LRR-RLKs參與番茄抗根結(jié)線蟲病途徑中的功能分析與驗證

摘要：前期以對南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）具有熱穩(wěn)定抗性的野生秘魯番茄LA3858（Mi-3/Mi-3）為試材，采用不同土壤溫度處理形成抗感態(tài)，進行轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）。本研究以該測序數(shù)據(jù)為依托，篩選出8個編碼LRR-RLKs的差異表達基因（DEGs）并進行相關(guān)分析與功能驗證。結(jié)果表明，目標LRR-RLKs基因分布在番茄的1號、2號、3號、5號、7號和8號染色體上，編碼蛋白均被定位于細胞膜上；在目標LRR-RLKs中，只有編碼Solyc07g055810.3的氨基酸是堿性氨基酸；組織特異性表達分析發(fā)現(xiàn)，Solyc05g056370.3在栽培番茄Heinz1706根部較其他基因高水平表達，并且接種線蟲后，該基因在LA3858抗病材料根部響應(yīng)迅速，24 h內(nèi)積累水平明顯高于其他基因；同時，系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，Solyc05g056370.3所在分組大部分蛋白與油菜素類信號傳導(dǎo)、細胞死亡控制、發(fā)病機制等免疫防衛(wèi)進程相關(guān)；進一步VIGS功能驗證揭示，Solyc05g056370.3正向調(diào)控番茄對根結(jié)線蟲的抗性。綜上，Solyc05g056370.3參與番茄介導(dǎo)抗病并正反饋響應(yīng)防衛(wèi)進程，是很有價值的抗性改良資源，因此，該基因的深入挖掘?qū)罄m(xù)番茄抗根結(jié)線蟲病新材料的選育具有理論指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：LRR-RLK；番茄；抗??；根結(jié)線蟲；VIGS

中圖分類號：S436.412" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）04-0063-08

收稿日期：2023-05-28

基金項目：新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金青年基金（編號：2022D01B95）；2020年新疆維吾爾自治區(qū)“天池博士計劃”項目（編號：390000017）；新疆維吾爾自治區(qū)重點研發(fā)計劃子課題（編號：2022B02032-2）。

作者簡介：劉麗麗（1998—），女，河南周口人，碩士研究生，研究方向為番茄分子遺傳育種。E-mail：206346559@qq.com。

通信作者：杜 崇，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事番茄分子遺傳育種研究。E-mail：godv2018@163.com。

富亮氨酸重復(fù)類受體蛋白激酶（LRR-RLK）是植物中最大的一類跨膜類受體蛋白［1］，通過胞外信號分子與胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域特異結(jié)合，激活胞內(nèi)激酶域完成跨膜信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)［2-3］。LRR-RLKs胞外區(qū)的顯著特點是含有串聯(lián)排列的LRR結(jié)構(gòu)，參與蛋白質(zhì)間的相互作用［4］。隨著研究的深入，LRR-RLKs在作物抗病途徑中的功能也被相繼挖掘。

在番茄中單獨或共同沉默2個LRR-RLKs，基因SlSERK3A和SlSERK3B，導(dǎo)致植株對致病菌株P(guān)st DC3000的敏感性增強［5］；在馬鈴薯中沉默NbSerk3后植株表現(xiàn)出對晚疫病更強的敏感性，說明馬鈴薯對晚疫病的基礎(chǔ)抗性依賴該LRR-RLK的調(diào)控［6］；在水稻中超表達OsSERK1提高了對稻瘟病菌的抗性，該基因編碼的LRR-RLK可由水楊酸、茉莉酸和脫落酸誘導(dǎo)，從而正向調(diào)控水稻對真菌感染的防御反應(yīng)［7］；在小麥中沉默TaSERK1，發(fā)現(xiàn)該基因能正向調(diào)控對條紋銹病的抗性，同時該基因編碼的LRR-RLK蛋白可與TaDJA7相互作用并磷酸化，而沉默TaDJA7再次增強了小麥對條紋銹病的敏感性，表明TaSERK1-TaDJA7復(fù)合體共同正反饋調(diào)節(jié)小麥植株對條紋銹病的抗性水平［8］。

