枯草芽孢桿菌4種環(huán)脂肽抗豬δ冠狀病毒的研究

摘要：為探究從枯草芽孢桿菌Bs 916中提取的表面活性素、羅克霉素、泛革素及桿菌霉素L 4種抗菌肽對豬δ冠狀病毒（PDCoV）的抗病毒作用。首先采用CCK-8法確定抗菌肽對細胞無毒性的最佳濃度范圍，隨后分別采用RT-qPCR、Western blot及IFA 3種方法檢測Bs 916中4種環(huán)脂肽對PDCoV的抗病毒效果。結(jié)果顯示，4種環(huán)脂肽在濃 度≤50 μg/mL時對細胞無毒性，同時具有良好的抗病毒效果。相同條件下，羅克霉素抗病毒效果最佳，其次為表面活性素。本研究從枯草芽孢桿菌Bs 916中提取的表面活性素、羅克霉素、泛革素及桿菌霉素L可抑制PDCoV在細胞中的增殖，具有良好的抗病毒作用，其中以羅克霉素和表面活性素的抗病毒效果最佳，可為抗PDCoV藥物研發(fā)提供理論支持。

關(guān)鍵詞：表面活性素；羅克霉素；泛革素；桿菌霉素L；豬δ冠狀病毒

中圖分類號：S852.65+1 "文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）04-0182-05

收稿日期：2023-05-17

基金項目：江蘇省重點研發(fā)計劃（編號：BE2021324）；江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新資金（編號：［CX（21）3127］）。

作者簡介：朱 桃（1994—），女，河南商丘人，碩士研究生，主要從事非洲豬瘟疫苗研究。E-mail：1694490993@qq.com。

通信作者：李 彬，博士，研究員，主要從事動物腹瀉病防控技術(shù)等研究，E-mail：libinana@126.com；羅楚平，博士，教授，主要從事微生物代謝產(chǎn)物研究，E-mail：luochuping@163.com。

豬δ冠狀病毒（porcine deltacoronavirus，PDCoV）屬于冠狀病毒科，冠狀病毒屬，是一種新型豬腸道致病冠狀病毒，主要導(dǎo)致新生仔豬急性腹瀉、嘔吐和脫水［1-4］。PDCoV是一種包膜病毒，基因組全長約25.4 kb，編碼15個成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白（nsp 2-16）、4個結(jié)構(gòu)蛋白（棘突蛋白S、包膜蛋白E、膜蛋白M、核衣殼蛋白N）和3種輔助蛋白（NS6、NS7、NS7a）［5-6］。在這些蛋白中，N蛋白是表達量最為豐富的多功能結(jié)構(gòu)蛋白，其基因全長1 029 bp，共編碼343個氨基酸。N蛋白發(fā)生在病毒感染早期，是最早產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗原蛋白，最先刺激機體產(chǎn)生抗體，此外，它在結(jié)構(gòu)和功能上具有保守性強和種屬特異性［7-8］，因此，PDCoV-N蛋白常被用于分子生物學(xué)診斷技術(shù)。PDCoV是一種新發(fā)現(xiàn)的豬腹瀉病毒，其傳播速度快，從最初2012年發(fā)現(xiàn)于香港［1］后，于2014年即于美國暴發(fā)［9］，隨后蔓延至全球［10］。PDCoV不僅對養(yǎng)豬業(yè)造成極大影響，還會跨物種感染牛、雞甚至是人［11-14］，危害公共健康。因此，建立快速有效的預(yù)防措施，找到抑制病毒的特效藥物至關(guān)重要。

