指向科學(xué)思維培養(yǎng)的PCR相關(guān)例題淺析

摘要：本文以人教版普通高中教科書《生物學(xué)·選擇性必修3·生物技術(shù)與工程》第3章“基因工程”中基礎(chǔ)PCR技術(shù)相關(guān)例題為例，淺析如何在習(xí)題中啟發(fā)學(xué)生畫圖歸納，激發(fā)批判性思維，巧設(shè)問題活躍創(chuàng)造性思維，促進(jìn)學(xué)生生物學(xué)科核心素養(yǎng)中科學(xué)思維的培養(yǎng)。

關(guān)鍵詞：基因工程；PCR;科學(xué)思維

文章編號：1003-7586（2024）04-0067-04 中圖分類號：G633.91 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

隨著DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型在20世紀(jì)50年代問世，生物學(xué)的新寵兒——分子生物學(xué)誕生，世界各地的科研人員僅在20年后便催生了一項(xiàng)改變?nèi)祟惿鐣?huì)生活的，嶄新的生物技術(shù)工程——基因工程。基因工程自誕生以來，發(fā)展勢頭迅猛，不管是在農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)還是醫(yī)藥衛(wèi)生方面，都極大地改善著人們的生產(chǎn)生活?；蚬こ淌侨私贪嫫胀ǜ咧薪炭茣渡飳W(xué)·選擇性必修3·生物技術(shù)與工程》（以下簡稱“教材”）第3章的內(nèi)容，學(xué)生因其微觀抽象、遠(yuǎn)離生活、衍生技術(shù)頻出而感到困難。伴隨著新課程標(biāo)準(zhǔn)的推行，各地新高考方案的落地，越來越多的一線教師想盡辦法改變傳統(tǒng)教學(xué)模式，不斷地優(yōu)化課堂教學(xué)設(shè)計(jì)，更加關(guān)注學(xué)生的學(xué)科核心素養(yǎng)的養(yǎng)成。筆者就基因工程中基礎(chǔ)的PCR技術(shù)相關(guān)例題，淺析如何在習(xí)題中啟發(fā)學(xué)生畫圖歸納，適當(dāng)延展知識激發(fā)批判性思維，巧設(shè)問題活躍創(chuàng)造性思維，促進(jìn)學(xué)生生物學(xué)科核心素養(yǎng)中科學(xué)思維的培養(yǎng)。

1 構(gòu)建圖像模型，解決特殊引物擴(kuò)增問題

例1 用PCR技術(shù)將DNA分子中的A1片段進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)計(jì)了引物工、Ⅱ，其連接部位如圖所示，X為某限制酶識別序列。擴(kuò)增后得到的絕大部分DNA片段是圖中的（ ）。

對于PCR產(chǎn)物分析類題目，學(xué)生很難在短時(shí)間內(nèi)完成特殊引物擴(kuò)增多輪的產(chǎn)物分析。筆者認(rèn)為解決這類問題的方法之一是啟發(fā)學(xué)生畫圖，用簡單的圖像模型來模擬PCR反應(yīng)，并從中尋找答案。

教師可在課堂展示PCR第一輪、第二輪的擴(kuò)增過程，用紅色粉筆描紅添加在引物Ⅱ5＇端的限制酶識別序列，之后引導(dǎo)學(xué)生畫出第三輪的擴(kuò)增產(chǎn)物，并對該輪產(chǎn)物進(jìn)行分析（見圖1）。第三輪擴(kuò)增產(chǎn)生的8個(gè)DNA分子中，有4個(gè)DNA分子帶有限制酶的識別序列，有11條DNA單鏈帶有片段X。以此類推，隨著擴(kuò)增次數(shù)的增加，擴(kuò)增后得到的絕大部分DNA片段是圖中的D項(xiàng)。

教師可繼續(xù)提問：在引物末端添加限制酶識別序列的目的是什么？學(xué)生在課堂學(xué)習(xí)PCR技術(shù)擴(kuò)增目的條帶后，進(jìn)行操作設(shè)想的時(shí)候會(huì)產(chǎn)生疑惑，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得的目的基因，要和質(zhì)粒載體進(jìn)行拼接，目的基因兩端并沒有限制酶的識別序列，沒有辦法與被酶切后的載體相連。這道題目實(shí)際上在解答學(xué)生的疑惑。

關(guān)于巧設(shè)引物編出的新題在近幾年的模考中頻繁出現(xiàn)。“基因定點(diǎn)誘變技術(shù)”是實(shí)現(xiàn)第二代基因工程——蛋白質(zhì)工程的方法之一，在教材第94頁“學(xué)科交叉”部分有所提及，而基因定點(diǎn)誘變技術(shù)的核心就在于引物的設(shè)計(jì)。

例2 通過設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用PCR技術(shù)可實(shí)現(xiàn)目的基因的定點(diǎn)誘變。如圖為基因工程中獲取突變基因的過程，其中引物工序列中含有一個(gè)堿基T不能與目的基因片段配對，但不影響引物與模板鏈的整體配對，反應(yīng)體系中引物Ⅰ和引物Ⅱ的5＇端分別設(shè)計(jì)增加限制酶a和限制酶b的識別位點(diǎn)。有關(guān)敘述正確的是（ ）。