根結(jié)線蟲病是作物重大土傳病害之一［9］，其侵染通常導(dǎo)致植株根部出現(xiàn)根瘤［10］，降低植株對水分和養(yǎng)分的吸收，該病害一般可導(dǎo)致作物減產(chǎn)20%～30%，嚴重時可減產(chǎn)50%～70%，甚至絕收［11］。筆者前期選用抗根結(jié)線蟲病秘魯番茄材料LA3858（Mi-3/Mi-3），通過設(shè)置不同土溫（25 ℃和 34 ℃）形成抗感態(tài)，利用RNA-seq篩選差異表達基因，最終發(fā)現(xiàn)8個LRR-RLKs基因在植株根部差異表達顯著。本研究在此基礎(chǔ)上，對目標LRR-RLKs進行生物信息學(xué)分析，通過基因克隆結(jié)合功能驗證，鑒定出有價值的目標基因，旨在后期對其分子機制進行解析，以期為番茄優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的抗性改良提供夯實的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗于2023年3月在新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院蔬菜生物技術(shù)實驗室開展。供試材料是對根結(jié)線蟲表現(xiàn)出高抗的番茄材料LA3858（Mi-3/Mi-3）和Motelle（Mi-1/Mi-1），由番茄遺傳資源中心（TGRC）惠贈；南方根結(jié)線蟲由筆者所在團隊多年純化積累所得；pTRV1、pTRV2克隆質(zhì)粒由筆者所在實驗室自行克隆保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 根結(jié)線蟲的培養(yǎng)

將帶有根結(jié)的番茄病根用1%～3% NaClO洗滌2～3 min，隨后用蒸餾水流動洗滌15 min。從清洗后的根結(jié)表面挑取成熟的卵塊并置于含有適量蒸餾水的無菌培養(yǎng)皿中；每個培養(yǎng)皿中的卵塊數(shù)為100～150個。最后將卵塊密封于28 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。3 d后，提取線蟲懸液，計算濃度并接種［12］。

1.2.2 LRR-RLKs的無縫克隆

利用Trizol法提取材料根部RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以BamHⅠ為酶切位點設(shè)計各帶有15 bp重組同源臂的特異性上下游引物，對以上基因CDS區(qū)進行PCR擴增，運用無縫克隆構(gòu)建pTRV2-LRR-RLKs重組載體。質(zhì)粒構(gòu)建后，進行感受態(tài)大腸桿菌DH5ɑ轉(zhuǎn)化，挑取單克隆菌落在含有卡那霉素（Kan）的LB固體培養(yǎng)基上劃線并進行菌落PCR鑒定，篩選陽性克隆送到華大基因進行測序，隨后在NCBI中BLAST鑒定。

1.2.3 LRR-RLKs染色體定位及蛋白結(jié)構(gòu)分析

用軟件MapChart進行LRR-RLKs染色體定位并可視化；運用在線網(wǎng)站CELLO（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）進行亞細胞定位預(yù)測；利用在線分析軟件ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）對編碼LRR-RLKs的氨基酸進行理化性質(zhì)分析；利用Sopma（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和數(shù)據(jù)庫Swiss-Model進行蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.2.4 LRR-RLKs系統(tǒng)進化樹分析

從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）得到與LRR-RLKs同源的擬南芥和水稻氨基酸序列，運用MEGA 11軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)發(fā)育樹采用鄰接法（NJ）構(gòu)建，參數(shù)設(shè)置：自展值（bootstrap）設(shè)為500，遺傳距離計算模型選擇P-distance，partion deletion=50%，其余參數(shù)默認。

1.2.5 LRR-RLKs組織特異性表達分析及根部表達模式驗證

利用在線網(wǎng)站BAR（http：//bar.utoronto.ca/）收錄的番茄基因表達數(shù)據(jù)庫，對目標基因在番茄Heinz1706根、葉組織中的表達水平進行分析；選取4葉1心時期的LA3858番茄植株，室溫下接種南方根結(jié)線蟲，采集未接種和接種后12、24 h階段的根部，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，對目標LRR-RLKs設(shè)計RT-qPCR引物，采用ΔΔCT法進行根部表達模式鑒定［13］。

