丹皮酚對骨質(zhì)疏松骨折大鼠骨代謝的影響

李鴻儒，趙清輝*，王永輝，周靜，陳庭瑞

（駐馬店市中心醫(yī)院a:藥學(xué)部；b:創(chuàng)傷骨科，河南駐馬店 463000）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis,OP）好發(fā)于中老年人與絕經(jīng)后女性，易引發(fā)脆性骨折，致殘、死亡風(fēng)險較大［1］。有報道中老年人群OP 患病率20%，且以腎虛血瘀證常見［2］。有指南指出，OP 發(fā)病率較高，發(fā)生骨折的風(fēng)險大且80%左右為女性，特別是絕經(jīng)后女性，建議對高風(fēng)險女性加強篩查［3］?？梢娂訌姼唢L(fēng)險人群OP 篩查，防治OP 相關(guān)骨折具有重要的臨床、社會意義。目前治療OP 及其相關(guān)骨折的方法較多，藥物上有雌激素、鈣劑等，部分用藥效果不好或有嚴重不良反應(yīng)［4］。近年來中醫(yī)藥在OP 骨折治療中應(yīng)用較多，中醫(yī)上OP 屬于“骨痿”“骨痹”等范疇，其發(fā)病與腎、肝、脾虛損、外邪侵襲等有關(guān)，且呈現(xiàn)漸進緩慢特點［5］。丹皮酚為牡丹、徐長卿提取物，具有散瘀止痛、抗菌消炎功效，還能抗氧化、抑炎、改善微循環(huán)，且可對p38 MAPK 等相關(guān)通路影響以抑制滑膜細胞損傷、炎性反應(yīng)等［6］。有報道丹皮酚保護軟骨細胞的機制可能與Wnt/β-catenin 信號通路抑制，降低基質(zhì)金屬蛋白酶-9 （matrix metalloproteinases,MMP-9）等指標(biāo)有關(guān)［7］。楊黎等［8］報道稱丹皮酚可能通過抑制Toll 樣受體-4（toll-like receptor,TLR4）/核因子κB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）信號通路降低腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α,TNF-α）的產(chǎn)生。MMP-9 與破骨吸收密切相關(guān)，參與OP 發(fā)?。?］；NF-κB 被認為是破骨細胞活性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，能介導(dǎo)炎癥、免疫應(yīng)答等，于OP 中高表達［10］。本研究通過分析丹皮酚對OP 骨折大鼠骨代謝及NF-κB/MMP9 信號通路的影響，為OP 骨折防治提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

清潔級SD 雌性大鼠52 只，體重250～300 g，平均（280.0±15.0）g，由河南省實驗動物中心提供，許可證號為SYXK（豫）2017-0001，關(guān)于大鼠相關(guān)操作符合實驗動物倫理要求。隨機將其分為假手術(shù)組、模型組、骨化醇組與丹皮酚組，每組13 只。

1.2 模型建立

假手術(shù)組，僅打開腹腔，對卵巢附近脂肪組織切除。其他三組均腹腔打開，且將雙側(cè)卵巢切除，傷口縫合。常規(guī)飼養(yǎng)10 周后，通過雙能X 線骨密度儀對各大鼠骨密度值（bone mineral density,BMD）進行測定，若建模大鼠BMD 值比假手術(shù)組大鼠BMD 平均值小2.5 個標(biāo)準(zhǔn)差，則提示建模成功。

隨后將所有大鼠右側(cè)股骨橫向鋸斷，立即用克氏針固定骨折，傷口縫合。

1.3 藥物干預(yù)

于骨折固定術(shù)后次日對大鼠進行藥物干預(yù)，假手術(shù)組、模型組均給予用藥同體積生理鹽水灌胃，均1次/d，連續(xù)12 周。骨化醇組大鼠行阿法骨化醇（華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司）0.05 μg/kg 灌胃，丹皮酚組給予200 mg/kg 丹皮酚（陜西博林生物技術(shù)有限公司）灌胃，均1 次/d，連續(xù)12 周。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 BMD 測量

