(jié)合能最高,提示其為GAPDH的最優(yōu)構(gòu)象。綜上,3,9-di-O-美迪紫檀素可能通過調(diào)節(jié)GAPDH翻譯后修飾,影響糖尿病的發(fā)生、發(fā)展進程,但相關(guān)機制仍有待進一步探究。

綜上所述,黃芪-地黃藥對治療糖尿病的機制具有多成分、多靶點和多通路的特點,其活性化學(xué)成分3,9-di-O-美迪紫檀素、異鼠李素、山柰酚、槲皮素、華良姜素、京尼平苷等可能通過作用于AKT1、TNF、GAPDH、EGFR和SRC等靶點,調(diào)控PI3K/AKT信號通路、胰島素信號通路、胰島素抵抗、AGE-RAGE信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路等,從而發(fā)揮治療糖尿病的作用。