基于重測序鑒定GbTMEM214基因在陸地棉基因組的插入位點

摘要：【目的】利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了轉(zhuǎn)GbTMEM214基因陸地棉品系，旨在明確轉(zhuǎn)基因棉花株系中T-DNA插入位點的序列特征及檢測方法，為其生物安全評價提供依據(jù)?！痉椒ā炕诨蚪M重測序技術(shù)，利用BLASTn將測序數(shù)據(jù)與陸地棉TM-1基因組序列進(jìn)行比對分析，設(shè)計特異性引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction， PCR）驗證插入位點?！窘Y(jié)果】攜帶目標(biāo)基因GbTMEM214的T-DNA整合在陸地棉基因組D13號染色體57 019 068～57 019 106 bp，T-DNA插入導(dǎo)致受體基因組37 bp的片段缺失；通過PCR擴(kuò)增獲得攜帶GbTMEM214基因的T-DNA插入位點的側(cè)翼序列，由此建立了轉(zhuǎn)GbTMEM214基因棉花的特異性檢測方法?！窘Y(jié)論】基于基因組重測序技術(shù)獲得了轉(zhuǎn)GbTMEM214基因棉花的T-DNA插入位點及側(cè)翼序列信息，可為轉(zhuǎn)基因棉花的生物安全評價提供技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因棉花；GbTMEM214；重測序；插入位點；側(cè)翼序列

Abstract： [Objective] GbTMEM214 transgenic Gossypium hirsutum line， obtained using Agrobacterium-mediated method， was used to clarify the sequence characteristics and detection methods of the T-DNA insertion site， and further promote its biosafety evaluation. [Methods] Based on the genome resequencing technology， the sequencing data was compared with the G. hirsutum standard line TM-1 genome sequence by BLASTn， and specific primers were designed to verify the insertion site by polymerase chain reaction （PCR）. [Results] The T-DNA carrying the target gene GbTMEM214 was integrated into the position of 57 019 068-57 019 106 bp on chromosome D13 of G. hirsutum genome， resulting in 37 bp deletion of cotton genome. Combined with the flanking sequence of T-DNA insertion site obtained by PCR amplification， the specific detection method for GbTMEM214 transgenic cotton was established. [Conclusion] The T-DNA insertion site and flanking sequence of GbTMEM214 transgenic cotton was obtained based on genome resequencing technology， which can provide technical reference for biosafety evaluation of the transgenic cotton.

Keywords： transgenic cotton; GbTMEM214; resequencing; insertion site; flanking sequence

棉花是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。自1996年轉(zhuǎn)基因作物被允許商業(yè)化種植以來，截至2022年，全球轉(zhuǎn)基因作物累計種植面積超過26.67億hm2。棉花為第三大轉(zhuǎn)基因作物，2022年轉(zhuǎn)基因棉花的種植面積為2 540萬hm2，約占棉花種植總面積的80.4%[1]。

近年來，伴隨著具有優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因作物被批準(zhǔn)在不同國家和地區(qū)大面積種植、推廣，轉(zhuǎn)基因作物的安全、環(huán)境風(fēng)險、知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)和商業(yè)利益等問題引起了全世界的廣泛關(guān)注。因此，為了確保轉(zhuǎn)基因作物在正式進(jìn)入市場流通時對生態(tài)環(huán)境安全無不利影響，在其釋放前，需對攜帶目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行安全評估[2-3] 。明確轉(zhuǎn)基因作物的分子特征是對轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行安全監(jiān)督、環(huán)境釋放和產(chǎn)權(quán)保護(hù)的重要依據(jù)[4]，是開展植物基因組學(xué)相關(guān)研究的重要環(huán)節(jié)，也是每個轉(zhuǎn)基因新材料的標(biāo)識。轉(zhuǎn)基因作物的分子特征主要包括外源基因的表達(dá)、插入結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性等遺傳信息[5]，關(guān)鍵是要明確外源基因的插入位點。目前，鑒定插入位點的可靠方法主要基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction， PCR）技術(shù)，包括高效熱不對稱交錯PCR（high-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR， HiTail PCR）、染色體步移、外源接頭PCR法等。這些方法已經(jīng)成功運用于水稻[6]、大豆[7]、馬鈴薯[8]、玉米[9]等作物中外源基因插入位點側(cè)翼序列的分析。但這些方法存在操作步驟多、效率低、特異性差等缺點，無法獲得較高的成功率[10]。

