外泌體非編碼RNA調(diào)控骨折愈合機(jī)理的研究進(jìn)展△

蘇友祥，李志超，管華鵬，李念虎*

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東濟(jì)南 250014；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

骨折是由外力或累積應(yīng)變引起的骨結(jié)構(gòu)完全或部分?jǐn)嗔眩?］。骨折愈合由數(shù)千個(gè)基因進(jìn)行調(diào)控，并受到細(xì)胞因子、生長因子等分子的顯著影響［2］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化［3］，成骨細(xì)胞的分化、增殖和遷移［4］，破骨細(xì)胞的骨吸收及血管生成與骨折的愈合有著密切關(guān)系［5～7］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有5%～10%的患者會出現(xiàn)愈合困難［8，9］。因此，促進(jìn)骨折的快速修復(fù)和愈合在臨床中具有重要意義［10，11］。外泌體是直徑為40～100 nm 的囊泡狀體［12，13］，在組織穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞間通訊及組織和器官的再生修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用［14～17］。外泌體中含有的非編碼RNA （non- coding RNA,ncRNA）參與骨折的愈合過程，并對愈合過程中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，成骨細(xì)胞的分化、增殖和遷移，破骨細(xì)胞的骨吸收及血管生成等方面起調(diào)控作用。本文旨在綜述近年來外泌體ncRNA 在骨折愈合中的調(diào)控機(jī)理及外泌體ncRNA 在骨折愈合中的潛在應(yīng)用。

1 外泌體ncRNA 調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是骨修復(fù)中的最佳祖細(xì)胞來源，其分化能力較強(qiáng)，可分化為成骨細(xì)胞、造血細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等；近年來，許多研究者通過局部注射或血管介入BMSCs 的方法對骨折進(jìn)行治療并取得良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［18］。鄭光磊等［18］在兔的骨折不愈合模型中采用上述辦法，并通過監(jiān)測外周血中堿性磷酸酶、骨鈣素水平的變化，骨折端影像學(xué)表現(xiàn)及病理組織學(xué)改變來評價(jià)效果，結(jié)果顯示BMSCs 能夠提高骨骼代謝水平，加快骨痂生成，促進(jìn)BMSCs 的成骨分化，進(jìn)而促進(jìn)骨折愈合。

外泌體ncRNA 也可以有效調(diào)控BMSCs 的成骨分化，從而促進(jìn)骨折愈合。Huang 等［19］在BMSCs 和小鼠的成骨細(xì)胞中通過模擬物/抑制劑調(diào)節(jié)miR-19b 的表達(dá)，研究這些變化對成骨因子、骨細(xì)胞礦化和骨折愈合的影響。他們通過功能得失分析，鑒定出了miR-19b 與含WW 域E3 泛素蛋白連接酶1/SMAD 特異E3 泛素蛋白連接酶2（WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 1/SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 2,WWP1/SMURF2）的靶向關(guān)系，并發(fā)現(xiàn)miR-19b 通過靶向WWP1 和SMURF2 促進(jìn)人BMSCs 向成骨細(xì)胞分化。WWP1 或SMURF2 的過表達(dá)降解了BMSCs 中的靶蛋白KRUPPEL 樣因子5（Kruppel like factor 5,KLF5），抑制骨折愈合；KLF5 基因敲除通過調(diào)節(jié)Wnt/β-Catenin 信號通路延緩骨折愈合。此外，miR-19b 靶向WWP1 或SMURF2，通過KLF5/β-Catenin 信號通路可促進(jìn)骨折愈合。綜上，BMSCs 來源的外泌體miR-19b 通過Wnt/β-catenin 信號通路抑制WWP1 或SMURF2 的表達(dá)，上調(diào)KLF5的表達(dá)，從而促進(jìn)骨折愈合。Xiong 等［20］發(fā)現(xiàn)從M2巨噬細(xì)胞分離的外泌體（M2 macrophagy-derived exosome,M2D-Exos）能夠通過干擾BMSCs 的體外和體內(nèi)分化而加速骨折愈合，其主要機(jī)制為M2D-Exos 攜帶的miR-5106 抑制鹽誘導(dǎo)蛋白2 和3（salt inducible kinase 2 and 3,SIK2 和SIK3）的表達(dá)促進(jìn)BMSCs的成骨分化。

人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（human adipose mesenchymal stem cells,hASCs）由于其快速增殖和在人體內(nèi)廣泛分布的優(yōu)勢，是產(chǎn)生大量外泌體的理想間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell,MSC）類型。Chen 等［21］通過對hASC 進(jìn)行遺傳修飾，將miR-375 加載到hASC 衍生的外泌體中，miR-375 可以通過過度表達(dá)在hASC 衍生的外泌體中富集，其從親代細(xì)胞中釋放出來后轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中發(fā)揮相關(guān)作用。胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor,IGF）信號通路是介導(dǎo)骨骼生長的重要途徑，受IGF 結(jié)合蛋白1-6（IGF binding protein1- 6,IGFBP1-6）的調(diào)節(jié)，IGFBP1-6 可以局部激活或抑制IGF 的作用。Chen等［21］證明IGFBP3 是成骨分化的負(fù)調(diào)節(jié)因子，外泌體miR-375 可在遞送至hBMSCs 后抑制IGFBP3 的表達(dá)以發(fā)揮成骨作用。調(diào)控機(jī)制見圖1。