1.2.6 病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）植株的獲取與初步功能驗證

對質(zhì)粒pTRV2進行BamHⅠ位點單酶切，對目標LRR-RLKs的CDS編碼區(qū)設(shè)計帶有20 bp同源臂的特異性引物，進行PCR擴增，運用 “1.2.1”節(jié)中的方法構(gòu)建沉默表達載體。將制備好的農(nóng)桿菌侵染液（pTRV1、pTRV2-目標基因）進行葉片侵染，每個處理25株，待接種15～20 d，對目標基因表達量進行檢測，選取沉默效率在50%以上的番茄植株與CK（pTRV2空載）各10株進行根結(jié)線蟲接種，標準為 1 500頭 2齡幼蟲（J2）/株，并進行抗病性鑒定。

病情指數(shù)（DI）=∑（各病級×各級株數(shù)）/（最高病級×總調(diào)查株數(shù)）×100。對接種線蟲的番茄材料進行抗性級別的劃分，即免疫（I）：DI=0；高抗（HR）：0lt;DI≤20；中抗（MR）：20lt;DI≤40；抗?。≧）：40lt;DI≤60；感?。⊿）：60lt;DI≤80；高感（HS）：DIgt;80 ［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 LRR-RLKs基因的無縫克隆鑒定

依據(jù)前期RNA-seq數(shù)據(jù)基因表達水平差異（|log2FC|≥1）［15］，Solyc03g005960.3、Solyc02g072480.3、Solyc08g061560.3、Solyc01g107650.3、Solyc07g055810.3、Solyc05g056370.3、Solyc02g071800.3和Solyc05g014240.3共8個編碼LRR-RLKs的DEGs被篩選出來，成功無縫克隆后（圖1），進行測序比對。利用NCBI和SGN數(shù)據(jù)庫對序列進行注釋，明確了8個目標基因分別編碼At1g53420、At3g47570、ERECTA、At4g37250、At1g07650、At5g63710、At1g53430以及At1g67720。

2.2 LRR-RLKs基因的染色體定位

利用MapChart進行LRR-RLKs染色體定位分析， 結(jié)果（圖2）表明，" 8個LRR-RLKs分別分布在番茄的6條染色體上，其中Solyc02g071800.3和Solyc02g072480.3定位在2號染色體上；Solyc05g014240.3和Solyc05g056370.3定位在5號染色體上；Solyc01g107650.3、Solyc03g005960.3、Solyc07g055810.3以及Solyc08g061560.3分別定位在1號、3號、7號和8號染色體上；其余染色體未有

目標基因分布。

2.3 LRR-RLKs蛋白結(jié)構(gòu)分析

LRR-RLKs編碼氨基酸理化性質(zhì)分析結(jié)果（表1）表明，8個LRR-RLKs均定位于細胞膜，理論等電點顯示只有編碼Solyc07g055810.3的氨基酸是堿性氨基酸，其余7個LRR-RLKs均為酸性氨基酸；除了編碼Solyc05g056370.3的氨基酸為不穩(wěn)定氨基酸，其余LRR-RLKs穩(wěn)定性均lt;40%，為穩(wěn)定氨基酸；脂溶指數(shù)在80～110之間，除了編碼Solyc02g072480.3的氨基酸為疏水氨基酸，其余LRR-RLKs親水性指數(shù)均lt;0，屬于親水氨基酸。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，目標LRR-RLKs由α螺旋、β轉(zhuǎn)角、延伸主鏈和無規(guī)則卷曲4個部分組成，無其他亞結(jié)構(gòu)，且比例各不相同，目標LRR-RLKs中α螺旋和無規(guī)則卷曲所占組分最多，分別在27.65%～41.40%和39.12%～48.38%之間（圖 3-A），側(cè)面說明α螺旋和無規(guī)則卷曲是目標 LRR-RLKs二級結(jié)構(gòu)組成的主要形式，而β轉(zhuǎn)角和延伸主鏈可能起到修飾和輔助作用， 從而共同參與

后期蛋白復(fù)雜構(gòu)象的形成，發(fā)揮特異性功能［16］。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)建模結(jié)果（圖3-B）表明，目標 LRR-RLKs與模板的比對質(zhì)量均在0～4之間，全局得分的絕對值均在0～4之間，說明比對模板可信［17］；目標LRR-RLKs均不能形成同源二聚體，其中Solyc02g071800.3含有鎂離子配體，其余7個均沒有配體結(jié)合域；功能注釋表明，Solyc05g056370.3屬于油菜素類固醇相關(guān)受體激酶，廣泛參與植物抗病等各種生理過程［18］。