脂肽（lipopeptide）是一類由脂肪酸和多肽分子組成的生物分子，具有一系列獨特的物理和生物學(xué)性質(zhì)。其廣泛存在于自然界中，包括細菌、真菌、植物和動物等生物體內(nèi)。目前，已發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌能夠產(chǎn)生多種類型的環(huán)脂肽，根據(jù)環(huán)肽的結(jié)構(gòu)可分為三大家族：表面活性素、泛革素和伊枯草素。大量研究表明，芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽，具有多種生物活性，其中包括抗真菌、抗細菌、抗炎癥、抗病毒及抗腫瘤等生物活性［14-18］，但關(guān)于它們抗病毒、抗腫瘤生物活性鮮有報道。芽孢桿菌的脂肽，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、生物醫(yī)藥、環(huán)保、食品工業(yè)等領(lǐng)域［15-19］。然而，關(guān)于芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌肽在抗病毒方面的研究，大部分傾向于表面活性素抗病毒方向，而對泛革素和伊枯草素的抗病毒作用效果未見有報道。有研究表明，表面活性素是抗包膜病毒的萬能武器［17］。早在1997年，有研究證明，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的表面活性素可抑制廣譜病毒，如猴泡沫病毒（SFV）、單純皰疹病毒（HSV-1、HSV-2）、貓杯狀病毒（FCV）、猴免疫缺陷病毒（SIV）、鼠腦心肌炎病毒（EMCV）、水泡型口炎病毒（VSV）［20］。2006年，Huang等從枯草芽孢桿菌fmbj上提取主要含有表面活性素、泛革素的抗菌脂肽，進行體外抗病毒試驗，研究發(fā)現(xiàn)抗菌脂肽對偽狂犬病毒（PRV）、豬細小病毒（PPV）、新城疫病毒（NDV）、法氏囊病毒（IBDV）有直接滅活作用，可有效抑制NDV和IBDV的感染和復(fù)制［21］。Wang等證明枯草芽孢桿菌OKB 105及其表面活性素可抑制傳染性胃腸炎病毒（TGEV）進入細胞，并且表面活性素以劑量依賴的方式減少TGEV的斑塊產(chǎn)生［22］。這些研究結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌衍生的肽是一種高效的抗病毒化合物，是研發(fā)抗病毒藥物及抗病毒疫苗較好的候選者。

本研究基于筆者所在實驗室提取的高純度芽孢桿菌抗菌肽（羅克霉素［23］、表面活性素、泛革素及桿菌霉素L），旨在探索這4種抗菌肽是否對PDCoV具有抑制作用，為抗病毒藥物的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、病毒及抗菌肽

LLC-PK1細胞購自中國獸藥檢驗所，LLC-PK1細胞培養(yǎng)條件為37 ℃ 5% CO2，所用培養(yǎng)基為DMEM+10% 胎牛血清（FBS）；PDCoV毒株CZ2020，其滴度為106.25 TCID50/mL，來自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所；表面活性素、羅克霉素、泛革素及桿菌霉素L由筆者所在實驗室提純所得，所有抗菌肽先用DMEM培養(yǎng)基稀釋為 1 mg/mL，作為母液置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，后續(xù)試驗所涉及的抗菌肽稀釋溶劑，均用含有 7.5 μg/mL 胰酶的DMEM培養(yǎng)基。此外，本試驗于2021年12月25日于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所完成。

1.1.2 主要試劑

胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基，購自Gibco公司；Cell Counting kit 8（CCK-8）試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；RIPA（強）蛋白裂解液、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗小鼠IgG和β-actin，均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；FITC標記的羊抗豬熒光二抗，購自Abcam公司；PDCoV-N蛋白單克隆抗體及PDCoV抗豬陽性血清，來自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所。

1.1.3 主要儀器

蛋白電泳儀及蛋白轉(zhuǎn)印儀，購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；倒置熒光顯微鏡，購自日本Olympus公司；實時熒光定量PCR儀及CO2培養(yǎng)箱，購自美國Thermo Fisher公司；ELx 800酶標儀，購自美國BioTek公司。