于給藥前和給藥12 周后，采用雙能X 線骨密度儀測定各組大鼠股骨BMD，模式為Hi-red small animal。

1.4.2 骨微CT 檢測

于給藥12 周處死動物后取各組大鼠股骨樣本，于股骨遠端干骺區(qū)域通過micro-CT 掃描儀測定各組大鼠骨小梁數(shù)量、厚度與分離度。分辨率18 mm、電流分別為385 μA。

1.4.3 血清檢測

給藥12 周后取血，采用酶聯(lián)免疫分析（enzymelinked immunosorbent assay,ELISA）測定各組大鼠血清Ⅰ型前膠原羧基端前肽（type I procollagen propeptide,PINP）、骨鈣素（bone gla protein,BGP）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP）水平。通過酶標(biāo)儀在450 nm 處對吸光度值進行測定，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本濃度。同時經(jīng)由ELISA 測定各組大鼠血清TNF-α、白細胞介素（Interleukin）-6、IL-8 水平。相關(guān)試劑盒購自漢云克隆科技股份有限公司與上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.4.4 qRT-PCR 檢測

TRIzol 法提取各組大鼠股骨骨髓組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成nDNA，PCR 擴增，嚴格按照相關(guān)說明書進行。NF-κB p65 上下游引物分別為5’-CATACGCTGACCCTAGCCTG-3’、5’-TTTCTTCAATCCGGTGGCGA-3’；MMP-9 上下游引物分別為5’-GCCGACTTATGTGGTCTTCC-3’、5’-GCTTCTCTCCCAT CATCTGG-3’，以GAPDH 為內(nèi)參，其上下游引物分別為5’-GAAGCTGGTCATCAACGGGA-3’、5’-G GCGGAGATGATGACCCTTT-3’。相關(guān)參數(shù)：50℃120 s，95℃10 min，95。經(jīng)由2-△△CT 法計算NFκB p65、MMP9 mRNA 相對表達量。

1.4.5 Western Blot 檢測

裂解液提前室溫解凍，適量骨髓組織放入研缽中，裂解液滴入后冰上靜置，上清液提取后通過BCA 蛋白試劑盒檢測蛋白濃度。制備好電泳裝置與聚丙烯酰胺凝膠，電泳操作：80 V 電泳150 min。300 mA 讓蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。TBST 緩沖液內(nèi)滴入脫脂牛奶制備封閉液，膜入封閉液，室內(nèi)常溫封閉120 min，之后分別加入磷酸化（p）-NF-κB p65、MMP9 一抗（體積比均為1∶1 000 稀釋），4℃孵育過夜。次日TBST 緩沖液洗膜4 次，5 min/次，加入1∶5 000 稀釋的二抗，室溫孵育1 h。洗膜后滴入ECL試劑，讓其顯色，凝膠成像系統(tǒng)成像分析。β-actin為內(nèi)參，Image J 軟件對相關(guān)蛋白顯影圖進行分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 BMD 與骨微CT 定量檢測

四組大鼠BMD 與骨微CT 定量檢測結(jié)果見表1。給藥12 周后BMD 由高至低依次為：假手術(shù)組＞丹皮酚組＞骨化醇組＞模型組，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05）。骨小梁數(shù)由高至低依次為：假手術(shù)組＞丹皮酚組＞骨化醇組＞模型組，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05），骨小梁厚度由高至低依次為：假手術(shù)組＞丹皮酚組＞骨化醇組＞模型組，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05）；而骨小梁分離由低至依次為：假手術(shù)組＜丹皮酚組＜骨化醇組＜模型組，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05）。

表1 四組大鼠BMD 與骨微CT 定量檢測比較（±s）Table 1 Comparison of bone mineral density and bone micro-CT measurements among the four groups(±s)

表1 四組大鼠BMD 與骨微CT 定量檢測比較（±s）Table 1 Comparison of bone mineral density and bone micro-CT measurements among the four groups(±s)