圖1 外泌體ncRNA 在骨折愈合中的調(diào)控機(jī)制。

2 外泌體ncRNA 調(diào)控成骨細(xì)胞分化、增殖和遷移

成骨細(xì)胞是主要的骨形成細(xì)胞，是骨重塑和愈合不可缺少的細(xì)胞，成骨細(xì)胞活性的適當(dāng)增強(qiáng)對于骨愈合起著良好的促進(jìn)作用［22］。WNT/β-catenin 信號通路在骨發(fā)育的各種生理過程及在骨損傷后的愈合和再生過程中有重要作用［23］。脂蛋白相關(guān)蛋白4（lipoprotein receptor related protein 4,LRP4）可通過Wnt 信號通路在骨的生理學(xué)中發(fā)揮作用［24］。Yu 等［25］通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，攜帶miR-136-5p 的BMSC 衍生的外泌體（BMSC-exosome,BMSC-Exo）能夠抑制LRP4并激活Wnt/β-catenin 通路，增強(qiáng)成骨細(xì)胞的增殖和分化，從而促進(jìn)骨折愈合。Hu 等［26］發(fā)現(xiàn)BMSC-Exo分泌的miR-335 進(jìn)入成骨細(xì)胞樣細(xì)胞上調(diào)miR-335的表達(dá)并抑制囊泡關(guān)聯(lián)膜蛋白關(guān)聯(lián)蛋白B（vesicle associated membrane protein associated protein B,VapB）的表達(dá)，VapB 的低表達(dá)促進(jìn)Wnt/β-catenin 通路的激活，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化、增殖，從而促進(jìn)骨折愈合。

SMAD 泛素化調(diào)節(jié)因子-1 （SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1,SMURF1）是E3 泛素連接酶，位于其下游泛素化靶點(diǎn)Smad1/5 和Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 2 （runt- related transcription factor 2,Runx2）［27］，是骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein type 2,BMP2）［28］誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子［29］，Runx 缺失會導(dǎo)致成骨細(xì)胞的缺失。Jiang 等［30］通過免疫沉淀和蛋白穩(wěn)定性分析，分別檢測Runx2 的泛素化和SMURF1 對Runx2 泛素化的影響，驗(yàn)證了SMURF1 通過促進(jìn)泛素化來降解Runx2；同時(shí)，他們還通過免疫熒光驗(yàn)證了miR-25在外泌體中的轉(zhuǎn)移，采用雙熒光素酶報(bào)告基因法預(yù)測并驗(yàn)證miR-25 與SMURF1 的靶向關(guān)系，使用X 射線成像評估BMSC-Exo 中miR-25 對小鼠骨折愈合的影響，發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞在接受BMSC-Exo 轉(zhuǎn)移的miR-25 后，降低了SMURF1 的表達(dá)，增加了Runx2，導(dǎo)致其分化加速，增殖率增加，遷移增加；證實(shí)BMSC-Exo 分泌的miR-25 可通過SMURF1/Runx2 軸加速成骨細(xì)胞的成骨分化、增殖和遷移，促進(jìn)小鼠骨折愈合。

外泌體ncRNA 不僅可以正向調(diào)控成骨細(xì)胞分化、增殖和遷移以促進(jìn)骨折愈合，相反地，破骨細(xì)胞來源的外泌體ncRNA 能負(fù)向抑制成骨細(xì)胞活性，減少骨形成。據(jù)報(bào)道，miR-214-3p 可以通過靶向Pten/PI3k/Akt 通路促進(jìn)破骨細(xì)胞分化；Li 等［31］通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞中miR-214-3p 的升高會抑制成骨細(xì)胞的活性，與miR-214-3p 過表達(dá)的破骨細(xì)胞共培養(yǎng)的成骨細(xì)胞中成骨細(xì)胞活性相關(guān)標(biāo)記基因的mRNA水平顯著下調(diào)；他們還通過自主研發(fā)的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)，提供的使用antagomiR-214-3p 評估破骨細(xì)胞靶向miR-214-3p 抑制的治療效果，發(fā)現(xiàn)antagomiR-214-3p 治療顯著促進(jìn)了去卵巢老齡小鼠的骨形成，而這種有益作用在破骨細(xì)胞靶向遞送機(jī)制中斷后被阻斷，由此證實(shí)抑制破骨細(xì)胞miR-214-3p 可促進(jìn)去卵巢老齡小鼠的骨形成，增加骨量。

