葡萄霜霉菌株的收集及侵染12個葡萄品種后癥狀差異分析

摘要：葡萄霜霉病的廣泛傳播會對我國葡萄的產量及質量造成極大的危害。為了科學地防治葡萄霜霉病的傳播，從江蘇、浙江和上海等長三角?。ㄊ校┑钠咸言耘鄥^(qū)采集編號為BS的霜霉菌菌株樣品進行鑒定，之后以12 個葡萄品種為寄主材料進行致病力試驗。將霜霉菌株侵染葡萄后的表型劃分為5類：易感病（A型）、感病（B型）、較感病（C型）、較抗病（D型）、抗?。‥型）。結果表明，17份菌株的致病力程度多在A型到C型之間，具有歐亞種背景的葡萄品種對所有菌株均較感病，其中以紫甜無核和黑比諾最為感?。ˋ型）；3種砧木葡萄對其中12份菌株較為抗病，葉片侵染部位有超敏反應的壞死斑點，其中以砧木Kober 5BB最抗?。‥型）；具有歐美雜交背景的品種抗病性居中，其中以夏黑和陽光玫瑰較為抗病（D型）。為了驗證該分級系統(tǒng)的可行性，挑選了E型葡萄品種砧木Kober 5BB和A型葡萄品種紫甜無核進行進一步的致病力測試和霜霉孢子囊形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)試驗結果一致。該研究為不同遺傳背景的葡萄抗病雜交育種提供了一定的理論基礎。

關鍵詞：葡萄；病原寄主互作；霜霉??；超敏死亡；致病力

中圖分類號：S436.631.1" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）04-0149-08

收稿日期：2023-06-28

基金項目：國家自然科學基金青年基金（編號：32202433）；江蘇省自然科學基金青年項目（編號：BK20200541）；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目（編號：130809007）；江蘇省農業(yè)科學院基本科研業(yè)務專項［編號：ZX（23）3016］。

作者簡介：鞏培杰（1988—），男，甘肅慶陽人，博士，助理研究員，研究方向為葡萄遺傳育種與逆境生物學。E-mail：gongpeijie@jaas.ac.cn。

通信作者：房經貴，博士，教授，研究方向為葡萄遺傳育種與發(fā)育生物學等。E-mail：fanggg@njau.edu.cn。

葡萄（Vitis vinifera L.）屬于葡萄科葡萄屬落葉藤本植物，是全球栽培范圍最廣、經濟價值最高的水果之一。然而，各種病原物的廣泛傳播、發(fā)病對我國葡萄的產量及質量造成極大的危害。其中，葡萄霜霉病是危害最嚴重且影響最為廣泛的病害之一［1-2］。葡萄霜霉病由霜霉菌（Plasmopara viticola）引起，在全球各地的葡萄主栽區(qū)都有發(fā)生，主要危害葡萄葉片、穗軸、新梢、果梗、卷須等組織，造成葡萄植株大量枯斑、干枯甚至提早落葉并形成大量爛果，嚴重影響葡萄產量和果實品質［3-5］。葡萄園一旦遭受霜霉病侵染，很難防治徹底［6-8］ 。

葡萄霜霉病多發(fā)生在潮濕環(huán)境中，如果不采取及時的防治措施，該卵菌能夠在短時間內給葡萄園造成毀滅性的打擊［9］。自20世紀80年代初期巨峰葡萄的成功引入，我國南方葡萄栽培面積迅速擴大。現(xiàn)如今，長江三角洲地區(qū)已成為我國新興的大粒鮮食葡萄商品生產區(qū)［10］。但該產區(qū)溫暖濕潤，每年 6— 7月雨水多濕度高，導致霜霉病病害嚴重影響葡萄果實的品質及產量，因此研究并提高該產區(qū)葡萄抵抗霜霉病的能力具有重要意義。有關不同葡萄種類對霜霉病的抗性已經有較多研究，而對于霜霉菌菌株劃分以及在該產區(qū)葡萄中的致病力研究有待進一步探索［11-13］。