指標(biāo)BMD(g/cm2)骨小梁數(shù)(mm-1)骨小梁厚度(μm)骨小梁分離度(mm)假手術(shù)組（n=13）0.31±0.06 5.5±0.6 78.5±5.4 0.23±0.04模型組（n=13）0.19±0.04 3.0±0.4 46.9±3.8 0.37±0.07骨化醇組（n=13）0.25±0.05 4.5±0.5 70.8±5.0 0.26±0.05丹皮酚組（n=13）0.26±0.06 4.7±0.6 72.3±4.7 0.25±0.06 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 血清檢測

給藥12 周后血清檢測結(jié)果見表2。PINP 由高至低依次為：假手術(shù)組＞丹皮酚組＞骨化醇組＞模型組，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05）；血清BGP 由高至低依次為：假手術(shù)組＞丹皮酚組＞骨化醇組＞模型組，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05）；血清ALP 由高至低依次為：假手術(shù)組＞丹皮酚組＞骨化醇組＞模型組，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05）。而血清TNF-α、IL-6 和IL-8 由低至高依次均為：假手術(shù)組＜丹皮酚組＜骨化醇組＜模型組，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05）。

表2 四組大鼠血清指標(biāo)檢測比較（±s）Table 2 Comparison of serum markers among the four groups(±s)

表2 四組大鼠血清指標(biāo)檢測比較（±s）Table 2 Comparison of serum markers among the four groups(±s)

指標(biāo)PINP(μg/L)BGP(μg/L)ALP(U/L)TRAP(μg/L)TNF-α(pg/ml)IL-6(pg/ml)IL-8(pg/ml)假手術(shù)組（n=13）93.6±13.0 2.1±0.2 201.0±23.6 1.5±0.4 4.0±1.3 1.7±0.4 2.9±0.7模型組（n=13）26.5±6.2 0.9±0.2 112.4±12.7 2.8±0.6 20.4±4.6 3.5±0.8 12.3±2.4骨化醇組（n=13）80.7±10.5 1.6±0.3 175.2±15.4 2.0±0.5 8.6±2.3 2.2±0.6 5.0±1.3丹皮酚組（n=13）82.4±11.3 1.7±0.4 180.3±18.6 1.8±0.4 8.0±2.9 2.0±0.5 4.7±1.2 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.3 標(biāo)志物mRNA 和蛋白表達檢測

給藥12 周后骨標(biāo)志物mRAN 和蛋白檢測結(jié)果見表3。NF-κB p65 和MMP 的mRNA 表達均由低至高低依次為：手術(shù)組＜丹皮酚組＜骨化醇組＜模型組，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05）。p-NF-κB p65 和MMP9 蛋白表達由低至高依次為：假手術(shù)組＜丹皮酚組＜骨化醇組＜模型組，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05）。

表3 四組標(biāo)志物mRNA 和蛋白表達檢測（相對表達量，±s）Table 3 Comparison of mRNA and protein expressions of bone marrow markers among the four groups(RQ,±s)

表3 四組標(biāo)志物mRNA 和蛋白表達檢測（相對表達量，±s）Table 3 Comparison of mRNA and protein expressions of bone marrow markers among the four groups(RQ,±s)

指標(biāo)qRT-PCR NF-kB-p65 MMP9 Western Blot P-NF-kB-p65 MMP9假手術(shù)組（n=13）模型組（n=13）骨化醇組（n=13）丹皮酚組（n=13）P 值3.0±0.4 1.0±0.3 4.2±0.3 2.0±0.5 3.5±0.7 1.4±0.4 3.3±0.5 1.3±0.3＜0.001＜0.001 0.15±0.03 0.4±0.1 0.50±0.10 1.8±0.3 0.22±0.06 0.7±0.3 0.20±0.04 0.6±0.2＜0.001＜0.001