2.4 LRR-RLKs系統(tǒng)進化樹分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST鑒定，篩選并獲得與目標LRR-RLKs同源性較強的26個擬南芥LRR-RLKs，17個水稻LRR-RLKs，以及本研究中的8個LRR-RLKs，共51個LRR-RLKs蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果（圖4）顯示，這些 LRR-RLKs被分為5組（Ⅰ～Ⅴ），其中Ⅴ組成員最多，有17個，Solyc02g072480.3和Solyc08g061560.3被分到該組；Ⅰ和Ⅳ組成員最少，均有6個成員，其中Ⅰ組成員主要來自于擬南芥，而Solyc05g014240.3和Solyc01g107650.3分別分布在Ⅰ和Ⅳ組；Ⅲ組成員數(shù)量有13個，Solyc07g055810.3、Solyc03g005960.3和Solyc02g071800.3被分在該組，其中Solyc03g005960.3和Solyc02g071800.3同源性最高，推測它們的功能相近；Solyc05g056370.3被單獨分在Ⅱ組，與擬南芥中的Solyc05g056370.3的同源性最高，前期報道該蛋白可能參與油菜素類信號傳導(dǎo)、細胞死亡控制、發(fā)病機制等多種生理過程［19］。

2.5 LRR-RLKs組織特異性表達分析和根部響應(yīng)模式驗證

利用在線網(wǎng)站BAR收錄的番茄基因表達數(shù)據(jù)庫，對目標LRR-RLKs在番茄Heinz1706根、葉組織中的表達水平進行分析。結(jié)果（圖5-A）表明，Solyc03g005960.3和Solyc02g072480.3在根、葉組織的表達水平都很低甚至不表達；Solyc08g061560.3在葉片部位表現(xiàn)出特異性表達特征；除此之外，Solyc07g055810.3、Solyc05g056370.3、Solyc02g071800.3以及Solyc05g014240.3在根、葉均呈現(xiàn)較高的表達水平，尤其以Solyc05g056370.3在根中的表達水平最高，側(cè)面反映其很有可能在番茄植株的根部發(fā)揮功能［20］，這在線蟲侵染后根部表達模式上得到了證明。利用RT-qPCR對各LRR-RLKs在線蟲接種后不同階段進行表達水平測定。結(jié)果（圖5-B）發(fā)現(xiàn)，Solyc05g056370.3在接種線蟲后6 h迅速響應(yīng)，表達量上調(diào)至2.4倍，較大多數(shù)基因在12 h的積累水平要高，而待接種時間達到 24 h，Solyc05g056370.3的表達差異達到了最高的3.67倍。

2.6 Solyc05g056370.3在番茄防衛(wèi)根結(jié)線蟲病中的初步功能驗證

通過無縫克隆構(gòu)建pTRV2-Solyc05g056370.3重組載體，PCR鑒定陽性克?。▓D6-A），通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染Motelle（Mi-1/Mi-1）番茄抗病材料，獲取Solyc05g056370.3表達量下降50%以上的沉默植株（圖6-B），室溫下接種南方根結(jié)線蟲，鑒定其抗病性。結(jié)果（圖7）表明，Solyc05g056370.3沉默后，Mi-1番茄根部的根結(jié)數(shù)量相對于對照顯著增多，病情指數(shù)（DI）由3.4上升至46.3，最終植株抗性等級（RL）由高抗態(tài)（HR）轉(zhuǎn)變?yōu)榭共B(tài)（R），反映了沉默株系的易感能力增強，說明Solyc05g056370.3在番茄抗根結(jié)線蟲病過程中起到積極的正反饋調(diào)節(jié)作用。

3 討論與結(jié)論

LRR-RLKs在植物中的作用豐富多樣，本研究通過前期RNA-seq分析數(shù)據(jù)，獲得差異表達的目標LRR-RLKs基因，隨后進行生物信息學(xué)分析、基因表達模式驗證及VIGS鑒定，從而初步了解其生物學(xué)功能。

