SCF泛素連接酶的體外泛素化體系構(gòu)建與檢測

摘要 為研究蛋白質(zhì)的體外泛素化過程，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)異源表達和純化APPBP1/UBA3（ E1）、UBC12 （E2）、Cullin1-Rbx1 （E3）和Nedd8 （neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein8）蛋白，制備FITC-Cysteine 綠色熒光素標記的泛素Ub（Ubiquitin），構(gòu)建了SCF 泛素連接酶的體外泛素化體系，同時實現(xiàn)快速檢測SCF 泛素連接酶中Cullin1 蛋白的自泛素化修飾。結(jié)果表明，建立的體外SCF E3 自泛素化活性反應(yīng)體系具有較高的可操作性和便利性。

關(guān)鍵詞 SCF 泛素連接酶； 泛素化修飾； Cullin1 蛋白； 熒光標記

中圖分類號 Q814 文獻標識碼 A 文章編號 1000-2421（2024）02-0273-07

SCF 復(fù)合物（multisubunit SKP1/Cullin1/Fbox，SCF）是一種被廣泛研究的多亞基E3 泛素連接酶，該復(fù)合物是最大的一個泛素化連接酶蛋白家族，由SKP1、Cullin1 和F-box 蛋白組成，這些蛋白質(zhì)相互連接并執(zhí)行不同的功能。人類、秀麗隱桿線蟲和植物中分別有約70、300 和1 000 種SCF 泛素連接酶［1］。SCF 泛素連接酶在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和生理機制等方面起著關(guān)鍵的作用，目前已有較多文獻報道了它參與植物次生代謝、植物脅迫、植物激素信號傳導(dǎo)和植物光形態(tài)建成等過程［2-5］。當植物面臨病原體的威脅時，利用SCF 泛素連接酶復(fù)合物降解其自身防御反應(yīng)的負調(diào)節(jié)蛋白或者病原體的蛋白質(zhì)，從而抑制病原體入侵［6-7］。SCF E3 連接酶在幾種關(guān)鍵植物激素的感知和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用，包括生長素、茉莉酸、三萜內(nèi)酯、赤霉素和乙烯。例如，在水稻的獨腳金內(nèi)酯（strigolactone， SL）信號通路中，穩(wěn)定的抑制顯性矮桿突變體蛋白DWARF53（D53）及其同系物在缺少SLs 的情況下可以募集植物輔抑制因子TPL/TPR 蛋白并抑制下游反應(yīng)，在SL 存在的情況下，獨角金內(nèi)酯受體DWARF14（D14）蛋白感知SLs 信號，觸發(fā)SCF 泛素連接酶介導(dǎo)D53 蛋白泛素化，隨后被蛋白酶體系統(tǒng)降解，解除對下游反應(yīng)的抑制［8-10］。

蛋白質(zhì)合成和降解之間的平衡對細胞生存和發(fā)育至關(guān)重要［11-12］。蛋白質(zhì)降解有2 種主要途徑：自噬和泛素蛋白酶體系統(tǒng)（autophagy and ubiquitin-proteasomesystem）［13］。自噬功能以溶酶體依賴的方式降解細胞中過量或異常的蛋白質(zhì)，而泛素蛋白酶體系統(tǒng)以蛋白酶體依賴的方式特異性泛素化并降解錯誤折疊和受損的蛋白質(zhì)。泛素蛋白酶體系統(tǒng)在真核生物中高度保守，對許多生物過程有重要作用。ATP依賴的泛素偶聯(lián)途徑包括泛素激活酶（ubiquitin activatingenzyme， E1）、泛素偶聯(lián)酶（ubiquitin conjugatingenzyme， E2）和泛素蛋白連接酶（ubiquitin ligase，E3），然后通過26S 對蛋白進行降解［14-16］。在所有真核生物中，SCF 泛素連接酶具有相似的模塊化結(jié)構(gòu)，Cullin 蛋白（植物中的Cullin1、Cullin3 和Cullin4）具有一個細長支架結(jié)構(gòu)，在其一端與催化亞基RBX1 相互作用，在另一端與底物受體亞基相互作用［17-19］。SCF E3 復(fù)合物的關(guān)鍵特征是Cullin 蛋白C 末端一個保守的賴氨酸被Nedd8（neural precursor cell expresseddevelopmentally down-regulated protein 8）共價修飾。SCF 復(fù)合物的形成和激活是一個受調(diào)控的過程，首先SCF 復(fù)合物中的Cullin 蛋白被Ned‐dylation 修飾，被修飾后SCF E3 復(fù)合物才能被激活［20-21］。與泛素化過程一樣，Neddylation8 修飾與Cullin 蛋白的結(jié)合是通過E1（APPBP1/UBA3）、E2（UBC12）和E3（Cullin-Rbx）多酶級聯(lián)來實現(xiàn)的［22］。遺傳學研究表明，Neddylation8 修飾對體內(nèi)SCF E3復(fù)合物的活性有重要影響［22-24］。

建立體外泛素化修飾檢測系統(tǒng)對于研究E3 泛素連接酶在生長發(fā)育中的分子機制十分重要。然而，由于多亞基SCF E3 泛素連接酶的組成比較復(fù)雜，獲得具有活性的E3 復(fù)合體組分存在較大困難，迄今為止，多亞基SCF E3 泛素連接酶的體外活性檢測體系尚不成熟。本研究構(gòu)建SCF 泛素連接酶的體外泛素化體系，實現(xiàn)快速檢測SCF 泛素連接酶中Cullin1 蛋白的自泛素化修飾，旨在為研究E3 連接酶的機制提供基礎(chǔ)平臺。