對于防止葡萄受霜霉菌危害的研究，國內外長期以來都在持續(xù)關注［14-17］。目前，葡萄種植者主要通過預測天氣以及使用殺真菌劑對霜霉病進行有效防控。然而，在整個栽培和果實成熟季節(jié)，必須多次施用大量殺真菌劑才可以使病原體得到控制［6，18-20］。為了提高果實品質，降低藥劑的使用效率，需要更充分、更系統(tǒng)地研究霜霉病菌，以此更好地防治葡萄霜霉病的發(fā)生。

本研究利用表型鑒定、顯微鏡觀察和高通量測序等手段，將田間采集的病原樣品進行鑒定，確定采集到的病原菌為葡萄霜霉菌后進一步建立葡萄霜霉菌致病力可視化分類系統(tǒng)。在此基礎上，將不同的菌株與葡萄寄主材料進行組合，明確各菌株在葡萄中的危害程度，進而篩選出其中較為感霜霉病和較為抗霜霉病的葡萄品種，以期為田間霜霉病的防控提供一定的策略性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所有葡萄材料均于2022年8月取自南京農業(yè)大學白馬葡萄教學科研基地。共采集12種葡萄品種材料，分別為巨峰、巨玫瑰、陽光玫瑰、夏黑、紫甜無核、紅地球、森田尼無核、玫瑰香、黑比諾、貝達、Kober 5BB、1103 Paulsen。

霜霉菌材料：收集長三角葡萄栽培地區(qū)的霜霉菌，分別命名編號（表1），共收集到來自江蘇、浙江和上海等地的17個菌株樣品。

1.2 葡萄霜霉病病原菌孢子囊離體收集保存

使用微生物孢子收集裝置（圖1）收集孢子囊粉。葉片常溫下放置除濕后，利用真空原理，從接種部分地毯式吸取霜霉孢子囊；將霜霉單孢子囊菌株進行干燥處理，真空收集孢子囊粉于1.5 mL離心管，分裝，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱，可長期保存1～2年；使用時，在離心管中加入ddH2O，配制孢子囊懸浮液接種于新鮮葉片，之后用“1.3”節(jié)中的方法培養(yǎng)。

1.3 葡萄霜霉病病原菌的采集與培養(yǎng)

在田間采集新鮮、無殺菌劑污染的葉片病樣。采集后將病原菌配制成孢子囊懸浮液，接種在無菌水清洗后的新葉背光面，將其放于人工氣候箱黑暗培養(yǎng)24 h。將葉片正面（光照面）向下貼放于水瓊脂培養(yǎng)基上，在22 ℃，相對濕度80%～100%，黑暗8 h/光照16 h 交替的條件下培養(yǎng)。待新孢子囊長出后，在解剖鏡下用鑷子挑取，將單孢子囊接種在新葉片上，長出新鮮霉層便可作為單孢子囊菌株。

1.4 霜霉菌侵染葉盤癥狀檢測

對霜霉菌侵染葉盤癥狀進行分析，具體步驟為：（1）用蒸餾水短暫沖洗幼葉（距莖尖第4和第7張葉之間的葉片），之后用打孔器切出直徑為 1.5 cm 的葉盤。將葉盤正面（光照面）向下，放置于鋪好濕濾紙的培養(yǎng)皿中；（2）使用目的菌株的孢子囊配制成懸浮液，利用微生物孢子計數(shù)器計算孢子囊濃度為40 000個/mL；（3）開始互作侵染試驗時，將調節(jié)好濃度的孢子懸浮液接種30 μL在葉盤中心位置，黑暗孵育24 h，之后在保濕、18 ℃、16 h光照和 8 h 黑暗的光周期條件下進一步培養(yǎng)。侵染后在體視顯微鏡下觀察癥狀、拍照并記錄。

1.5 霜霉菌侵染過程的化學組織染色及顯微鏡觀察

為了能夠確定和比較品種間的表型反應差異，在霜霉菌處理后開始拍攝葉盤照片，每24 h重復1次，直到第4天；之后每48 h重復1次，直到第10天。此外，葉盤用Blankophor溶液染色，以使病原體的結構在顯微鏡下呈現(xiàn)特異的熒光，便于觀察。具體操作方法：（1）將目的觀測葉盤用蒸餾水清洗向光面，然后用吸水紙擦干（背光面，尤其接種部位避免清洗）。（2）將葉盤浸染面朝上，放在顯微鏡載玻片上，并用30 μL Blankophor溶液處理侵染區(qū)域。（3）使用熒光顯微鏡進行光學觀察，在紫外光下利用相機并在DAPI模式（濾光片A，激發(fā)濾光片BP 340～380 nm，干涉濾光片LP 425）下進行熒光染色觀察。 （4）使用Leica Application Suite v3.3.1軟件保存并分析觀察圖片結果。