3 討論

據(jù)統(tǒng)計，我國＞50 歲居民OP 發(fā)生率19.2%，女性O(shè)P 比例32.1%，是男性的5 倍左右［11］。故選擇雌性大鼠進行本次實驗，通過切除卵巢構(gòu)建OP，且橫向鋸斷股骨以形成骨折，相比假手術(shù)組，模型組及其他組給藥前BMD 值均顯著降低，提示OP 骨折大鼠建模成功。相比模型組，骨化醇組、丹皮酚組給藥12 周后BMD 值均顯著高，且骨小梁數(shù)目明顯增多，骨小梁形態(tài)明顯改善。提示西藥（阿法骨化醇）與丹皮酚均能提高OP 骨折大鼠骨密度，恢復(fù)骨小梁異常形態(tài)，與張富財?shù)龋?2］報道基本相符。骨代謝指標(biāo)與OP 及其相關(guān)骨折密切相關(guān)［13］。其中PINP可直接反映I 型膠原合成速率［14］；ALP 參與成骨過程，通過對磷酸酯、焦磷酸鹽活性水解可促骨形成［15］；BGP 多源于成骨細胞，其水平高低關(guān)系到成骨細胞活性［16］；TRAP 則與破骨細胞有關(guān)，其水平高低反映破骨細胞活性［17］。本實驗骨化醇組、丹皮酚組給藥后血清PINP、BGP、ALP 水平比模型組均顯著增高，TRAP 水平顯著降低。提示阿法骨化醇與丹皮酚均能抑制破骨細胞活性，促進骨細胞形成。這可能與丹皮酚具有促進骨折愈合、抗骨關(guān)節(jié)炎等藥理作用有關(guān)。

OP 骨折屬于慢性炎癥疾病，IL、TNF-α 等炎性因子參與OP 骨折發(fā)生、進展［18］。MMP-9 被發(fā)現(xiàn)在OP 發(fā)病中發(fā)揮重要作用，其抑制MMP-9 基因及蛋白表達是促破骨細胞凋亡的可能機制［19］，并通過對軟骨組織（非礦化）降解，釋放血管內(nèi)皮生長因子直接活化破骨細胞。NF-κB 參與炎癥過程，通過對NF-κB 信號通路及其相關(guān)炎癥指標(biāo)抑制可促成骨細胞生長，在OP 防治中發(fā)揮作用［20］。有報道稱，NFκB 的結(jié)合位點在MMP-9 啟動子內(nèi)，MMP-9 表達受NF-κB 影響［21］。Sabry M 等［22］研究表明，MMP-9、NF-κB 高表達與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)生有關(guān)。Liu等［23］研究表明丹皮酚可通過抑制IL-1β 等誘導(dǎo)的軟骨細胞炎癥以控制骨關(guān)節(jié)炎病情。本實驗中，相比假手術(shù)組，模型組血清TNF-α、IL-6、IL-8 水平均顯著增高。提示血清炎癥指標(biāo)參與OP 骨折發(fā)病過程。且骨化醇組、丹皮酚組治療后血清TNF-α、IL-6、IL-8 水平均比模型組顯著降低。提示丹皮酚能有效抑制血清促炎因子，這可能與丹皮酚抗菌消炎、抗氧化、抑炎作用有關(guān)。另外，周曉慧等［24］研究表明丹皮酚通過對NF-κB/MMP-9 信號通路下調(diào)可逆轉(zhuǎn)心肌梗死后心室重構(gòu)。有研究表明，丹皮酚可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin、TLR4/MYD88/NF-κB 信號通路發(fā)揮軟骨細胞保護、減輕肝臟缺血再灌注損傷的作用［7，25］。本實驗中，丹皮酚組治療后股骨骨髓組織中NF-κB p65、MMP mRNA 表達與p-NF-κB p65、MMP9 蛋白水平比模型組均顯著降低。提示丹皮酚能有效調(diào)控OP 骨折大鼠NF-κB/MMP-9 信號通路，抑制炎癥以促進骨愈合。

綜上所述，丹皮酚可能通過下調(diào)NF-κB/MMP-9信號通路，抑制IL-6、IL-8 等炎性因子，以恢復(fù)破骨、成骨細胞平衡，達到治療OP 骨折的目的，可為臨床OP 骨折患者治療提供新參考。但由于骨形成相關(guān)信號通路比較多，丹皮酚是否也影響其他信號通路尚需進一步研究。