1.2 方法

1.2.1 抗菌肽對細胞的毒性測定

首先采用含有7.5 μg/mL胰酶的DMEM培養(yǎng)基，將4種抗菌肽分別稀釋至100、50、10、5 μg/mL。將LLC-PK1細胞均勻地鋪在96孔細胞板上，37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)，細胞長滿單層后用無菌的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗3次，加入上述稀釋好的不同濃度的抗菌肽，每孔100 μL。同時設(shè)空白對照，每個試驗組設(shè)置3個重復(fù)。過夜培養(yǎng)24 h后，每孔加入 10 μL CCK-8溶液，在細胞培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)3 h，采用ELx 800酶標儀讀取450 nm處的吸光度。細胞活力=（D抗菌肽-D培養(yǎng)基）/（D空白-D培養(yǎng)基）×100%。

1.2.2 抗菌肽對病毒增殖的影響

將LLC-PK1細胞鋪在24孔細胞板中，37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)，待細胞長滿單層后，采用PBS清洗細胞3次，加入MOI=0.01的PDCoV病毒液，每孔500 μL。在細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1.0～1.5 h，期間每隔0.5 h輕輕搖晃1次細胞板，使病毒更好地融合細胞。將融合好的細胞板用PBS清洗3次，加入不同濃度的抗菌肽，每孔500 μL，即50、10、5 μg/mL，每組試驗設(shè)3個重復(fù)，將只感染了病毒不加抗菌肽的細胞孔設(shè)為空白對照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。重復(fù)本試驗，細胞板用于后續(xù)檢測。收集上清和細胞，用于后續(xù) RT-qPCR、蛋白免疫印跡（Western blot）及間接免疫熒光（IFA）試驗。

1.2.3 RNA提取與RT-qPCR

使用RNA提取試劑盒提取“1.2.2”節(jié)上清中的RNA，通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用超敏高耐受探針法檢測試劑對cDNA進行擴增，所用引物：正向序列5′-ATCGACCACATGGCTCCAA-3′；反向序列5′-CAGCTCTTGCCCATGTAGCT-3′；探針序列5′-CACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAvGCT-3′。

1.2.4 Western blot檢測

取“1.2.2”節(jié)中制作好的24孔細胞板，PBS清洗3次后加入100 μL RIPA細胞裂解液，室溫下裂解10 min后刮取細胞碎片，收集蛋白液。取40 μL蛋白液樣品與5×蛋白上樣緩沖液混合，置于金屬浴中100 ℃煮樣10 min。取10 μL煮好的樣品加入12.5%蛋白膠樣品孔，90 V電壓下使樣品遷移至分離膠后將電壓升至120 V。提前將濾紙與硝酸纖維素（NC）膜浸泡于轉(zhuǎn)膜液中，采用三明治法，將膠體放于濾紙與NC膜中間，用滾輪輕輕去除氣泡。打開蛋白快速轉(zhuǎn)印儀運行 15 min。轉(zhuǎn)印后的NC膜用5%脫脂奶粉室溫封閉 2 h，PBST清洗3次，每次10 min。加入稀釋比為 1 ∶5 000一抗（PDCoV-N蛋白單克隆抗體）或 β-actin （1 ∶1 000）室溫下孵育2 h，PBST清洗后加入稀釋比為1 ∶10 000二抗（山羊抗小鼠）室溫孵育 2 h，最后加入ECL顯色液進行曝光顯色。

1.2.5 IFA檢測

取“1.2.2”節(jié)中制作好的24孔細胞板，PBS清洗3次后加入預(yù)冷的無水乙醇 -20 ℃ 固定30 min，棄去無水乙醇，PBS洗滌3次。每孔加入500 μL 5%脫脂奶粉，37 ℃封閉1 h，PBS清洗3次，每次3～4 min。每孔加入稀釋比為 1 ∶500 的PDCoV豬血清500 μL，37 ℃孵育2 h，PBS清洗后每孔避光加入FITC標記山羊抗豬熒光二抗500 μL，稀釋比為1 ∶500，繼續(xù)孵育1 h后用PBS清洗3次至無非特異性結(jié)合，置于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