1.6 葡萄霜霉菌DNA提取

將分離得到的霜霉菌孢子囊粉收集至1.5 mL離心管，放入液氮速凍，使用研磨機粉碎研磨后進行DNA提取。

1.7 菌種鑒定18S測序分析

為了在分子生物學層面鑒定獲得霜霉菌菌株的菌種以及純度，以奧維森公司通用引物18S進行PCR擴增，以ddH2O 作陰性對照，之后將PCR產物條帶回收，純化后進行測序比對和鑒定分析等。

2 結果與分析

2.1 葡萄霜霉菌分離結果

盡量在田間采集背面附著有霜霉菌孢子囊的葉片，葉片上不要有其他病原菌存留，并記錄采集病葉的葡萄品種。從中成功分離獲得菌株17株（表1），均妥善存儲于-80 ℃冰箱。

2.2 葡萄霜霉菌菌株在解剖鏡、顯微鏡下的形態(tài)學特征

通過繼代擴繁發(fā)現(xiàn)，葉片普遍接菌后7～10 d在葉背部觀察到白色的霉層。將葉盤置于解剖鏡下觀察到典型的葡萄霜霉菌孢囊梗及孢子囊。挑取少量葉片背部白色菌層在顯微鏡下觀察，可更加清晰地觀察到孢囊梗單軸式近直角分支。分支末端平鈍，孢子囊卵圓形，有乳突（圖2）。通過解剖鏡、顯微鏡觀察說明離體獲得的病原菌為單軸葡萄霜霉病菌。

2.3 葡萄霜霉菌18S多態(tài)性分析及菌種鑒定結果

18S rDNA為編碼真核生物核糖體小亞基rRNA的DNA序列，在結構上分為保守區(qū)和高變區(qū)。保守區(qū)反映生物物種間的親緣關系，高變區(qū)反映物種間的差異。利用卵菌、真菌18S rDNA擴增子保守區(qū)域進行PCR，在樣品中克隆獲得1 300 bp的特異片段。經測序之后鑒定，片段來源于霜霉菌，證明試驗中所分離的病原物為葡萄霜霉菌（圖3）。

此外，18S多態(tài)性分析結果顯示，離體收集霜霉菌孢子囊樣品的純度均在85%以上，其中純度高于95%的有3個，說明病原菌材料純度高，可基本排除其他病原物的干擾。

2.4 葡萄霜霉菌侵染不同葡萄品種后癥狀分級系統(tǒng)的制定

本研究以12個葡萄品種為寄主材料，以17個霜霉菌株為病原材料進行霜霉病原與葡萄寄主的互作試驗。為了更好地量化霜霉菌侵染力與超敏反應的程度，在前人研究［23］的基礎上，劃分了不同株系侵染葡萄寄主后的癥狀級別（圖4）。將霜霉菌菌株侵染后葡萄葉盤的表型劃分為5類，描述如下：易感?。ˋ型）、感?。˙型）、較感?。–型）、較抗?。―型）和抗?。‥型）。將超敏反應引起的壞死現(xiàn)象劃分為3類：+（輕度）、++（中度）、+++（重度）。

