組蛋白去乙?；种苿┱T導(dǎo)羽衣甘藍(lán)小孢子胚狀體發(fā)生和植株再生

摘要：羽衣甘藍(lán)是2年生植物，2年完成1個(gè)有性生殖世代，游離小孢子培養(yǎng)是加快其純合化的有效途徑。但是由于羽衣甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)的誘胚率低，使其難以育種應(yīng)用。組蛋白乙?；且环N重要的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，影響小孢子發(fā)育途徑，促進(jìn)小孢子胚狀體發(fā)生。本研究分別用不同濃度的組蛋白去乙?；种苿┬炼１桨樊惲u肟酸和曲古菌素A處理羽衣甘藍(lán)紅斑鳩的小孢子，以誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生。結(jié)果表明，辛二酰苯胺異羥肟酸濃度為0.075 μmol/L時(shí)，紅斑鳩獲得最多胚狀體，為每個(gè)花蕾獲得20.24個(gè)胚狀體，同時(shí)直接成苗率也達(dá)到最高，為16.07%。曲古菌素A濃度為0～0.150 μmol/L時(shí)，紅斑鳩的胚狀體發(fā)生率和直接成苗率都降低。適當(dāng)濃度的辛二酰苯胺異羥肟酸可以促進(jìn)羽衣甘藍(lán)紅斑鳩小孢子胚狀體發(fā)生和直接成苗率，而0～0.150 μmol/L曲古菌素A對(duì)羽衣甘藍(lán)紅斑鳩胚狀體的發(fā)生和直接成苗率有抑制作用。

關(guān)鍵詞：羽衣甘藍(lán)；小孢子培養(yǎng)；組蛋白去乙?；种苿慌郀铙w發(fā)生

中圖分類(lèi)號(hào)：S635.904" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）04-0168-06

收稿日期：2023-03-30

基金項(xiàng)目：江蘇省重點(diǎn)研發(fā)（現(xiàn)代農(nóng)業(yè)）計(jì)劃（編號(hào)：BE2021376）。

作者簡(jiǎn)介：姚悅梅（1974—），女，新疆石河子人，研究員，從事羽衣甘藍(lán)種質(zhì)創(chuàng)新利用與栽培技術(shù)研究。E-mail：1045714975@qq.com。

通信作者：戴忠良，碩士，研究員，從事甘藍(lán)類(lèi)蔬菜遺傳育種研究。E-mail：daizhongliang2008@126.com。

羽衣甘藍(lán)葉片層次豐富，株型緊湊，被譽(yù)為觀葉植物中的牡丹花，可直接用于瓶插和盆景。觀賞時(shí)間長(zhǎng)且心葉色鮮艷，秋冬季節(jié)被廣泛應(yīng)用于景觀美化。栽培觀賞期有3～4個(gè)月。羽衣甘藍(lán)為綠色春化植物，雜合基因型材料需要6～8年才能培育出可用于商業(yè)種子生產(chǎn)的純合自交系。因此，加速育種材料的純合化具有重要的商業(yè)意義。