用GraphPad Prism 9對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析及作圖，各組試驗數(shù)據(jù)采用One-way ANOVA進行統(tǒng)計分析，用t檢驗法對數(shù)據(jù)進行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽對LLC-PK1細胞活性的影響

為確定抗菌肽藥物的最佳濃度，設(shè)置濃度梯度由高到低依次為100、50、10、5 μg/mL檢測抗菌肽對細胞的毒性。試驗采用CCK-8試劑盒檢測細胞活性，在酶標儀上讀取樣品吸光度（D），計算細胞存活率。由圖1可知，抗菌肽對細胞安全濃度范圍為 50 μg/mL 以下，此時細胞生長狀態(tài)與對照孔形態(tài)無差異，細胞活力達100%；當(dāng)抗菌肽藥物濃度達到 100 μg/mL 時，細胞出現(xiàn)不同程度的皺縮、破裂現(xiàn)象。

2.2 RT-qPCR檢測結(jié)果

為了研究抗菌肽對PDCoV增殖的影響，筆者所在課題組分別向感染了該病毒的細胞中加入濃度為50、10、5 μg/mL 的4種抗菌肽，并采用RT-qPCR

檢測細胞內(nèi)病毒RNA的變化。由圖2可知，隨著抗菌肽濃度的增加，細胞內(nèi)病毒載量逐漸降低，說明抗菌肽能夠在安全濃度范圍內(nèi)通過劑量依賴的方式發(fā)揮更好的抗病毒效果。當(dāng)抗菌肽濃度為 5 μg/mL 時，僅有羅克霉素（P＜0.01）和表面活性素（P＜0.05）能顯著抑制病毒增殖，而泛革素和桿菌霉素L則不具有顯著的抗病毒效果。當(dāng)抗菌肽濃度達到 10 μg/mL 時，4種抗菌肽均能顯著抑制病毒增殖，其中羅克霉素（Plt;0.0 001）CT值高達25.93，其次是表面活性素（Plt;0.001），CT值高達23.96。當(dāng)抗菌肽濃度升至50 μg/mL時，4種抗菌肽均能顯著抑制病毒增殖。

2.3 Western blot檢測PDCoV-N蛋白的表達

為進一步探索抗菌肽對PDCoV增殖的影響，向“1.2.2”節(jié)中制作好的細胞板中加入蛋白裂解液獲取蛋白，采用Western blot方法檢測PDCoV-N蛋白的表達水平。由圖3可知，感染了PDCoV的細胞，在濃度為50 μg/mL的4種抗菌肽作用下，可完全抑制病毒增殖，Western blot法完全檢測不到PDCoV-N蛋白特異性條帶。而羅克霉素和表面活性素在低至10 μg/mL濃度下，即可完全抑制病毒增殖。

2.4 間接免疫熒光（IFA）檢測結(jié)果

采用IFA方法檢測“1.2.2”節(jié)細胞板中細胞存在的病毒，在倒置顯微鏡下觀察熒光量，進一步確定抗菌肽抗病毒效果。由圖4可知，當(dāng)濃度為 5 μg/mL 的抗菌肽作用于感染了PDCoV的細胞時，并未對病毒增殖產(chǎn)生顯著的影響；當(dāng)抗菌肽濃度升至10 μg/mL時，羅克霉素和表面活性素表現(xiàn)出最佳的抗病毒效果；而當(dāng)抗菌肽濃度達到50 μg/mL時，所有抗菌肽均表現(xiàn)出較好的抗病毒效果。這一結(jié)果與筆者所在課題組之前使用RT-qPCR檢測病毒RNA變化、Western blot檢測PDCoV-N蛋白的表達水平得到的結(jié)論一致。