隨著基因組學(xué)的發(fā)展和測序技術(shù)的進(jìn)步，全基因組重測序技術(shù)呈現(xiàn)出效率高、成本低、操作步驟簡單等優(yōu)點，目前已經(jīng)成為檢測轉(zhuǎn)基因作物外源DNA片段整合位點和側(cè)翼序列最普遍的方法[11-12]。徐鵬等[13]對轉(zhuǎn)SbHKT基因的陸地棉株系HKT-1進(jìn)行重測序，測序深度為30×，分析獲得目的基因插入位點的側(cè)翼序列，并通過PCR技術(shù)驗證其準(zhǔn)確性。張維東等[14]利用基因組重測序技術(shù)分析了轉(zhuǎn)FvC5SD-L05基因事件中轉(zhuǎn)移DNA（transferred DNA， T-DNA）的插入位點和方向，并結(jié)合PCR技術(shù)進(jìn)行了特異性檢測。

在本團(tuán)隊的前期研究中，利用海島棉（Gossypium barbadense）染色體單片段導(dǎo)入系蘇VR043構(gòu)建F2分離群體，克隆了1個與棉花黃萎病抗性相關(guān)的候選基因GbTMEM214（ID： GB_A04G1759），其編碼區(qū)（coding sequence， CDS）全長1 821 bp[15] 。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）和陸地棉（G. hirsutum）中超表達(dá)GbTMEM214基因可顯著提高其對黃萎病的抗性。本研究中，通過基因組重測序技術(shù)，分析其中1個轉(zhuǎn)化體的基因組中攜帶GbTMEM214基因的T-DNA插入位點，基于插入位點的側(cè)翼序列設(shè)計特異引物，結(jié)合PCR技術(shù)驗證插入位點及側(cè)翼序列，分析外源T-DNA在陸地棉基因組中的插入特征，構(gòu)建GbTMEM214基因轉(zhuǎn)化事件的特異檢測方法，為該轉(zhuǎn)基因棉花的環(huán)境釋放提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

GbTMEM214過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因抗黃萎病棉花株系（編號TMEM-1）由本實驗室通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得，轉(zhuǎn)化受體為陸地棉品系蘇研060的下胚軸。蘇研060為本實驗室篩選并自交保存的陸地棉高頻再生品系。

本研究所用的植物表達(dá)載體為pCAMBIA2301，T-DNA結(jié)構(gòu)見圖1。

1.2 試驗方法

1.2.1 GbTMEM214基因PCR檢測及表達(dá)量分析。選取TMEM-1株系、非轉(zhuǎn)基因受體蘇研060（陰性對照）苗期頂端新鮮嫩葉，利用新型植物基因組DNA提取試劑盒（上海浦迪生物科技有限公司）提取DNA，通過NPTⅡ特異引物（NPTⅡ-F，NRTⅡ-R）、35S啟動子-GbTMEM214基因引物（35S-F，GbTMEM214-R）進(jìn)行PCR擴(kuò)增（引物序列見表1）。以含有GbTMEM214基因表達(dá)載體的質(zhì)粒為陽性對照。PCR反應(yīng)體系：2.5 μL 10 × PCR Buffer（Mg2＋ plus）、2 μL dNTP Mixture、1 μL正向引物（10 μmol·L－1）、1 μL反向引物（10 μmol·L－1）、40 ng DNA、0.2 μL rTaq酶、加ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 35 s，58 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）瓊脂糖凝膠電泳。

