中藥材農(nóng)藥殘留檢測技術現(xiàn)狀與前景

摘 要： 中藥材種植已成為發(fā)展特色農(nóng)業(yè)的重要產(chǎn)業(yè)，但農(nóng)藥濫用導致的農(nóng)藥殘留問題已成為影響中藥材質(zhì)量的重要因素之一。如何高效、快速地檢測中藥材中的農(nóng)藥殘留是一個亟待解決的問題。系統(tǒng)地闡述了現(xiàn)行的農(nóng)藥殘留檢測方法，如色譜檢測法、酶抑制率法、酶聯(lián)免疫分析法、側(cè)向免疫層析法及新型免疫傳感器檢測方法等，并探討了農(nóng)藥殘留檢測方法的發(fā)展前景。

關鍵詞：中藥材；農(nóng)藥殘留；檢測技術；特色農(nóng)業(yè)；色譜檢測

中圖分類號：S379 文獻標識碼：A 文章編號：2095-1795（2024）05-0108-08

DOI：10.19998/j.cnki.2095-1795.2024.05.019

0 引言

中藥材在種植和生長過程中，常需要施用農(nóng)藥來預防和治理各類病蟲害，以提高中藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量[1]。然而，農(nóng)藥的過量或不規(guī)范施用都可能導致中藥材中出現(xiàn)嚴重的農(nóng)藥殘留問題，這不僅會影響中藥材的質(zhì)量和藥效，還可能對人體健康產(chǎn)生危害[2]。農(nóng)藥殘留問題已經(jīng)成為影響中藥材行業(yè)發(fā)展的瓶頸，同樣也阻礙著中藥材的出口貿(mào)易。對中藥材中的農(nóng)藥殘留問題進行研究，不僅有助于保證中藥材的質(zhì)量和安全性，也有助于促進可持續(xù)和綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展[1-3]?？焖?、靈敏、精準地檢測中藥材中農(nóng)藥殘留，對于保證中藥材的質(zhì)量安全，促進中藥產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，以及推動中藥材的國際貿(mào)易都具有重要意義。目前，對于農(nóng)藥殘留檢測已經(jīng)開發(fā)了多種方法，包括氣相色譜法、液相色譜法及質(zhì)譜法等，這些方法在農(nóng)藥殘留檢測中具有靈敏度高、準確性好等優(yōu)點[4]。然而，目前的研究還存在一些不足之處。如農(nóng)藥殘留檢測方法檢測時間較長、檢測成本較高，因此需要探索更加快速、簡便、經(jīng)濟的檢測方法，提高檢測效率和降低檢測成本，以滿足實際生產(chǎn)和監(jiān)管的需求[3，5]。對于中藥材中農(nóng)藥殘留的限量標準還存在一定的爭議和不足，需加強研究和制定更加科學、合理的農(nóng)藥殘留限量標準，以保障中藥材的質(zhì)量和安全性[6]。隨著農(nóng)業(yè)技術的不斷發(fā)展，新型農(nóng)藥不斷涌現(xiàn)，這些新型農(nóng)藥可能在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上與傳統(tǒng)農(nóng)藥存在較大差異，更需要研究和開發(fā)新的檢測方法，以實現(xiàn)對新型農(nóng)藥的有效識別和檢測[7]。本研究總結(jié)了中藥材農(nóng)藥殘留檢測技術現(xiàn)狀，包括傳統(tǒng)的質(zhì)譜檢測方法和新興的檢測方法，如酶抑制率法、酶聯(lián)免疫吸附檢測法、免疫層析檢測法和生物免疫傳感器等，檢測方法如圖1 所示[8-9]。分析檢測方法的特點及發(fā)展前景，特別是目前應用廣泛的新型納米免疫檢測技術，以期提高中藥材農(nóng)藥殘留檢測方法的準確性和靈敏度，降低檢測成本、提高檢測效率，進一步推動中藥材農(nóng)藥殘留檢測技術的發(fā)展和應用，為保障中藥材的質(zhì)量和安全性提供更加有力的技術支持。