游離小孢子培養(yǎng)是利用細(xì)胞全能性和培養(yǎng)單倍體小孢子從而獲得再生植株，可以縮短獲得純合株系的時(shí)間［1］。自Lighter在1989年首次通過(guò)羽衣甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)成功獲得再生植物以來(lái)，這項(xiàng)技術(shù)一直在不斷改進(jìn)、發(fā)展并應(yīng)用于許多十字花科植物［2］。羽衣甘藍(lán)的小孢子培養(yǎng)體系也得到了改進(jìn)和優(yōu)化［3-11］。影響小孢子胚狀體發(fā)生的因素有很多，包括供體植物的基因型、生長(zhǎng)狀態(tài)、培養(yǎng)基、小孢子活力、激素處理和培養(yǎng)環(huán)境等［12］。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可以促進(jìn)小孢子胚狀體發(fā)生，例如2，4-表油菜素內(nèi)酯、脫落酸、水楊酸和茉莉酸、谷胱甘肽和 α-生育酚［7，13-14］。Lighter發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加 6-芐基氨基嘌呤和萘乙酸可以提高甘藍(lán)小孢子胚狀體發(fā)生率［2］。Feng等在2009年對(duì)白菜的研究中發(fā)現(xiàn)，0.05 mg/L 6-芐基氨基嘌呤和0.1～0.2 mg/L 6-萘乙酸可將小孢子胚狀體發(fā)生率提高到8.13個(gè)胚/蕾［15］。Chen等在羽衣甘藍(lán)的研究中，在nln-13培養(yǎng)基中添加亞甲基藍(lán)，提高了胚狀體誘導(dǎo)率［3］，Ari等在2021年對(duì)小孢子進(jìn)行冷休克處理，也提高了胚狀體誘導(dǎo)率［5］。早期，筆者進(jìn)行了羽衣甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)胚狀體誘導(dǎo)非常困難。Jiang等發(fā)現(xiàn)曲古菌素A促進(jìn)了小麥胚狀體發(fā)生［16］。本試驗(yàn)研究了不同濃度的組蛋白去乙?；种苿┬炼１桨樊惲u肟酸和曲古菌素A對(duì)羽衣甘藍(lán)紅斑鳩小孢子胚誘導(dǎo)率和植株再生的影響，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)再生植株的倍性，并研究DH系的園藝特性，以期加速羽衣甘藍(lán)的育種進(jìn)程，提高育種效率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇羽衣甘藍(lán)紅斑鳩作為小孢子培養(yǎng)材料。植株種子于2018年7月中旬在試驗(yàn)基地播種。8月移植到花盆中，10月移植到溫室中。翌年1—2月在溫室抽薹開(kāi)花，在晴天選擇生長(zhǎng)條件良好的花序用于小孢子培養(yǎng)。植株分別種植于沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)和江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)基地。

1.2 小孢子培養(yǎng)

小孢子培養(yǎng)試驗(yàn)在Sato等的方法［17］基礎(chǔ)上進(jìn)行了修改。選擇花瓣與花藥長(zhǎng)度之比（P/A）為0.5～0.8的花蕾作為試驗(yàn)材料，置于4 ℃冰箱中24 h。然后分別用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇和質(zhì)量濃度為0.1%的氯化汞消毒花蕾30 s和6 min，然后用無(wú)菌超純水洗滌3次，每次5 min。將花蕾放置于8～10 mL B5液體培養(yǎng)基中，用無(wú)菌玻璃棒研磨分離小孢子。依次用74 μm不銹鋼細(xì)胞篩和40 μm細(xì)胞篩過(guò)濾懸浮液。隨后，將懸浮液倒入50 mL離心管中，加入B5液體培養(yǎng)基至30 mL，并在2 000 r/min下離心3 min。棄上清液，再次加入B5液體培養(yǎng)基至30 mL，然后離心 3 min。再次移除上清液，將得到的小孢子倒入NLN培養(yǎng)基［18］，并使用血球計(jì)數(shù)板將小孢子濃度調(diào)整為1×105個(gè)/mL。然后將小孢子懸浮液裝入 5 mL 無(wú)菌塑料培養(yǎng)皿（60 mm×15 mm）。每個(gè)培養(yǎng)皿加入100 μL活性炭。最后，用Parafilm 封口膜密封培養(yǎng)皿，在33 ℃下培養(yǎng) 24 h，然后轉(zhuǎn)移至25 ℃黑暗培養(yǎng)。