選取TMEM-1株系、非轉(zhuǎn)基因受體蘇研060苗期頂端新鮮嫩葉，利用RNA提取試劑盒（OMEGA BIO-TEK公司）提取RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以cDNA為模板進(jìn)行實時定量PCR（quantitative real-time PCR， qRT-PCR），以陸地棉組蛋白3編碼基因GhHIS3（AF024716，引物為HIS3-F和HIS3-R）為內(nèi)參。qRT-PCR反應(yīng)體系：10 μL 2 ×ChamQ Universal SYBR Qpcr Master Mix、0.4 μL RT-F（10 μmol·L－1）、0.4 μL RT-R（10 μmol·L－1）、2 μL cDNA模板、加ddH2O補(bǔ)至20 μL。qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s。引物序列見表1。

1.2.2 TMEM-1株系基因組重測序。TMEM-1株系的基因組重測序委托南京集思慧遠(yuǎn)生物科技有限公司完成，測序深度為30×。將測序結(jié)果同陸地棉參考基因組（版本為浙江大學(xué)TM-1基因組）[16]進(jìn)行序列比對，初步獲得TMEM-1株系T-DNA插入位點及側(cè)翼序列信息。

首先，通過十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide， CTAB）法[17]提取TMEM-1株系的基因組DNA，采用One drop超微量分光光度計及瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度及純度。利用Covaris破碎機(jī)（Covaris公司）將檢測合格的DNA樣品隨機(jī)打斷成長度為150 bp的片段，再通過TruSeq Library Construction Kit（Illumina公司）對片段化的GbTMEM214基因組DNA構(gòu)建文庫。

為了確保構(gòu)建文庫的質(zhì)量，先使用Qubit 2.0熒光定量儀（Thermo Fisher公司）進(jìn)行初步分析，將文庫濃度稀釋至1 mg·L－1；再通過Agilent 2100生物分析儀（Agilent公司）檢測文庫插入片段的大小；符合預(yù)期后，利用qRT-PCR方法對文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量（文庫有效濃度大于2 nmol·L－1）。通過Illumina HiSeq PE150雙端測序法對檢測合格的文庫進(jìn)行測序。最后，對得到的原始數(shù)據(jù)（raw reads）進(jìn)行質(zhì)量控制，得到有效讀長（clean reads）。

1.2.3 TMEM-1株系插入位點及側(cè)翼序列的獲取。利用BLASTn將獲得的有效讀長與棉花TM-1的參考基因組進(jìn)行序列比對，剔除雙端都比對上的讀長，保留單端未比對上的讀長以及雙端都未比對上的讀長；將保留的讀長與T-DNA骨架序列及棉花TM-1基因組序列進(jìn)行比對，篩選一端比對到棉花基因組而另一端比對到T-DNA骨架的有效讀長進(jìn)行序列分析；根據(jù)比對得到的序列信息，確定插入位點，T-DNA骨架左邊界（left border， LB）、右邊界（right border， RB）與基因組連接處的左右兩側(cè)的序列即為插入位點的側(cè)翼序列。

1.2.4 側(cè)翼序列的驗證。根據(jù)插入位點的側(cè)翼序列及T-DNA骨架序列，利用 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計特異擴(kuò)增側(cè)翼序列的PCR引物（表1），并由金斯瑞生物科技股份有限公司合成。隨后以TMEM-1株系和蘇研060的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系和條件同1.2.1。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用Axygen凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收、純化特異條帶；連接到T-vector pMD19（simple）載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌；隨機(jī)挑選12個單克隆菌落，用側(cè)翼序列的特異引物和載體通用引物M13進(jìn)行PCR檢測，挑選陽性克隆進(jìn)行測序驗證；將測序結(jié)果與棉花TM-1參考基因組及T-DNA骨架序列進(jìn)行比對。

1.2.5 GUS組織染色。選取TMEM-1株系、非轉(zhuǎn)基因受體蘇研060苗期棉株的倒2葉，放入配置好的GUS染色液中，用真空泵抽濾，使葉片完全浸沒于染色液中，放置于37 ℃浸染24 h，觀察葉片顏色變化。隨后用75%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇于37 ℃洗脫葉片3～5次，每次2～3 h，至葉片褪去綠色[18]，拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)GbTMEM214基因陽性株系的檢測