1 種植現(xiàn)狀

中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)是中醫(yī)藥事業(yè)的物質(zhì)基礎，大力發(fā)展和推進中藥產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)代化已列入國家中長期發(fā)展規(guī)劃[10-11]。隨著近年來一系列推動中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的相關政策出臺，我國種植中藥材的農(nóng)戶越來越多，種植面積越來越廣，主要分布在湖南省、貴州省、甘肅省、陜西省、遼寧省和廣東省，進行大規(guī)模的人工種植中藥材[12-14]。2017—2020 年，我國中藥材種植總面積由231.13 萬hm2 增長至290.53 萬hm2 [15]。到2025 年，中藥材種植總面積將突破300 萬hm2，將持續(xù)為中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展起到推動及支撐作用[16-17]。種植面積快速增長，中藥材種植已成為部分地區(qū)特別是丘陵山區(qū)調(diào)整種植業(yè)結(jié)構(gòu)、農(nóng)民增收致富的重要產(chǎn)業(yè)[18]。

中藥材種植在大規(guī)模發(fā)展的同時，也存在農(nóng)藥施用不規(guī)范問題，影響中藥材質(zhì)量[19-21]。中藥材農(nóng)藥殘留指的是在使用農(nóng)藥之后殘留在中藥材表面、內(nèi)部或者土壤、水分、空氣等環(huán)境中的微量農(nóng)藥，不僅包括農(nóng)藥本身，也包括農(nóng)藥的代謝物、次生代謝物和轉(zhuǎn)化物等[22-25]。中國藥典委員會頒布了2020 版《中國藥典》，在四部通則《0212 藥材和飲片檢定通則》中，明確規(guī)定藥材及飲片（植物類） 33 種禁用農(nóng)藥品種限定用量；GB 2763—2021 中規(guī)范了161 項中藥用植物殘留限量標準[26-27]。一些國家或地區(qū)組織也出臺了相關的法律文件，如《日本藥典》《歐洲藥典》、美國的USP–NF 2021 等都對農(nóng)藥殘留做出了限量規(guī)定[15，28]。據(jù)統(tǒng)計，2022 年，我國中藥出口額56.9 億美元，向114 個國家和地區(qū)出口中藥材25.1 萬t；2020 年上半年，我國出口的中藥材因農(nóng)藥殘留等原因被退回31 批次[29]。中藥材的農(nóng)藥殘留不僅會對中藥材產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成阻礙，影響藥材本身的藥效價值，更會造成環(huán)境污染，破環(huán)水土資源的再生利用，傷害人類及其他動物的身體。因此，對于中藥材農(nóng)藥殘留的分析檢測是必不可少的，亟待研究出更加快速、簡便的農(nóng)藥殘留檢測技術和方法。

2 檢測手段

2.1 色譜檢測法

目前對于中藥材中農(nóng)藥殘留檢測方法仍以色譜技術為主，其中液相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLC-MS/MS）是色譜方法中較為常見的一種。我國對于植物源性食品中208 種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的氣相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用測定方法制定了國家安全標準。廖仕成等[30] 建立一種超高效液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜法用以測定中藥材及植物性食品樣品中 23 種有毒生物堿，各類樣品檢出限0.01～0.40 μg/kg，這種高效檢測方法的建立，為中藥材中生物堿的篩查提供了快速檢測手段。李文廷等[31]利用濁點萃取?氣相色譜質(zhì)譜法檢測中藥材中的有機磷農(nóng)藥殘留，檢出限（2.8～8.1）×10?6 ng/ L，實現(xiàn)了對中藥材中農(nóng)藥殘留的痕量檢測。質(zhì)譜檢測法是農(nóng)藥檢測方法中的“金標準”，能夠?qū)崿F(xiàn)農(nóng)藥殘留的定量定性檢測，檢測靈敏度較高，能夠進行高通量檢測，通常情況下能對低劑量的農(nóng)藥殘留實現(xiàn)痕量檢測。但質(zhì)譜檢測法需要借助大型儀器且配備專門的檢測人員才能實現(xiàn)，尚不能滿足對農(nóng)藥殘留的實時現(xiàn)場檢測。

2.2 酶抑制率法

酶抑制率法主要是用于有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測，該類農(nóng)藥能抑制乙酰膽堿酯酶的活性后不能使反應底物被催化水解發(fā)生顯色變化或者使得顏色變化很小，再利用分光光度計在412 nm 處測定吸光值（ΔA0），根據(jù)結(jié)果計算出抑制率，抑制率=（ΔA0?ΔAt）/ΔA0×100%，再結(jié)合配套的農(nóng)藥殘留測速儀就可以初步判讀中藥材中含有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的情況[32-35]。湯彤[36] 利用酶抑制率法檢測300 份樣品中的農(nóng)藥殘留量，其中符合率達到了84.6%，基本符合國家標準的要求。由于酶抑制率法操作簡便，在中藥材農(nóng)藥殘留檢測中應用較廣，市場上有較多的基于酶抑制率法原理開發(fā)的農(nóng)藥殘留檢測試劑盒[37]。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附反應