1.3 組蛋白去乙?；种苿┨幚?/p>

將辛二酰苯胺異羥肟酸和曲古菌素A（美國(guó)賽萊克斯化學(xué)公司）溶解在二甲基亞砜（DMSO）中，濃度為0.5 mmol/L。將溶液的pH值調(diào)節(jié)至5.8，并在無(wú)菌條件下過(guò)濾。配制0、0.025、0.050、0.075、0.100、0.125、0.015 μmol/L的辛二酰苯胺異羥肟酸和曲古菌素A。在小孢子培養(yǎng)過(guò)程中，向培養(yǎng)皿中添加5 mL小孢子懸浮液，分別添加不同體積的辛二酰苯胺異羥肟酸和曲古菌素A。以 0.025 μmol/L 為例，每個(gè)培養(yǎng)皿（5 mL小孢子懸浮液）需要250 nL 辛二酰苯胺異羥肟酸。因此，分別向每個(gè)培養(yǎng)皿中添加0 nL（相當(dāng)于0 μmol/L作為對(duì)照）、250 nL（0.025 μmol/L）、500 nL（0.050 μmol/L）、750 nL（0.075 μmol/L）、1.00 μL（0.100 μmol/L）、1.25 μL（0.125 μmol/L）和1.50 μL（0.150 μmol/L）辛二酰苯胺異羥肟酸和曲古菌素A溶液。

1.4 胚狀體發(fā)生與植株再生

當(dāng)胚狀體長(zhǎng)到0.5 cm時(shí)（小孢子培養(yǎng)后約 20 d），將其轉(zhuǎn)移到45 r/min搖床中，25 ℃暗培養(yǎng)1周。統(tǒng)計(jì)胚狀體數(shù)量并轉(zhuǎn)移到固體Murashige and Skoog（MS）培養(yǎng)基（含7.5 g/L瓊脂粉、0.1 g/L活性炭、30 g/L蔗糖，pH值為5.8）中。將胚狀體種植在錐形瓶中，當(dāng)胚生長(zhǎng)成愈傷組織時(shí)，將愈傷組織切割并轉(zhuǎn)移到含有5.5 g/L瓊脂粉的MS固體分化培養(yǎng)基中。這個(gè)過(guò)程重復(fù)2～3次，每次持續(xù)20～25 d。

1.5 倍性鑒定

用FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD Biosciences公司）鑒定再生植株的倍性。選擇葉面積約 2 cm2 的新鮮葉片，置于培養(yǎng)皿中，加入 1.5 mL chopping buffer緩沖溶液（含0.5 mmol/L精胺、15 mmol/L Tris、2 mmol/L EDTA-2Na、0.1% TritonX-100、20 mmol/L NaCl、80 mmol/L KCl和 15 mmol/L β-巰基乙醇，pH值為7.2～7.5）。用醫(yī)用剪刀快速切碎葉片組織，經(jīng)過(guò)300目篩過(guò)濾到離心管中，10 000 r/min離心10 min。分離上清液并避光加入1 mL PI染料溶液染色15min。最后，使用500目篩將混合溶液過(guò)濾到樣品管中進(jìn)行測(cè)定。以二倍體植株作為對(duì)照。

1.6 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析

在小孢子培養(yǎng)試驗(yàn)中，每個(gè)組蛋白去乙酰化酶抑制劑濃度處理重復(fù)3次。小孢子培養(yǎng)之后20 d統(tǒng)計(jì)胚狀體數(shù)。使用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并使用單因素方差分析（α=0.05）進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 辛二酰苯胺異羥肟酸和曲古菌素A對(duì)小孢子胚狀體發(fā)生的影響

辛二酰苯胺異羥肟酸促進(jìn)了羽衣甘藍(lán)紅斑鳩小孢子胚狀體的發(fā)生（表1）。辛二酰苯胺異羥肟酸濃度為0.075 μmol/L時(shí)，紅斑鳩胚狀體發(fā)生率達(dá)到最高，即20.24胚/蕾，是對(duì)照組的1.39倍（圖1）。辛二酰苯胺異羥肟酸濃度超過(guò)0.075 μmol/L時(shí)會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響，小孢子胚狀體誘導(dǎo)率降低。不同濃度辛二酰苯胺異羥肟酸誘導(dǎo)小孢子胚胎發(fā)生率存在顯著差異。

