鰳魚全基因組survey分析及微衛(wèi)星位點分布

摘" 要：為研究鰳魚（Ilisha elongata）的遺傳演化概況，對鰳魚基因組進(jìn)行了高通量測序并開展了survey分析和基因組范圍內(nèi)的遺傳標(biāo)記開發(fā)。K-mer分析結(jié)果顯示，鰳魚基因組大小約為692.8 Mb，雜合率為0.18%，重復(fù)序列比例為39.6%?；蚪M初步組裝Scaffold N50為27 694 bp，Contig N50為6 306 bp。利用MISA軟件對鰳魚基因組的微衛(wèi)星標(biāo)記（simple sequence repeat，SSR）進(jìn)行檢索和分析，總共檢測到786 123個SSR位點，相對豐度為1 204個/Mb。在所有類型中，重復(fù)最多的是二堿基，占SSR總量的75.94%，其SSR重復(fù)頻率主要集中在6～28次；其次為單堿基和四堿基，分別占SSR總量的15.31%和4.25%。對二堿基類型而言，AC型具有最多的重復(fù)數(shù)量，為131 732個，單堿基重復(fù)數(shù)量最多的則是A型，有48 775個。研究結(jié)果表明，鰳魚基因組經(jīng)組裝后可得到高質(zhì)量的全基因組序列，經(jīng)過篩選的SSR位點可為后續(xù)的遺傳分子標(biāo)記開發(fā)提供有力支持，研究結(jié)果可為鰳魚種質(zhì)資源管理和保護(hù)、生物進(jìn)化和群體遺傳等研究工作提供基礎(chǔ)資料。

關(guān)鍵詞：鰳魚；全基因組survey；微衛(wèi)星標(biāo)記；高通量測序；生物遺傳

doi：10.16446/j.fsti.20230700110

收稿日期：2023-07-10

作者簡介：高魯修（1998—），男，碩士研究生，研究方向為分子生態(tài)學(xué)。E-mail：736857968@qq.com

通信作者：劉炳艦（1984—），男，副教授，研究方向為海洋生物學(xué)分子生態(tài)學(xué)。E-mail：liubingjian@zjou.edu.cn

項目資助：國家自然科學(xué)基金項目（41806156）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（202110340031）；浙江省自然科學(xué)基金項目" （LY22D060001amp;LY20C190008）；舟山市科技項目（2020C21016）。

目前，人類已進(jìn)入了組學(xué)時代并見證了空前規(guī)模的遺傳信息積累。為深入了解和研究遺傳信息，研究人員采用了多種先進(jìn)的科學(xué)技術(shù)，其中高通量測序技術(shù)［1］（high-throughput sequencing）因其準(zhǔn)確度高、運(yùn)行成本低等特點而成為目前主流的測序技術(shù)之一，為大規(guī)模的組學(xué)研究提供了技術(shù)支持，并被稱作“下一代”測序技術(shù)（“next-generation” sequencing technology，NGS）。根據(jù)NCBI（national center for biotechnology information）數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome）和IGSR（the international genome sample resource）數(shù)據(jù)庫（https：//www.internationalgenome.org）中的數(shù)據(jù)顯示，截至目前，全球約有100 000種生物進(jìn)行了基因組測序，其中魚類有1 200多種?；贜GS的基因組survey分析，是指利用小片段文庫的低深度測序數(shù)據(jù)（50～100X），運(yùn)用K-mer分析方法對基因組展開研究，包括評估基因組大小、雜合度、GC堿基含量等?；蚪Msurvey分析是了解某一生物遺傳特性的有效方法，相關(guān)結(jié)果可為后續(xù)的建庫及高質(zhì)量基因組組裝策略的制定提供資料，并對全基因組微衛(wèi)星標(biāo)記（simple sequence repeats，SSR）的開發(fā)發(fā)揮重要作用。研究表明，SSR均勻分布在真核生物基因組中，目前已被應(yīng)用于種群遺傳多樣性、親緣關(guān)系識別、構(gòu)建遺傳圖譜等研究領(lǐng)域［2-4］。相對于常規(guī)的SSR開發(fā)流程，高通量測序數(shù)據(jù)下的SSR開發(fā)工作具備低成本、高效率、高生產(chǎn)率的優(yōu)勢。趙蕊蕊等［5］對絨杜父魚（Hemitripterus villosus）全基因組進(jìn)行了分析，獲得約710 Mb的基因組序列，其雜合度和重復(fù)序列占比分別為38.61%和0.26%，鑒定獲得SSR位點583 498個，為絨杜父魚進(jìn)化生物學(xué)和遺傳學(xué)等研究提供了基礎(chǔ)資料。Kim等［6］對南極冰魚（Chionobathysscus dewitti）基因組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了評估，得出南極冰魚基因組大小為880 Mb，其誤差率、雜合度和重復(fù)率依次為0.317%、0.421%和0.738%，同時從組裝數(shù)據(jù)中鑒定出2 252 265個SSR位點，其中二堿基重復(fù)序列比例最高。Xu等［7］對褐菖鲉（Sebastiscus marmoratus）的全基因組進(jìn)行了分析，獲得800 Mb左右的基因組序列，其中重復(fù)序列為39.65%，雜合度為0.17%，并通過全基因組數(shù)據(jù)開發(fā)出191 592個SSR位點，為其他相關(guān)研究提供了參考。Li等［8］的研究顯示，羅布麻（Apocynum venetum）基因組大小為254.40 Mb，重復(fù)序列占比為40.87%，雜合度約為0.63%，同時挖掘出101 918個SSR位點，為今后羅布麻遺傳信息識別以及分析棉麻纖維合成的關(guān)鍵基因等工作提供了基礎(chǔ)資料。