酶聯(lián)免疫吸附反應屬于免疫學早期發(fā)展的典型范疇，免疫學的發(fā)展史起始于早期的微生物學研究，在20 世紀中期逐步進入現(xiàn)代免疫時期，免疫檢測技術也在免疫學的發(fā)展過程中逐步完善[38]。免疫檢測技術是指利用抗原?抗體的特異性結(jié)合并反饋相關信號定性或者定量檢測靶標物質(zhì)，廣泛用于農(nóng)藥成分、生物大分子、細菌、病毒及其他小分子的特異靈敏技術。閆旭[39]建立了硫磷、吡蟲啉的ic-ELISA 免疫學檢測方法，硫磷最低檢測限0.005 mg/L、吡蟲啉最低檢測限0.004 5 mg/L，與高效液相色譜（high performance liquidchromatography，HPLC）檢測方法結(jié)果較一致，其檢測性能滿足農(nóng)藥殘留分析的要求。免疫檢測在農(nóng)藥殘留的監(jiān)控中占據(jù)著非常重要的地位。酶免疫分析（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）于20 世紀60 年代引入，與早期利用放射性同位素標記抗原或抗體的原理相似，具有顯著的優(yōu)勢，包括用酶替代放射性同位素、反應時間更快、特異性更高及半衰期更長[40]。酶免疫分析主要通過抗原抗體反應后通過酶與底物結(jié)合產(chǎn)生顏色反應，而后以呈色的深淺對待測物進行定量分析[41]。同時根據(jù)結(jié)合方式的不同，酶免疫分析主要以夾心法、間接法和競爭法為主[39]。宋洋[42]建立了一種直接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法，靈敏度高，與高效液相色譜檢測方法結(jié)果具有高度相關性，線性相關系數(shù)R2 =0.984 9，并且該檢測方法可用于現(xiàn)場對亞胺硫磷進行檢測。劉娟[43] 建立了間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定（Bic-ELISA）方法用以檢測噻蟲嗪，檢測的線性范圍1.0～ 250.0 ng/mL， IC50 =28.6 ng/mL， 檢出限0.15 ng/mL，實現(xiàn)了對噻蟲嗪的定性定量檢測。

2.4 側(cè)向免疫層析檢測

側(cè)向免疫層析（lateral flow immunoassays，LFIA）檢測技術是利用不同物質(zhì)理化性質(zhì)的差異而建立起來的技術，即是在層析技術的基礎上通過抗原?抗體反應及側(cè)向虹吸作用而發(fā)展起來的一種經(jīng)典的即時檢測（point of care test，POCT）技術，主要用于混合物中各組分的分離[44]。層析系統(tǒng)主要由固定相和流動相兩部分組成。當待分離的混合物隨流動相通過固定相時，由于各組份的理化性質(zhì)存在差異，與兩相發(fā)生吸附、溶解、結(jié)合等相互作用的能力不同[45]。其中與固定相相互作用力越弱的組分，隨流動相向前移動的速度越快。反之，向前移動速度越慢。因此，通過收集各組分的流出液即可得到樣品中所含的各單一組分，從而達到分離的目的[46]。由于其具有檢測成本低、操作簡單、快速和靈敏等特點，目前，已應用于獸醫(yī)診斷、食品監(jiān)測、農(nóng)藥殘留檢測和環(huán)境衛(wèi)生等多個領域[47]。