2.5 葡萄霜霉菌侵染不同葡萄品種后癥狀分析

從12種不同葡萄品種中進行霜霉菌菌株侵染后的癥狀差異分析（圖5）。結果顯示，歐亞種葡萄對所有菌株均感病，各菌株的致病力程度多在A型到C型之間；其中以紫甜無核、黑比諾最為感病。紫甜無核對所有菌株的感病程度均達到A型。此外，在所有歐亞種葡萄侵染過程中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的超敏壞死斑點。在試驗的12個品種中，3種砧木葡萄對霜霉菌最為抗病。除菌株BM-1、BS-1、BS-5、BS-7以及S-SH-1可以對部分砧木品種形成A型的致病程度之外，其余12個菌株對砧木葡萄品種的致病能力相較歐亞、歐美種葡萄均明顯下降，致病力程度多在C型到E型之間。并且Kober 5BB和1103 Paulsen品種在葉盤上形成壞死斑點，其中砧木Kober 5BB的抗霜霉病表現(xiàn)以及超敏死亡現(xiàn)象最為明顯。具有歐美雜交背景的品種抗病性則居中，其中以夏黑和陽光玫瑰較為抗病且夏黑對6個菌株BM-1、BS-2、ZJ-1、HZ-1、YK-1、SH-CH-1伴有超敏反應的壞死斑點。通過以上試驗結果可篩選出河岸葡萄雜交后代Kober 5BB為其中最抗霜霉病的品種且伴有明顯的超敏反應，篩選出歐亞種葡萄紫甜無核為其中最感霜霉病的品種且未觀察到超敏反應現(xiàn)象。

2.6 抗/感病葡萄受霜霉病菌株侵染后的葉片癥狀分析

根據(jù)以上試驗結果，在相同的霜霉菌侵染條件下篩選出2個分別抗/感霜霉菌的代表品種（Kober 5BB與紫甜無核），分別在侵染后1、7、14 d時觀察其癥狀差別。結果表明，野生美洲河岸葡萄后代品種Kober 5BB較抗霜霉病，葉片和葉盤上均沒有觀察到霜霉孢子囊霉層并且葉面上伴有明顯的超敏反應壞死斑點現(xiàn)象（圖6-A）。而傳統(tǒng)歐亞葡萄品種 紫甜無核易感霜霉病，可以在接種7 d后的葉片和葉盤上觀察到明顯的霜霉層但不伴有超敏反應現(xiàn)象（圖6-B）。

2.7 抗/感病葡萄葉片受霜霉病菌菌株侵染后的顯微染色觀察

為了更進一步地了解2個葡萄品種在侵染過程中病原菌的形態(tài)變化，基于圖6的結果進一步細化了侵染后初期的5個時間點（0、1、3、5、7 d），對葡萄中霜霉菌的形態(tài)結構進行了對比觀察。如圖7所示，0 d 時，2個品種葉片的氣孔中均能觀察到浮游孢子的侵入，被侵染的氣孔內大部分含有2～4個浮游孢子。1 d時均能觀察到浮游孢子的囊化和萌發(fā)狀態(tài)。3 d時，2個品種癥狀差異逐漸加大，紫甜無核快速形成菌絲和吸器并從氣孔四周蔓延。而Kober 5BB中菌絲形成相對較少，僅有很少的吸器形成，這時部分氣孔周圍出現(xiàn)超敏死亡現(xiàn)象。5 d時，紫甜無核中已經可以觀察到大量帶有吸器的菌絲體并有少量孢子囊的出現(xiàn)。而Kober 5BB中沒有觀察到孢子囊的形成，但此時氣孔周圍的超敏死亡現(xiàn)象更加明顯。7 d時，紫甜無核葉片已經到了發(fā)病的旺盛階段，大量孢子囊附著在孢子梗上。在Kober 5BB中觀察到菌絲體在葡萄葉片內進一步發(fā)展，但極少能觀察到孢子囊的形成。以上結果說明超敏壞死現(xiàn)象可以幫助Kober 5BB葡萄增強抗霜霉病能力。

3 討論與結論

葡萄霜霉病是一種極具破壞性的病原體，在全球范圍內給葡萄栽培帶來巨大的經濟損失。在多雨潮濕環(huán)境中，如果不采取及時的防治措施，該卵菌能夠在短時間內給葡萄園造成嚴重損失。本研究對不同霜霉菌株和不同品種葡萄寄主進行組合侵染，以深入了解葡萄和霜霉菌的互作機理。此外，本研究利用改進的微生物孢子收集技術，將不同毒性的霜霉病菌菌株鑒定、分類、分裝和長期 -80 ℃ 保存，改善了之前葡萄霜霉菌離體保存期短的問題。最后，本研究通過不同生態(tài)類型的霜霉菌菌株，在主栽鮮食葡萄上對霜霉病癥狀進行深入的多樣性分析，為田間霜霉病的防控提供依據(jù)。