曲古菌素A對(duì)羽衣甘藍(lán)紅斑鳩胚狀體的發(fā)生產(chǎn)生了抑制作用（表2）。0.025～0.150 μmol/L曲古菌素A均導(dǎo)致紅斑鳩胚狀體發(fā)生率降低。其中0.075 μmol/L曲古菌素A誘導(dǎo)紅斑鳩胚狀體發(fā)生最少，即6.35 胚/蕾（圖2）。

2.2 辛二酰苯胺異羥肟酸和曲古菌素A對(duì)小孢子植株再生的影響

將胚狀體移植到MS固體培養(yǎng)基中（圖3-b），然后直接生長(zhǎng)成再生幼苗（圖3-c）和愈傷組織，接著將再生幼苗和愈傷組織移植到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根之后長(zhǎng)成正常幼苗（圖3-d），將試管苗移植到花盆中（圖3-e）。當(dāng)辛二酰苯胺異羥肟酸濃度為0.075 μmol/L時(shí)，紅斑鳩直接長(zhǎng)成幼苗的比例最高，為16.07%，是對(duì)照的4.37倍，胚狀體長(zhǎng)成愈傷組織的比率達(dá)到最低，為46.43%，是對(duì)照的73%，胚狀體死亡率提高到37.50%，是對(duì)照的1.13倍。紅斑鳩胚狀體的死亡率在 0.025 μmol/L 時(shí)降到最低值，為17.24%，是對(duì)照的52%（表3）。

0～0.150 μmol/L 曲古菌素A對(duì)紅斑鳩直接成苗率有抑制效果，0.10 μmol/L 曲古菌素A效果最為明顯，直接成苗率為0。當(dāng)曲古菌素A濃度為0.050 μmol/L時(shí)，紅斑鳩愈傷組織的比率達(dá)到最低，為61.03%，是對(duì)照的98%。曲古菌素A提高了紅斑鳩胚狀體死亡率，當(dāng)曲古菌素A濃度為 0.050 μmol/L 時(shí)，胚狀體死亡率達(dá)到最高，為36.65%，是對(duì)照的1.09倍（表4）。

2.3 小孢子再生植株的倍性鑒定

紅斑鳩的小孢子游離培養(yǎng)的再生植株是由不同倍性的植株組成的，分為單倍體、二倍體、四倍體。再生植株的倍性是通過(guò)流式細(xì)胞儀鑒定，圖4中橫坐標(biāo)接近100、200、400分別代表單倍體、二倍體、四倍體植株，共獲得紅斑鳩再生植株1 023株，其中單倍體植株746株，占比最高，為72.92%，雙倍體植株275株，占比為26.88%，四倍體植株只有2株，占比為0.20%。

2.4 DH系園藝學(xué)特征

小孢子游離培養(yǎng)獲得的雙單倍體品系的園藝性狀有著豐富的變異。紅斑鳩表現(xiàn)為紅色內(nèi)葉綠色外葉。通過(guò)游離小孢子培養(yǎng)獲得的DH系有內(nèi)外葉都是紅綠嵌合（圖5-a）、內(nèi)葉紅綠嵌合綠色外葉（圖5-b，5-c）、粉色內(nèi)葉綠色外葉（圖5-d）、內(nèi)葉紅綠嵌合外葉部分嵌合部分綠色（圖5-e）和白色內(nèi)葉綠色外葉（圖5-f）。

3 討論與結(jié)論

本研究采用辛二酰苯胺異羥肟酸和曲古菌素A處理羽衣甘藍(lán)紅斑鳩小孢子。結(jié)果表明，當(dāng)辛二酰苯胺異羥肟酸濃度為0.075 μmol/L，紅斑鳩獲得了最多的胚狀體，每個(gè)花蕾可得到20.24個(gè)胚狀體，并將直接成苗率提高至16.07%。0.000～0.150 μmol/L曲古菌素A對(duì)羽衣甘藍(lán)紅斑鳩胚狀體的發(fā)生和成苗率有抑制作用。其中0.075 μmol/L的曲古菌素A誘導(dǎo)紅斑鳩胚狀體發(fā)生最少，每個(gè)花蕾僅有6.35個(gè)胚狀體。0.100 μmol/L 曲古菌素A效果最為明顯，直接成苗率為0。