A．在PCR反應(yīng)體系中還需要加入4種游離核苷酸、解旋酶、Taq酶等

B．第二輪PCR，引物Ⅰ能與圖中②結(jié)合并且形成兩條鏈等長的突變基因

C．引物中設(shè)計(jì)兩種限制酶識別位點(diǎn)有利于目的基因定向插入運(yùn)載體

D．第三輪PCR結(jié)束后，含突變堿基對且兩條鏈等長的DNA占1/2

筆者針對D選項(xiàng)中的三輪擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果進(jìn)行分析，采用畫圖方式解決。教師在黑板上展示第一輪擴(kuò)增后的產(chǎn)物，并啟發(fā)學(xué)生沿著思路畫出第二輪的擴(kuò)增產(chǎn)物。在確認(rèn)第二輪4個(gè)DNA分子的準(zhǔn)確性后，教師啟發(fā)學(xué)生思考：第二輪產(chǎn)物中哪些DNA單

鏈作模板，在第三輪中才能擴(kuò)增出等長的DNA分子？

學(xué)生會(huì)找到第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物中最長的兩條DNA單鏈并用★標(biāo)注（見圖2），緊接著教師請學(xué)生畫出分別以這兩條單鏈為模板的第三輪產(chǎn)物。很顯然，結(jié)果是這兩個(gè)DNA分子都符合D項(xiàng)中的含突變堿基對且兩條鏈等長，占第三輪DNA產(chǎn)物總量的1/4。

2 延展膠回收知識，激發(fā)學(xué)生批判性思維

例3 在基因工程中利用下圖中的某目的基因和P1噬菌體載體構(gòu)建章組DNA。限制性內(nèi)切核酸酶BglⅡ、EcoRⅠ和Sau 3AⅠ的酶切位點(diǎn)分別如圖所示。下列分析錯(cuò)誤的是（ ）。

A．構(gòu)建重組DNA時(shí)，可用BglⅡ和Sau 3AⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體

B．構(gòu)建重組DNA時(shí)，可用Eco RⅠ和Sau 3AⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體

C．圖乙中的P1噬菌體載體只用EcoRⅠ切割后，含有2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)

D．用Eco RI切割目的基因所在片段和P1噬菌體栽體，再用DNA連接酶連接，只能產(chǎn)生一種重組DNA

B選項(xiàng)是易錯(cuò)選項(xiàng)，從學(xué)生的課堂解答中會(huì)發(fā)現(xiàn)學(xué)生的共性錯(cuò)誤：構(gòu)建重組DNA時(shí)，用Eco RⅠ和Sau 3AⅠ切割目的基因所在片段，其中有兩個(gè)不同的片段符合重連的要求，即圖3所示的片段①和片段②。學(xué)生依據(jù)已有知識進(jìn)行分析，只要是與酶切后的載體粘性末端相同的DNA片段，都可以在DNA連接酶的作用下與切開的載體完成重組連接。當(dāng)課堂認(rèn)知出現(xiàn)瓶頸的時(shí)候，老師可以適當(dāng)?shù)匮诱筆CR及電泳的后續(xù)操作——膠回收。

當(dāng)瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物準(zhǔn)確無誤之后，就要進(jìn)行膠回收來實(shí)現(xiàn)目的DNA分子的大量收集。一般利用從生物試劑公司購買的柱式DNA膠回收試劑盒。瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用DNA凝膠回收試劑盒回收純化的PCR產(chǎn)物，試劑盒中有一個(gè)特制的管，將膠填充到其中，利用膠在高鹽低pH下吸附DNA，在低鹽和高pH條件下DNA可再被洗脫的原理，進(jìn)行DNA的回收和純化。整個(gè)過程僅需30分鐘，便可完成DNA片段的純化工作。酶切后的DNA分子可用此方法完成目的基因、質(zhì)粒等片段的選擇性回收。這也就解答了學(xué)生心中的疑惑，片段①才是實(shí)驗(yàn)中膠回收的片段，而依據(jù)電泳圖中分子量的大小，片段②會(huì)在電泳后被舍棄。

高中教材關(guān)于基因工程的編寫是貼近高中生認(rèn)知水平的，而真實(shí)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作遠(yuǎn)比書上復(fù)雜得多。膠回收這一步驟的缺失，是學(xué)生解決酶切連接問題的瓶頸。因此適當(dāng)?shù)匮诱鼓z回收的知識，可以激發(fā)學(xué)生的批判性思維，使學(xué)生理性、全面地看待書本上的技術(shù)手段，有質(zhì)疑，有困惑，認(rèn)知才會(huì)有新的發(fā)展。

3 問題啟發(fā)式介紹衍生PCR技術(shù)，活躍學(xué)生創(chuàng)造性思維

例4 如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如圖所示（以Eco RⅠ酶切為例）。

（3）若下表所列為已知的DNA序列和設(shè)計(jì)的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是____（從引物①②③④中選擇，填編號）。