鰳魚（Ilisha elongata）又稱白鰳魚，隸屬于鯡形目（Clupeiformes）、鋸腹鰳科（Pristigasteridae），主要分布于太平洋西部、爪哇海海域［9］，在中國南海、東海、黃海以及渤海均有分布［10］，為亞熱帶及暖溫帶近海洄游性中上層魚類，主要以蝦類、魚類和毛顎類等為食，是我國沿海重要的經(jīng)濟(jì)魚類［11］。鰳魚肉質(zhì)鮮美，富含蛋白質(zhì)、脂肪及鈣等營養(yǎng)物質(zhì)，是我國漁業(yè)史上最早的捕撈對象之一，距今已有5 000多年的歷史［12］。近年來，由于過度捕撈以及海洋生態(tài)環(huán)境惡化［13］等因素，鰳魚資源量急劇下降，因此亟需開展鰳魚種質(zhì)資源調(diào)查和保護(hù)工作。目前，有關(guān)鰳魚的研究工作主要集中在食品加工［14-19］和形態(tài)特征［20-23］等方面，有關(guān)遺傳分析方面的研究［24-26］相對較少，限制了鰳魚生物進(jìn)化、遺傳多樣性研究和種質(zhì)資源保護(hù)等工作的開展。本研究對鰳魚進(jìn)行高通量測序，展開全基因組的survey分析和識別SSR，對鰳魚基因組大小、雜合度、GC含量等進(jìn)行有效評估，以期為后續(xù)鰳魚資源管理和保護(hù)、生物進(jìn)化和遺傳多樣性研究方法的選用提供基本資料。

1" 材料和方法

1.1" 樣本采集與測序

本研究鰳魚樣品于2023年2月采自浙江舟山近海水域。經(jīng)形態(tài)學(xué)特征［27］進(jìn)行物種鑒定后，剪取適量樣品肌肉組織裝入含有95％（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液的凍存管中固定，然后于-80 ℃冰箱中保存待用。

采用常規(guī)方法（苯酚-氯仿法）提取鰳魚基因組DNA，并委托北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行高通量測序文庫構(gòu)建和測序，原始數(shù)據(jù)（raw data）經(jīng)質(zhì)控和過濾后，所獲得的有效數(shù)據(jù)（clean data）可用于后續(xù)的相關(guān)分析。將原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，注冊登錄號為PRJNA967191。

1.2" 全基因組數(shù)據(jù)處理

測序后得到的鰳魚有效數(shù)據(jù)通過GCE 1.0.2軟件的K-mer分析工具來評估其基因組的大小、雜合度、GC含量等基本特征信息［28］。利用SOAPdenovo 2.0軟件進(jìn)行基因組初步組裝［29］，并計算Contig和Scaffold（K=47）大小?；蚪M組裝完畢后，使用MISA腳本的默認(rèn)參數(shù)值（即單堿基至六堿基的最小重復(fù)序列次數(shù)分別為10、6、5、5、5和5）對序列中的SSR位點進(jìn)行篩選。利用Primer 3軟件進(jìn)行SSR引物批量設(shè)計［30］，引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司制備。經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增后，采用瓊脂糖凝膠電泳分析法對引物和SSR的有效性進(jìn)行檢驗。