側(cè)向免疫層析試紙條的標記信號物可以分為可視化信號物、熒光標記物及其他標記物3 種。可視化信號物主要有膠體金、乳膠和磁性顆粒；熒光標記物主要有時間分辨熒光微球、熒光蛋白、上轉(zhuǎn)化材料及量子點；其他標記物主要有拉曼信號和磁納米信號等 ，如圖2 所示[48]。王菡等[49] 制備膠體金側(cè)向流免疫層析試紙條用以檢測有機磷農(nóng)藥殘留，在5 min 內(nèi)可對毒死蜱進行檢測，其檢測限 4 μg/mL，并且不存在較大的基質(zhì)干擾。李耀磊等[50] 研發(fā)的膠體金免疫層析技術可對中藥材中黃曲霉毒素 B1 進行定量檢測，選擇檢測馬錢子、胖大海、大棗、遠志、蓮子、薏苡仁和桃仁等常規(guī)中藥材，結(jié)果表明，膠體金免疫層析檢測技術符合率 83.7%，可用于部分中藥材中黃曲霉毒素 B1 的定量檢測。梁才英[51] 建立的膠體金免疫層析技術用于檢測市場上多數(shù)樣本中的超濃度農(nóng)藥克百威。相比可見信號物膠體金，熒光標記物應用在側(cè)向免疫層析試紙條可以提高檢測分析靈敏度。孫新琪等[25] 利用綠色熒光微球作為標記物開發(fā)了熒光免疫分析方法，首次對中藥材金銀花中的氟蟲腈進行定量檢測，性能穩(wěn)定，檢測靈敏度遠高于（3.5 倍） 氟蟲腈的酶聯(lián)免疫法（ELISA），可用于實際樣品的現(xiàn)場快速檢測。LIU Y等[52] 利用不同的熒光示蹤劑（THBu-AMF 和THBu-EDF）構(gòu)建了三唑磷的熒光偏振免疫測定（FPIA）檢測方法，能夠快速、同質(zhì)和高通量的對三唑磷進行檢測，檢測限0.29 μg/L，半數(shù)最大抑制濃度（IC50）3.62 μg/L，與氣相色譜法結(jié)果比較相關性高（R2 ≥0.968 0） ，適用于中藥材中三唑磷殘留的快速篩查。殷慧等[53] 利用反Stokes 位移大、發(fā)射帶較窄、光化學穩(wěn)定性高且細胞毒性低的稀土摻雜上轉(zhuǎn)換納米材料（REEs-UCNPs）等構(gòu)建上轉(zhuǎn)換熒光免疫層析試紙條，對有機磷農(nóng)藥檢測限0.38 ng /mL，回收率gt;95.4%，無自發(fā)熒光干擾，能夠排除其他種類的農(nóng)藥和樣品基質(zhì)的干擾。側(cè)向免疫層析檢測技術對于農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場檢測有著非常重要的作用，能夠推動中藥材農(nóng)藥殘留實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)基地的現(xiàn)場檢測，提高中草藥作為藥材使用的標準，在源頭減少農(nóng)藥殘留帶來的危害，利于整個中藥材產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

2.5 新型免疫傳感器檢測

隨著近些年有關中藥材中農(nóng)藥殘留檢測法規(guī)要求越來越嚴格，這也對中藥材農(nóng)藥殘留的快速檢測提出了新的挑戰(zhàn)。傳感器是將能夠感受到待測物的信息按照一定規(guī)律轉(zhuǎn)變成為光信號、電信號、電化學信號、磁信號或者其他形式的信號進行信息輸出的裝置[54-55]。免疫傳感器則是基于抗原與抗體的特異性結(jié)合，將待測的目標物作為“抗原”或“抗體”，再把抗原或抗體反應體系的信息通過特定的信號輸出。中藥材中的待檢農(nóng)藥成分大部分是小分子化合物，在免疫傳感檢測中也大多作為“抗原”進行定量或者定性檢測[56]。側(cè)向免疫層析檢測方法是免疫傳感器最典型的一類，不需要借助昂貴的儀器設備，特別是在中藥材生產(chǎn)基地可以做到現(xiàn)場快速的即時檢測[53， 56-57]。近年來，許多新型材料的一種或幾種聯(lián)合應用在免疫傳感器中，如納米復合材料、被修飾的磁珠、點陣列基底、生物芯片、適配體和納米生物酶等，讓檢測的靈敏度和準確度進一步得到較大提升[53， 57-58]。在此基礎上，將各類農(nóng)藥靶標分子與多種新型的免疫傳感器結(jié)合構(gòu)建高靈敏、更快速的便攜檢測技術，對中藥材的農(nóng)藥殘留實現(xiàn)痕量級檢測標準[59-60]。