本題的情境很簡單，當(dāng)DNA的某些序列已知，而需要擴(kuò)增已知序列兩端的未知序列時(shí)，可采用特殊PCR技術(shù)，即分子實(shí)驗(yàn)中的反向PCR技術(shù)。在第（3）問的引物選擇上，許多學(xué)生會(huì)依據(jù)書本上擴(kuò)增目的基因的思路，錯(cuò)選引物①、③。

一線教師應(yīng)該想辦法拉近衍生PCR技術(shù)和課本PCR技術(shù)的距離，可以以設(shè)問的形式將問題拋給學(xué)生，活躍學(xué)生的創(chuàng)造性思維。以本題的第（3）問為例，教師可以拋出以下問題：為何選擇Eco RⅠ對DNA片段進(jìn)行單酶切？能否采用多酶切？DNA連接酶連接成環(huán)的目的是什么？以環(huán)為模板，擴(kuò)增后的產(chǎn)物是環(huán)狀還是鏈狀？若想擴(kuò)增環(huán)狀DNA中的已知序列，應(yīng)該選取哪對引物？若想擴(kuò)增兩側(cè)的未知序列呢？

學(xué)生掌握了基因工程的操作步驟后，會(huì)明白DNA分子量較大，需要酶切成小片段，單酶切的優(yōu)勢是產(chǎn)生相同的黏性末端，便于將分離得到的F片段連接成環(huán)。學(xué)生已經(jīng)熟知PCR的相關(guān)原理，知道以鏈狀F片段作模板，無法從中間已知序列擴(kuò)增出兩端未知序列，成環(huán)后則可以實(shí)現(xiàn)未知序列的擴(kuò)增。教師繼續(xù)引導(dǎo)學(xué)生理解若以環(huán)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，那么由于Taq酶只能將單個(gè)脫氧核糖核苷酸連接到引物之后，且PCR反應(yīng)體系中沒有DNA連接酶，所以以環(huán)為模板擴(kuò)增后的產(chǎn)物是鏈狀的。

學(xué)生結(jié)合學(xué)過的PCR引物知識，會(huì)快速反應(yīng)出擴(kuò)增環(huán)狀DNA中的已知序列，選取的是引物①、③，而本題的核心問題是想擴(kuò)增已知序列兩側(cè)的未知序列，那么在連接成環(huán)的情況下，引物應(yīng)選?、凇ⅱ?。

例5 重疊延伸PCR技術(shù)是采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，獲得想要的目的基因。某科研團(tuán)隊(duì)運(yùn)用重疊延伸PCR技術(shù)在水蛭素基因的特定位點(diǎn)引入特定突變，以實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)突變，原理如圖所示。

下列說法錯(cuò)誤的是（ ）。

A.過程②需要含Mg2＋的緩沖液、DNA模板、引物、4種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶等

B．若引物工、引物Ⅱ組成的反應(yīng)系統(tǒng)和引物Ⅲ、引物Ⅳ組成的反應(yīng)系統(tǒng)中均進(jìn)行一次DNA分子的復(fù)制后，一共會(huì)產(chǎn)生2種DNA分子

C．經(jīng)過程④獲得的雜交DNA有2種，其中只有一種可以經(jīng)過程⑤獲得目的基因

D．過程⑤使用耐高溫的DNA聚合酶延伸，不需要引物

重疊延伸PCR技術(shù)在題目的圖文中介紹得很全面，但學(xué)生初見此特殊PCR技術(shù)難免產(chǎn)生畏難情緒，一線教師可以借助階梯式的問題，啟發(fā)學(xué)生，讓學(xué)生在問題解答過程中增強(qiáng)學(xué)習(xí)的自信心。例如，針對本題，教師可設(shè)置問題串：過程①需要在兩個(gè)PCR體系中完成，這兩個(gè)體系中添加的成分有哪些？主要成分差異是什么？過程④獲得的雜交DNA有幾種？新合成子鏈的延伸方向如何？過程④獲得的雜交DNA都可以在耐高溫的DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸嗎？耐高溫的DNA聚合酶的作用特點(diǎn)是什么？過程⑤是否還需添加引物？

學(xué)生在問題串的引導(dǎo)下，從簡單的問題人手，逐步厘清重疊延伸PCR技術(shù)的原理和要點(diǎn)，并在問題解決過程中體悟書本中PCR技術(shù)基礎(chǔ)知識的奠基意義，更深切地感受分子生物學(xué)的蓬勃發(fā)展。

4 教學(xué)反思

學(xué)生生物學(xué)科核心素養(yǎng)的養(yǎng)成不是一朝一夕可實(shí)現(xiàn)的，需要一線教師仔細(xì)研讀課程標(biāo)準(zhǔn)，在教學(xué)實(shí)踐中滲透學(xué)科核心素養(yǎng)。基因工程是抽象難懂的微觀技術(shù)，頻出的衍生技術(shù)更是令學(xué)生望而卻步，身為教師應(yīng)盡己所能，注重習(xí)題評講的教學(xué)設(shè)計(jì)與教學(xué)方法，在平常的習(xí)題中挖掘滲透核心素養(yǎng)切入點(diǎn)。