組蛋白去乙?；种苿?duì)小孢子胚狀體發(fā)生有明顯的影響。辛二酰苯胺異羥肟酸是組蛋白去乙酰化抑制劑。組蛋白乙酰化酶和組蛋白去乙?；钢g的平衡調(diào)節(jié)組蛋白乙?；?。當(dāng)植物體內(nèi)的酶活性受到抑制時(shí)，平衡被打破，組蛋白乙?；桨l(fā)生變化，從而誘導(dǎo)小孢子胚狀體主要調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；因此，大量細(xì)胞從花粉途徑轉(zhuǎn)變?yōu)榕郀铙w發(fā)育途徑，隨后產(chǎn)生大量胚狀體［19］。在甘藍(lán)型油菜的研究中，Li等發(fā)現(xiàn)，組蛋白去乙?；种苿┬炼１桨樊惲u肟酸增加了小孢子胚狀體發(fā)生的總量［20］。在對(duì)小白菜的研究中，發(fā)現(xiàn)丁酸鈉、曲古菌素A和辛二酰苯胺異羥肟酸可提高胚狀體產(chǎn)量［19］。Liu等發(fā)現(xiàn)，曲古菌素A對(duì)3種切花羽衣甘藍(lán)小孢子胚胎發(fā)生有促進(jìn)作用［21］。在本研究中，羽衣甘藍(lán)紅斑鳩小孢子分別用7個(gè)濃度的辛二酰苯胺異羥肟酸和曲古菌素A處理。結(jié)果表明，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)辛二酰苯胺異羥肟酸提高了的小孢子胚狀體發(fā)生率。不同濃度辛二酰苯胺異羥肟酸表現(xiàn)出不同的胚狀體誘導(dǎo)效果，0.075 μmol/L 辛二酰苯胺異羥肟酸效果最好。但曲古菌素A抑制了胚狀體的發(fā)生。

利用雜交種作為小孢子培養(yǎng)材料可以產(chǎn)生豐富的純和突變材料。Liu等對(duì)紅葉切花羽衣甘藍(lán)雙色鶴進(jìn)行小孢子培養(yǎng)產(chǎn)生了具有粉紅色、白色和綠色葉子的材料［21］。本研究中，對(duì)紅色內(nèi)葉的紅斑鳩進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，產(chǎn)生了紅綠嵌合葉片、粉色葉片和白色內(nèi)葉的純合系。純合系具有豐富變異是培育觀賞甘藍(lán)的重要材料。觀賞甘藍(lán)純合系的所有基因位點(diǎn)都是純合的，可以穩(wěn)定遺傳，是選育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合的寶貴材料。

本研究篩選出了適合羽衣甘藍(lán)的小孢子胚狀體誘導(dǎo)劑，并確定了切花羽衣甘藍(lán)的適宜濃度，對(duì)游離小孢子培養(yǎng)在羽衣甘藍(lán)上的應(yīng)用具有重要意義。本研究為改進(jìn)羽衣甘藍(lán)的游離小孢子培養(yǎng)做出了貢獻(xiàn)，下一步將以純合系為親本配制雜交組合，測(cè)定其配合力，篩選出優(yōu)良雜交種。

參考文獻(xiàn)：

［1］Fehér A，Pasternak T P，Dudits D. Transition of somatic plant cells to an embryogenic state［J］. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2003，74（3）：201-228.

［2］Lighter R. Efficient yield of embryoids by culture of isolated microspores of different Brassicaceae species［J］. Plant Breeding，1989，103（2）：119-123.

［3］Chen W S，Zhang Y，Ren J，et al. Effects of methylene blue on microspore embryogenesis and plant regeneration in ornamental kale （Brassica oleracea var. acephala）［J］. Scientia Horticulturae，2019，248：1-7.