3 外泌體ncRNA 調(diào)控破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收

骨形成的過程是骨骼中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活動相平衡的過程。破骨細(xì)胞是由來自單核細(xì)胞／巨噬細(xì)胞的前體細(xì)胞融合而成的骨吸收細(xì)胞，它與成骨細(xì)胞、造血細(xì)胞、免疫細(xì)胞，甚至是腫瘤細(xì)胞都有著密切的聯(lián)系，共同調(diào)控著骨微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)［32,33］。破骨細(xì)胞在骨折修復(fù)的炎癥期和骨痂重塑期都通過適當(dāng)?shù)墓俏諏钦鄣挠闲迯?fù)發(fā)揮著作用。在炎癥階段，破骨細(xì)胞前體細(xì)胞首先從血液循環(huán)中被招募，并通過核因子κB 受體活化因子配體（NF- κB ligand,RANKL）的刺激及分化因子的誘導(dǎo)分化、增殖融合，形成破骨細(xì)胞，發(fā)揮骨吸收的作用。Cui 等［34］研究發(fā)現(xiàn)，miR-124 的過表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)由內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cell,EPC）衍生的外泌體誘導(dǎo)的骨髓巨噬細(xì)胞（bone marrow macrophages,BMMs）的遷移和破骨分化，LncRNA-MALAT1 可直接與miR-124 結(jié)合，負(fù)向控制miR-124 活性，EPC 衍生的外泌體可以通過LncRNA-MALAT1 增強(qiáng)破骨細(xì)胞前體的招募和分化，促進(jìn)骨折的愈合修復(fù)。

4 外泌體ncRNA 調(diào)控血管生成

眾多研究表明，良好的血運(yùn)是骨折愈合的前提條件，血管的生成保證了骨折愈合所需要的營養(yǎng)供給和成骨前體細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的補(bǔ)充［5］；骨形成與血管形成在空間和時(shí)間上的緊密聯(lián)系被稱為“血管生成-成骨耦合”［35］。血管生成涉及包括內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移［36］、毛細(xì)血管的形成和MSCs 的穩(wěn)定等過程，還由一系列多種因子控制［37］，這些因子的平衡決定了血管的形成和穩(wěn)定性［38］。外泌體ncRNA 也可以調(diào)控骨折愈合時(shí)的血管生成。Liu等［39］采用體內(nèi)骨折模型和通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)等體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，低氧條件下的外泌體（hypoxic-exosome,Hypo-Exo）給藥與常氧下的Exos相比更能促進(jìn)血管生成、增殖和遷移。其主要機(jī)制為Hypo-Exo 攜帶的miR-126 通過抑制萌芽相關(guān)的含EVH1 結(jié)構(gòu)域蛋白1（sprouty-related EVH1 domaincontaining protein 1,SPRED1）的表達(dá)，激活Ras/Erk通路并轉(zhuǎn)移至內(nèi)皮細(xì)胞，產(chǎn)生顯著的促血管生成作用。

5 小結(jié)與展望

隨著現(xiàn)在基因組測序技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的研究表明，外泌體ncRNA 能夠調(diào)控骨折愈合過程中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，成骨細(xì)胞的分化、增殖和遷移，破骨細(xì)胞的骨吸收及血管生成等；外泌體ncRNA 通過相關(guān)通路調(diào)控靶基因的表達(dá)和mRNA 的穩(wěn)定，影響著骨代謝過程中關(guān)鍵基因表達(dá)，在骨折愈合過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用；隨著不同來源的外泌體攜帶的ncRNA 不斷被發(fā)現(xiàn)和研究［40］，已經(jīng)有一部分外泌體ncRNA 作為治療靶點(diǎn)在臨床實(shí)驗(yàn)中用于骨折愈合的治療并取得了良好的療效，但由于技術(shù)的局限性和生物安全性，外泌體ncRNA 的應(yīng)用和研究也不可避免地存在一些不足，主要有：（1）在外泌體ncRNA 調(diào)控骨折愈合的研究主要集中在miRNA 上，而對于lncRNA、circRNA 的研究少之又少，尤其是對于circRNA 的研究需要新的突破，這也是未來研究的熱點(diǎn)；（2）目前的研究缺乏骨痂重塑期外泌體ncRNA 對于破骨細(xì)胞調(diào)控的研究；（3）對于外泌體ncRNA 來源的研究主要局限在BMSCs，未來是否會有更多來源的外泌體ncRNA 調(diào)控骨折愈合值得深入探討；（4）促進(jìn)骨折愈合本質(zhì)上是一種激活細(xì)胞和組織生長的過程，應(yīng)對腫瘤產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)是未來面臨的一個(gè)難題?？傊饷隗wncRNA 的研究為骨折愈合的研究提供了新思路、新觀點(diǎn)，但將其轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用還存在著諸多挑戰(zhàn)。相信在不久的將來，隨著深入地研究和難題的解決，不同來源的外泌體ncRNA 將在骨折愈合機(jī)制的研究中取得更大的進(jìn)步，并對防治骨折愈合有更重大的意義。