3 討論與結(jié)論

PDCoV是一種新發(fā)現(xiàn)的具有包膜的RNA病毒，它以膜融合的方式侵入宿主細胞，引起仔豬嚴重腹瀉。目前，尚未研制出有效的疫苗和特效治療藥物。在抗PDCoV藥物研究中，具有紅藻凝集素性質(zhì)的格瑞弗森（griffithsin）及褪黑激素類性質(zhì)的褪黑激素（melatonin）、吲哚（indole）、色胺（tryptamine）、L-色氨酸（L-tryptophan）已被證實具有抗病毒能力［24-25］。枯草芽孢桿菌分泌的脂肽類物質(zhì)也有抗病毒作用，但未有報道作為抗PDCoV藥物的研究。表面活性素是枯草芽孢桿菌的衍生物，有研究表明它是一種膜融合抑制劑［26］，具有抗多種包膜病毒的生物活性［20-21］，如單純皰疹病毒、水皰性口炎病毒、猴免疫缺陷病毒和新城疫病毒。羅克霉素是筆者所在團隊新發(fā)現(xiàn)的脂肽類抗生素，被證實具有抗病毒活性［23］。泛革素和桿菌霉素L在抗病毒活性方面未有報道。

本研究首先將表面活性素、羅克霉素、泛革素和桿菌霉素L，以100、50、10、5 μg/mL濃度梯度作用于LLC-PK1細胞，發(fā)現(xiàn)4種抗菌肽在100 μg/mL濃度下，細胞形態(tài)會發(fā)生不同程度的皺縮、破裂現(xiàn)象，說明抗菌肽濃度達到100 μg/mL時具有細胞毒性，其中表面活性素和桿菌霉素L對LLC-PK1細胞毒性最強，這可能與它們具有較強的溶血活性有關(guān)［27］。表面活性素、泛革素和桿菌霉素L都有表面活性劑的特性［28-29］，表面活性劑具有一定毒性，會使紅細胞溶血［30］。然而，由于表面活性劑種類繁多，其毒性也因此存在差異。其中陽離子表面活性素具有較高的溶血活性和細胞毒性［31］；相比之下，泛革素雖然同樣具有表面活性劑特性，但并不會引起強烈的溶血活性和細胞毒性。目前，泛革素的作用機制仍需進一步深入研究。本研究采用RT-qPCR、Western blot和IFA等方法檢測了不同濃度的抗菌肽對PDCoV增殖的影響。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)羅克霉素和表面活性素的濃度為10 μg/mL時，它們表現(xiàn)出較強的抗病毒效果；而泛革素和桿菌霉素L的完全抑制作用需要50 μg/mL的濃度。隨著抗菌肽濃度的遞增，其抗病毒效果也越好，這一結(jié)果與Han等的研究結(jié)果［32］一致。在4種抗菌肽中，羅克霉素表現(xiàn)出最好的抗病毒效果，表面活性素次之，而泛革素和桿菌霉素L的效果相對較弱。

綜上所述，筆者所在實驗室從枯草芽孢桿菌 Bs 916 中提取的4種抗菌肽（表面活性素、羅克霉素、泛革素和桿菌霉素L），濃度范圍在5～50 μg/mL內(nèi)，能夠有效抑制豬δ冠狀病毒在細胞中的增殖，同時不會引發(fā)細胞毒性。其中，羅克霉素表現(xiàn)出最好的抗病毒效果，其次是表面活性素，泛革素和桿菌霉素L也具有一定的抗病毒活性。這一結(jié)論為尋找有效的PDCoV治療方法提供了新思路和理論支持。此外，根據(jù)文獻報道，抗菌肽除了具有抗菌作用外，還可能在免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)和細胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用。因此，這些抗菌肽具有廣闊的應(yīng)用前景，可被開發(fā)成為治療PDCoV感染或其他病原微生物感染的新型藥物。未來的研究可進一步挖掘這些抗菌肽的分子機制，深入了解其在宿主免疫調(diào)節(jié)中的作用以及其對其他病原體的殺滅作用，為新藥物的開發(fā)提供更多的理論基礎(chǔ)和實踐指導(dǎo)。

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