19世紀后期，伴隨著歐洲葡萄向全球引種栽培過程，葡萄霜霉病幾乎傳播到了全世界所有的葡萄主要栽培區(qū)［21-23］。霜霉病具體傳入我國的地點以及方式目前尚不清楚，但在許多省份都有分布［9，24-25］。幾乎所有的歐亞種葡萄都感霜霉病，病害癥狀也都相似。如果防治不及時，霜霉病對葡萄樹的長勢及產量都有很大的影響。在病原體和寄主植物共同進化的漫長歷史中，植物已經進化出多層防御策略［17，26］。美洲的野生葡萄由于長期與霜霉病菌共存、進化，形成了較高的防御體系［27-28］。砧木品種的親本，如110R、5BB、1103P、SO4等都有美洲野生葡萄的親緣關系，本試驗的結果與之相符合。砧木葡萄中的抗病反應可以作為葡萄抗病機制研究的寄主材料。

在霜霉菌收集和離體擴繁方面，主要制約因素是該病菌屬于活體寄生型病原體，只能在活體葡萄葉上進行人工培養(yǎng)［29］。目前收集孢子仍然需要利用傳統(tǒng)的毛刷，收集過程費時費力。在離體保存孢子方面，現(xiàn)有的技術很難保證收集到干燥和無雜質的純孢子。在潮濕的環(huán)境下，孢子的保存期很難超過3個月，這導致很多科研工作無法高效展開。本試驗建立了一種收集植物病原菌孢子囊的簡易裝置，解決了葡萄霜霉菌難收集、難長期保存的問題。收集好的孢子囊用封口膜封閉后放入液氮中速凍，可置于-80 ℃超低溫冰箱長期保存。經檢測，利用此裝置收集的孢子囊在-80 ℃的環(huán)境中可以保存1年以上。

本試驗提供了一種簡便的方法來評估菌株感染不同抗性水平宿主的能力，并基于其致病力為病原菌表型建立分類系統(tǒng)。使用此系統(tǒng)可在選定菌株中發(fā)現(xiàn)表型差異。由于田間種群的多樣性，在采樣中盡量采集單一來源的孢子來獲得穩(wěn)定遺傳材料用于隨后的試驗。

此外，本試驗前期使用葉盤生物測定法來觀察霜霉菌及其宿主的相互作用。通過砧木葡萄和具有代表性的12個葡萄品種與來自3個省/市葡萄產區(qū)的霜霉菌分離株或菌株進行互作，發(fā)現(xiàn)歐亞種葡萄較感病，其中以紫甜無核、黑比諾最感病。3種砧木葡萄最抗病且有壞死斑點，其中Kober 5BB最抗病。歐美雜交種的抗病性居中，其中以夏黑、陽光玫瑰較為抗病。結果顯示河岸葡萄雜交后代Kober 5BB為其中最抗霜霉病的品種且伴有明顯的超敏反應現(xiàn)象。超敏反應是植株在抵抗病原物入侵時一種特殊的細胞程序性死亡形式。這種形式的細胞死亡可以有效抑制病原菌的擴散，使寄主其他部位受病原菌侵染的可能性大幅降低，提高寄主植物的抗病能力［30-31］。

霜霉菌是通過吸器從寄主葡萄細胞中汲取養(yǎng)分的。可以確定Kober 5BB中霜霉菌產生了吸器結構并有明顯的超敏死亡現(xiàn)象發(fā)生。Kober 5BB受侵染后的表現(xiàn)形態(tài)，與河岸葡萄更為貼近，推測這可能與河岸葡萄是Kober 5BB的親本有關。此外，筆者所在課題組觀察到在感病葡萄品種中，孢子囊的形成相對之前報道的晚2 d左右，推測可能與菌株的侵染力或者侵染效率的強弱有關［32］。

本研究利用前期建立的一種收集植物病原菌孢子囊的簡易裝置收集和長期保存葡萄霜霉菌。利用病原菌與寄主為材料建立了可視化的霜霉菌侵害寄主葡萄的癥狀分級系統(tǒng)，篩選出E型葡萄 Kober 5BB最抗霜霉病，有明顯的超敏死亡現(xiàn)象；篩選出A型葡萄紫甜無核最感霜霉病，未觀察到超敏死亡現(xiàn)象。

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