2" 結(jié)果

2.1" 數(shù)據(jù)量統(tǒng)計與K-mer分析

利用Illumina NovaSeq 6000平臺測序，經(jīng)質(zhì)控和過濾后得到有效數(shù)據(jù)為155.80 Gb，其中GC含量為42.92%，錯誤率為0.02%，Q20為99.57%，Q30為97.39%，測序質(zhì)量符合后續(xù)分析要求（見表1）。通過與NCBI數(shù)據(jù)庫中相關(guān)物種［太平洋鰳（Ilisha furthii）、縱帶鰳（Ilisha striatula）、西非鰳（Ilisha africana）等］序列進(jìn)行BLASTn分析，比對結(jié)果無異常，表明測序數(shù)據(jù)不存在污染情況。使用K-mer分析評估有效數(shù)據(jù)，設(shè)定K-mer值為18，基因組的預(yù)估結(jié)果為：鰳魚基因組大小約為692.8 Mb，重復(fù)序列占比39.6%，雜合率0.18%，可對其展開進(jìn)一步研究和分析，包括基因組裝和SSR篩選等工作。

2.2" 基因組初步組裝

鰳魚全基因組初步組裝結(jié)果見表2。利用KmerGenie軟件進(jìn)行有效數(shù)據(jù)分析［31］，得出最佳基因組組裝值K=47。通過SOAPdenovo軟件初步組裝鰳魚全基因組，最終獲得基因組大小約為556 914 471 bp。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，Scaffold N50長度為27 694 bp，Contig N50長度為6 306 bp。Scaffolds最長序列為47 402 bp，有110 255個序列不小于2 000 bp，有536 946個序列不小于100 bp，表明鰳魚全基因組初步組裝結(jié)果較好。

2.3" 微衛(wèi)星位點篩選

基因組初步組裝完成后，通過MISA軟件挖掘SSR位點，在全部Scaffolds中篩選獲得SSR位點786 123個，相對豐度為1 204個/Mb。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，在不同的堿基類型中，二堿基重復(fù)類型最多（596 970個），約占SSR總量的75.94%，六堿基重復(fù)最少（880個），約占SSR總量的0.11%。這與趙蕊蕊等［5］、Tóth等［32］、王耀嶸等［33］的研究結(jié)果類似，即在堿基類型所占比例中，二堿基占比最高，六堿基占比最低。其余的堿基類型占比依次是單堿基（120 368個，15.31%），四堿基（33 347個，4.25%），三堿基（28 249個，3.59%）和五堿基（6 309個，0.80%）。對SSR位點進(jìn)行分析，其重復(fù)范圍在5～103次，主要集中次數(shù)為6～28次。對單堿基而言，重復(fù)次數(shù)大多集中于10～28次，約占單堿基SSR總量的99.30%。二、三堿基重復(fù)主要集中在6～28次和5～15次，約占其SSR總量的99.58%和99.63%。四堿基、五堿基和六堿基的重復(fù)次數(shù)則分別集中于5～11次、5～9次和5～7次，約各占SSR總量的98.72%、99.06%和97.84%（見圖1）。

鰳魚全基因組SSR重復(fù)次數(shù)分布情況見圖2。在單堿基重復(fù)類型中，A/T類型與C/G類型相比重復(fù)單元較高，為93 801個，約占單堿基SSR總量的77.93%，C/G類型為26 567個，約占單堿基SSR總量的22.07%。二堿基重復(fù)類型中，以AC/GT型重復(fù)單元最多，為449 474個，約占二堿基SSR總量的75.29%，占比第二的是AG/CT型，為136 861個，約占22.93%，其余依次是AT/AT型（10 123個，1.70%）、CG/CG型（512個，0.09%）。

三堿基結(jié)果顯示（見圖3），AAT/ATT型重復(fù)單元最多，為10 347個，約占三堿基SSR總量的36.63%，重復(fù)單元最少的是ATC/ATG型，為2 629個，約占其總量的9.31%，其次是AGG/CCT型（4 261個，15.08%）、AAC/GTT型（2 685個，9.51%）。對四堿基重復(fù)而言，以AGAT/ATCT型重復(fù)單元最多，為7 756個，約占四堿基SSR總量的23.26%，其余依次是ACAG/CTGT型（4 863個，14.58%）、AAAG/CTTT型（4 276個，12.82%）、ACTC/AGTG型（2 853個，8.56%）。五堿基和六堿基中，重復(fù)單元最多的是AGAGG/CCTCT型（1 491個，23.63%）和ACACGC/CGTGTG型（86個，9.77%）（見圖4）。