［4］Dai X G，Shi X P，F(xiàn)u Q，et al. Improvement of isolated microspore culture of ornamental kale （Brassica oleracea var. acephala）：effects of sucrose concentration，medium replacement，and cold pre-treatment［J］. The Journal of Horticultural Science and Biotechnology，2009，84（5）：519-525.

［5］Ari E，Bedir H，Mutlu N. Enhancement of embryogenesis in freshly isolated microspore cultures of ornamental kale through direct cold shock treatment［J］. Scientia Horticulturae，2021，280：109961.

［6］Niu R Q，Zhang Y，Tong Y，et al. Effects of p-chlorophenoxyisobutyric acid，arabinogalactan，and activated charcoal on microspore embryogenesis in kale［J］. Genetics and Molecular Research，2015，14（2）：3897-3909.

［7］Wang Y S，Tong Y，Li Y F，et al. High frequency plant regeneration from microspore-derived embryos of ornamental kale （Brassica oleracea L. var. acephala）［J］. Scientia Horticulturae，2011，130（1）：296-302.

［8］Yao Y，Zhang Z，Shan X，et al. Microspore embryogenesis cytological structures variation and plant regeneration of kale［J］. Southern Agriculture，2019，50（5）：924-931.

［9］湯青林，宋 明，張鐘靈. 甘藍(lán)類(lèi)蔬菜游離小孢子培養(yǎng)研究進(jìn)展［J］. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2000，13（3）：98-103.

［10］姜鳳英，馮 輝. 羽衣甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)初報(bào)［J］. 園藝學(xué)報(bào)，2005，32（5）：884.

［11］馮 輝，姜鳳英，馮建云，等. 羽衣甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究及應(yīng)用［J］. 園藝學(xué)報(bào)，2007，34（4）：1019-1022.

［12］Winarto B，da Silva J A T. Microspore culture protocol for Indonesian Brassica oleracea［J］. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2011，107（2）：305-315.

［13］Ahmadi B，Shariatpanahi M E，da Silva J A T. Efficient induction of microspore embryogenesis using abscisic acid，jasmonic acid and salicylic acid in Brassica napus L.［J］. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2014，116（3）：343-351.

［14］Hoseini M，Ghadimzadeh M，Ahmadi B，et al. Effects of ascorbic acid，alpha-tocopherol，and glutathione on microspore embryogenesis in Brassica napus L.［J］. In Vitro Cellular amp; Developmental Biology-Plant，2014，50（1）：26-35.

［15］Feng H，Yang S，Wang C N，et al. Obtaining and utilization of DH lines in pakchoi （Brassica rapa L. ssp. chinensis L.）［J］. Scientia Agricultura Sinica，2009，42（9）：3195-3202.

［16］Jiang F Y，Ryabova D，Diedhiou J，et al. Trichostatin A increases embryo and green plant regeneration in wheat［J］. Plant Cell Reports，2017，36（11）：1701-1706.

［17］Sato T，Nishio T，Hirai M. Plant regeneration from isolated microspore cultures of Chinese cabbage （Brassica campestris spp. pekinensis）［J］. Plant Cell Reports，1989，8（8）：486-488.

［18］Lichter R. Induction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus［J］. Zeitschrift Für Pflanzenphysiologie，1982，105（5）：427-434.

［19］Zhang L，Zhang Y，Gao Y，et al. Effects of histone deacetylase inhibitors on microspore embryogenesis and plant regeneration in Pakchoi （Brassica rapa ssp. chinensis L.）［J］. Scientia Horticulturae，2016，209：61-66.

［20］Li H，Soriano M，Cordewener J，et al. The histone deacetylase inhibitor trichostatin A promotes totipotency in the male gametophyte［J］. The Plant Cell，2014，26（1）：195-209.

［21］Liu C H，Song G X，Zhao Y H，et al. Trichostatin A induced microspore embryogenesis and promoted plantlet regeneration in ornamental kale （Brassica oleracea var. acephala）［J］. Horticulturae，2022，8（9）：790.