PAN Y 等[61] 首次嘗試使用比色/熒光生物免疫傳感器檢測三氯殺螨醇（DICO）。首先合成具有較強熒光特性的谷胱甘肽覆蓋的金?銀雙金屬納米簇，再利用聚乙烯亞胺修飾金納米粒子（PEI-Au NPs）以獲得強烈比色信號。Au-Ag NCs 和抗體通過靜電作用吸附在AuNPs 表面，形成既有強烈比色信號又有高熒光信號的雙模式免疫探針，并且將Au-Ag NCs 和PEI-Au NPs的雙模式比色/熒光免疫探針應用于ic-ELISA 和LFIA 上。在ic-ELISA 方法中，熒光信號的引入顯著提高了檢測的靈敏度，DICO 的檢出限0.62 ng/mL，在1.36～19.92 ng/mL 范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的線性關系。在LFIA 方法中，檢出限1.59 ng/mL，可通過檢測線直接讀取結(jié)果，這種新型的免疫檢測探針可以極大地提高檢測靈敏度。ZHAO Y 等[62] 將具有特殊四聚體結(jié)構(gòu)的丁酰膽堿酯酶（BChE）和PtPd 納米顆粒具有高靈敏的特性應用在免疫層析檢測中，通過智能手機的環(huán)境光傳感器對基于酶反應產(chǎn)生的比色信號進行傳導，間接獲得有機磷（OP）殺蟲劑的濃度。CHEN G 等[63] 將抗體和相應的生物編碼（ssDNAs）標記AuNP，然后利用Au@Pt 的催化能力定量檢測有機磷農(nóng)藥殘留。所開發(fā)的免疫檢測方法的回收率71.26%～117.47%，對硫磷、三唑磷的檢出限分別為9.88 和3.91 ng/kg。這些新型的免疫層析檢測技術在即時檢測中表現(xiàn)出巨大潛力。GUO Y 等[64] 利用固定化傳感器芯片和實時的表面等離子體共振（SPR）制備非競爭性的免疫新型傳感器用于直接對三唑磷進行痕量檢測，最低檢出限0.096 ng /mL，線性檢測范圍0.98～8.29 ng/mL，滿足其最大殘留量的檢測要求，可作為一種快速可靠的工具來定期監(jiān)測三唑磷。

3 討論與展望

近年來，中藥材種植規(guī)模逐年擴大，對其質(zhì)量提出了更高的要求。中藥材的農(nóng)藥殘留標準越來越嚴格，相應的農(nóng)藥殘留檢測技術也有了非常重要的發(fā)展。與傳統(tǒng)的質(zhì)譜檢測方法相比，農(nóng)藥殘留快速檢測具有明顯的便攜優(yōu)勢。特別是一些新型傳感器的興起，使農(nóng)藥殘留的快速檢測達到更靈敏、更準確和更穩(wěn)定。盡管農(nóng)藥殘留檢測技術取得了重大進展，但仍有許多問題亟待解決。液相色譜?質(zhì)譜法出現(xiàn)較早，是農(nóng)藥殘留檢測的常規(guī)方法，與之相對的是依靠分光光度計的分光光度法、酶抑制法等方法。這類檢測方法的準確度和靈敏度高，能檢測出痕量的農(nóng)藥分子，但檢測需要大型儀器、價格昂貴，需要專業(yè)人員操作，不適合農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場檢測。隨著納米技術的發(fā)展，許多新型納米標記物與免疫分析技術相結(jié)合，構(gòu)建了多種新型免疫傳感器，如比色免疫傳感器、熒光免疫傳感器、化學發(fā)光免疫傳感器、電化學發(fā)光免疫傳感器及電化學發(fā)光免疫傳感器等，如表1 所示。上述免疫傳感器在農(nóng)藥檢測和分析方面前景廣闊，但在當前形勢下仍面臨許多挑戰(zhàn)。許多特殊納米材料，特別是改性磁性納米顆粒、熒光顆粒和拉曼探針等，由于使用環(huán)境要求高，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性差，并且受本底干擾，使用受到限制。

為了提高農(nóng)藥殘留檢測水平，從5 個方面進行改進。①為了穩(wěn)定農(nóng)藥殘留檢測技術的發(fā)展，開發(fā)新可見納米材料作為指示劑，減少復雜儀器使用，直接通過肉眼觀察結(jié)果。②研究納米粒子修飾技術，通過適當?shù)幕瘜W手段對納米粒子進行修飾，提高納米粒子探針的穩(wěn)定性，以此來提高檢測傳感器的適用性。③改善免疫傳感器中各組分的生物相容性，提高檢測的準確性和穩(wěn)定性。④結(jié)合多種檢測方法，實現(xiàn)農(nóng)藥殘留的多重檢測。⑤擴大傳感檢測小型設備的研究，通過智能手機等便攜式手持設備識別傳感信號，有效降低檢測成本，廣泛應用于農(nóng)藥殘留的田間檢測。在未來，將快速檢測技術商品化，并與其他的傳感技術相結(jié)合，實現(xiàn)快速便攜的現(xiàn)場快速檢測，不單是應用在中藥材，還可以應用在各類農(nóng)產(chǎn)品、環(huán)境衛(wèi)生等檢測。