通過PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測法對隨機(jī)選取的15個SSR位點進(jìn)行有效性驗證，結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增成功率在95%以上，滿足后續(xù)的研究工作要求。

3" 討論

3.1" 鰳魚全基因組的基本特征

NGS的發(fā)展為基因組和轉(zhuǎn)錄組研究提供了一種相對經(jīng)濟(jì)的方法。本研究通過survey分析對鰳魚全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行評估，開發(fā)出了豐富的SSR標(biāo)記，研究結(jié)果可為后續(xù)鰳魚漁業(yè)資源管理保護(hù)和生物遺傳等研究工作提供基礎(chǔ)資料。

K-mer分析顯示，鰳魚的基因組大小約為692.8 Mb，小于南極冰魚［6］（880 Mb）、斑魚祭（Setipinna tenuifilis）［34］（797 Mb）、黃鯽（Setipinna tenuifilis）［35］（815 Mb）和大西洋鯡（Clupea harengus）［36］（850 Mb），與歐洲沙丁魚（Sardina pilchardus）［37］

（625～637 Mb）、卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）［38］（642.68 Mb）相似?；蚪M大小的不同是由物種間的差異性造成的，并且可能與物種的基因組重復(fù)比例相關(guān)。鰳魚基因組的重復(fù)序列比例為39.6%，處于中低水平，高于絨杜父魚［5］（38.61%）和卵形鯧鲹［38］（30.19%），與褐菖鲉［7］（39.65%）、斑魚祭［34］（39.22%）和黃鯽［35］（39.69%）相似，但低于條紋斑竹鯊（Chiloscyllium plagiosum）［39］（63.53%）。此外，鰳魚測序數(shù)據(jù)的雜合率為0.18%，GC含量為42.92%，低于絨杜父魚［5］（0.26%，43.13%）和南極冰魚［6］（0.412%，49.9%），但與褐菖鲉［7］（0.17%，41.3%）和斑尾刺蝦虎魚（Acanthogobius ommaturus）［40］（0.17%，40.88%）相當(dāng)。根據(jù)基因組大小、重復(fù)序列比、雜合度等survey分析指標(biāo)判斷，鰳魚的基因組應(yīng)屬于簡單型。這一結(jié)果可為后續(xù)鰳魚的高質(zhì)量基因組組裝工作提供參考。

本研究初步組裝結(jié)果顯示，Scaffold N50大小為27 694 bp，Contig N50大小為6 306 bp。組裝后的Scaffold大小為556 914 471 bp，數(shù)目為536 946條，平均長度為1 038 bp。其長度與絨杜父魚［5］（577 386 707 bp）相當(dāng)，但低于南極冰魚［6］（897 784 561 bp）、褐菖鲉［7］（609 456 819 bp）、斑魚祭［34］（800 444 663 bp）和黃鯽［35］（798 382 266 bp）等?？紤]到組裝的N50和N90長度較短，可能會導(dǎo)致鰳魚基因組初步組裝質(zhì)量、連續(xù)性和完整性較低，不能滿足其生物進(jìn)化相關(guān)的研究工作，建議通過多種技術(shù)相結(jié)合的方法（例如Illumina測序與PacBio和Hi-C相結(jié)合）來進(jìn)行基因組序列的構(gòu)建。盡管如此，本次組裝得到的序列仍然可以用于后續(xù)SSR位點、SNP位點開發(fā)以及鰳魚群體基因組學(xué)等研究。