對8個LRR-RLKs編碼氨基酸進行理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，編碼Solyc02g072480.3的氨基酸為疏水氨基酸，編碼Solyc07g055810.3的是堿性氨基酸，而編碼Solyc05g056370.3的為不穩(wěn)定氨基酸，其余目標氨基酸均為親水性穩(wěn)定酸性氨基酸。RLKs是許多信號識別傳遞途徑中的關(guān)鍵組分［21］，作為識別信號的質(zhì)膜受體能夠感受外界刺激，通過磷酸化作用參與胞內(nèi)信號傳遞［22］，本研究中的LRR-RLKs均被定位在細胞膜上，作為膜受體蛋白發(fā)揮功能。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，目標LRR-RLKs的組分差異不明顯；三級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，Solyc05g056370.3蛋白屬于油菜素類固醇相關(guān)受體激酶，而這類激酶廣泛參與植物抗逆、抗病等進程［18］。

組織表達模式分析發(fā)現(xiàn)，目標LRR-RLKs基因在栽培番茄植株的根、葉中均有不同程度的表達，其中Solyc05g056370.3在根和葉中呈現(xiàn)較高的表達水平，尤其在根中較其他基因表達量高，表明該基因很可能在上述組織中行使重要的生物學(xué)功能［11］。

接種線蟲后，根部表達模式驗證進一步說明，Solyc05g056370.3在線蟲入侵時響應(yīng)迅速，在24 h的積累水平高于其他基因，說明Solyc05g056370.3可能積極參與番茄對根結(jié)線蟲的防衛(wèi)；進化樹分類把Solyc05g056370.3分在第Ⅱ組，該組成員大多參與植物的抗病調(diào)節(jié)過程。其中目標Solyc05g056370.3與擬南芥中的Solyc05g056370.3同源性最高，除此之外，擬南芥中的At5g10290、At5g65240、水稻中的SERK2-like和BAK1也和目標Solyc05g056370.3具有較好的同源關(guān)系。前人研究表明，擬南芥Solyc05g056370.3、At5g10290和At5g65240分別編碼SARK、SERK1-5和NIK1-2蛋白［23］，其中，SARK在控制細胞死亡、發(fā)病機制和花粉發(fā)育等多種生理過程中發(fā)揮相關(guān)功能［24］，而SERK1-5在擬南芥中參與油菜素類信號傳導(dǎo)［25］；NIK1在擬南芥抵抗病毒和細菌病原體方面發(fā)揮作用［19］；SERK2-like沉默的水稻植株表現(xiàn)出形態(tài)改變以及對油菜素內(nèi)酯的敏感性降低，進一步發(fā)現(xiàn)SERK2通過XA21、XA3和FLS2（免疫受體）的介導(dǎo)，正向調(diào)控水稻免疫反應(yīng)［26］；而水稻BAK1蛋白可通過與NADPH氧化酶RbohD直接互作促進活性氧（ROS）的產(chǎn)生［27］，同時BAK1也可被flg22激活后磷酸化，并激活2個Ca+2通道蛋白進而促進ROS的積累［28］，ROS是植物最早的免疫反應(yīng)標志之一，適量的ROS水平有助于植物產(chǎn)生超敏反應(yīng)（HR）抵御病原菌的侵染［29-30］。因此，筆者推測番茄中的Solyc05g056370.3基因所編碼的LRR-RLK可能在抵御生物脅迫方面同樣發(fā)揮作用，可能介導(dǎo)多樣的信號傳導(dǎo)途徑參與番茄防衛(wèi)根結(jié)線蟲的入侵。為了確定其反饋調(diào)節(jié)方式，利用VIGS發(fā)現(xiàn)Solyc05g056370.3沉默的植株根部對線蟲的敏感性增強，根結(jié)數(shù)量增加，植株整體抗病水平由高抗態(tài)（HR）轉(zhuǎn)變?yōu)榭共B(tài)（R），證明了Solyc05g056370.3正向參與番茄對于根結(jié)線蟲病的抵抗。

本研究通過對篩選出的8個LRR-RLKs進行生物信息學(xué)分析，并結(jié)合組織特異性表達分析和根部響應(yīng)模式驗證發(fā)現(xiàn)，Solyc05g056370.3很可能參與番茄抗根結(jié)線蟲病的進程；VIGS功能驗證進一步說明，該基因編碼的LRR-RLK蛋白正反饋調(diào)節(jié)植株的抗性。因此，Solyc05g056370.3功能的深入挖掘及分子機制的探究為番茄抗病種質(zhì)的創(chuàng)制具有較好的應(yīng)用價值。

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