3.2" 鰳魚全基因組SSR分布特征

重復(fù)序列比例（鰳魚為39.6%）通常被認(rèn)為與基因組所含的SSR數(shù)量成正比，本試驗從組裝好的鰳魚Scaffolds中共篩選出786 123個SSR位點，與其他物種［5-8，33-35，38-41］相比處于中等水平。其中，重復(fù)最少的是六堿基，僅為SSR總量的0.11%（880個），二堿基則重復(fù)最高，為596 970個，約占SSR總量的75.94%。這與其他海洋魚類，如絨杜父魚［5］、南極冰魚［6］、褐菖鲉［7］、金錢魚（Scatophagus argus）［33］、斑魚祭［34］、黃鯽［35］、卵形鯧鲹［38］、條紋斑竹鯊［39］、斑尾刺蝦虎魚［40］和巨魚丕（Bagarius yarrelli）［41］等的研究結(jié)果相一致，均體現(xiàn)出二堿基重復(fù)數(shù)量較多、六堿基最少的特征，可以作為后續(xù)相關(guān)研究的參考資料。在單堿基重復(fù)中以A/T類型為主，與前人［5-7，33-35，38-41］的研究結(jié)果相同。相關(guān)研究表明，A/T堿基含量與物種基因組中SSR數(shù)量呈正相關(guān)，即A/T堿基所占比例越高，SSR數(shù)量越多。此外，還可能與DNA聚合酶在DNA復(fù)制過程中的錯誤率和甲基化的CpG位點相關(guān)。二堿基重復(fù)中，AC/GT類型占主要優(yōu)勢，與絨杜父魚［5］、南極冰魚［6］、條紋斑竹鯊［39］一致，但與褐菖鲉［7］、卵形鯧鲹［38］（AC/TG為主）和巨魚丕［41］、斑點叉尾魚回（Ictalurus punctatus）［42］（AC/AG為主）略有不同。這可能與物種差異或堿基重復(fù)頻率有關(guān)，但與大多數(shù)魚類二堿基類型中都是以AC型為主［43］這一觀點相吻合。特定堿基重復(fù)的相對豐度在重復(fù)序列中具有較高的變異性，鰳魚全基因組中，二堿基、三堿基、四堿基、五堿基和六堿基的重復(fù)頻率分布范圍分別為6～28次、5～15次、5～11次、5～9次和5～7次，表明堿基重復(fù)次數(shù)隨重復(fù)長度的增加而逐漸減少，這可能是由重復(fù)長度越長、突變率越高所導(dǎo)致的。Wierdl等［44］和Chen等［45］也報道了重復(fù)次數(shù)與重復(fù)長度呈負(fù)相關(guān)的研究結(jié)果，本研究結(jié)果也證實了這一模式。

4" 結(jié)論

利用高通量測序技術(shù)結(jié)合survey分析得出，鰳魚基因組大小約為692.8 Mb，重復(fù)序列比例為39.6%，雜合率為0.18%，GC含量為42.92%，錯誤率為0.02%，組裝后的Scaffold大小為556 914 471 bp。識別鰳魚全基因組SSR序列共786 123個，蘊(yùn)含豐富的遺傳信息，不僅有助于開展鰳魚種質(zhì)資源評估保護(hù)和遺傳分子標(biāo)記優(yōu)選等工作，而且可以為其數(shù)量性狀基因座（QTL）定位、種群基因分析、遺傳基因多樣化水平鑒別等工作提供參考。

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Whole-genome analysis and microsatellite distribution of Ilisha elongata

GAO Luxiu1， CHEN Shiyi2， FENG Taobo2， LIU Bingjian2， LIU Yifan2， SHEN Haodi2， HUANG Wenhua2， LIANG Xudong2

（1. National Engineering Research Center for Marine Aquaculture，Zhejiang Ocean University，Zhoushan" 316022，China;

2. Marine Science and Technology College，Zhejiang Ocean University，Zhoushan" 316022，China）

Abstract： To study the genetic evolutionary profile of Ilisha elongata， high-throughput sequencing was performed on the I. elongata genome，and survey analysis and genome-wide genetic marker development were conducted.Results showed that the genome size of I. elongata，as determined by K-mer analysis，was approximately 692.8 Mb，with a heterozygosity rate of 0.18% and the repeated sequence rate of 39.6%.The preliminary genome assembly results showed that the Scaffold N50 was 27 694 bp and the Contig N50 was 6 306 bp.The simple sequence repeats（SSRs） of I. elongata genome were searched and analyzed using MISA software，and a total of 786 123 SSR loci were detected， with a relative abundance of 1 204 per Mb.Among all types，dinucleotides were the most abundant repeats，which accounting for 75.94% of the total SSRs and the SSR repeat frequencies mainly concentrated between 6 and 28 times.This was followed by mononucleotide and tetranucleotide repeats，accounting for 15.31% and 4.25% of the total SSRs，respectively.For dinucleotide repeats，type AC had the highest number of repeats at 131 732，while type A had the highest number of mononucleotide repeats at 48 775.The results showed that the genome of I. elongata could be assembled to obtain high-quality whole genome sequences，and the SSR loci could provide strong support for the subsequent genetic molecular marker development，as well as basic information for research work on germplasm resource management and conservation，biological evolution and population genetics of I. elongata.

Key words： Ilisha elongata; whole-genome survey; microsatellite marker; high-throughput sequencing; biogenetics