PCR檢測結(jié)果顯示，以TMEM-1株系DNA為模板能夠擴(kuò)增出符合預(yù)期大小的目標(biāo)條帶（圖2A）。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，TMEM-1株系中GbTMEM214基因的表達(dá)量顯著高于非轉(zhuǎn)基因受體對照（圖2B）。以上結(jié)果表明GbTMEM214基因完整插入到受體基因組中，且在受體中的表達(dá)量顯著升高。

2.2 基于重測序測定TMEM-1株系基因組中外源T-DNA插入位點的側(cè)翼序列

前期調(diào)查結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系的株高、衣分、鈴重、單株結(jié)鈴數(shù)、纖維上半部平均長度、斷裂比強(qiáng)度及馬克隆值等與受體材料無顯著差異，表明GbTMEM214基因的導(dǎo)入不影響棉花的主要農(nóng)藝性狀，且顯著增強(qiáng)了棉花對黃萎病的抗性。

在此基礎(chǔ)上，對轉(zhuǎn)基因TMEM-1株系進(jìn)行了30×的基因組重測序。過濾掉含有接頭且低質(zhì)量的原始數(shù)據(jù)，得到有效讀長，使用Blastn將有效讀長比對到含有GbTMEM214基因的pCAMBIA2301載體序列上，最終共獲得聯(lián)配的讀長 1 340條。其中大部分讀長能夠完全比對到pCAMBIA2301載體序列，僅有8條讀長的一端能夠比對到TM-1基因組，另一端能夠比對到T-DNA區(qū)LB端側(cè)翼序列，其中比對到基因組的序列長度為53～91 bp，且這8條讀長全部被錨定在D13染色體上（表2）。由此推斷D13染色體是唯一整合了外源T-DNA的染色體，并且外源T-DNA位于D13染色體的57 019 068 bp位置附近。

2.3 側(cè)翼序列的驗證

為了驗證T-DNA的插入位點及側(cè)翼序列，根據(jù)重測序分析結(jié)果，提取TM-1參考基因組D13染色體57 019 068 bp位置上下游各1 000 bp的序列及T-DNA骨架序列分別設(shè)計特異引物（圖3，表1），通過特異引物之間的相互組配進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，D13-F1、D13-F2分別與LB35STR-2、LB35STR-3C2、LB35STR-4組配以及D13-R1、D13-R2分別與RBGUS-2、RB-1a、RB-2a進(jìn)行組配均未擴(kuò)增出條帶。D13-R1、D13-R2分別與LB35STR-2、LB35STR-3C2和LB35STR-4進(jìn)行組配均可在轉(zhuǎn)基因陽性植株中擴(kuò)增出符合預(yù)期大小的特異條帶（圖4A）。測序結(jié)果表明，一端能夠比對到陸地棉D(zhuǎn)13染色體上，另一端能夠比對到外源T-DNA序列上，本次的外源T-DNA插入事件為反向插入，且插入位點位于D13染色體的57 019 106 bp處。

根據(jù)右邊界序列設(shè)計引物，D13-F1、D13-F2分別與RBGUS-2、RB-1a、RB-2a組配進(jìn)行PCR擴(kuò)增均沒有獲得目標(biāo)條帶。因此推測，在本次轉(zhuǎn)基因事件中，與基因組相連的其中一端發(fā)生了右邊界的缺失，或者外源T-DNA在插入基因組時GUS基因序列的方向為正向。因此，根據(jù)外源T-DNA的序列重新設(shè)計反向引物，發(fā)現(xiàn)在外源T-DNA的GUS基因序列上設(shè)計的引物RBGUS-R1、RBGUS-R2分別與在棉花基因組上設(shè)計的正向引物D13-F1、D13-F2組配能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的目的條帶（圖4B）。測序結(jié)果表明，序列的一端能夠比對到棉花D13染色體的57 019 068 bp處，另一端比對到外源T-DNA的GUS區(qū)間1～308 bp處（以GUS基因起始密碼子ATG的“A”作為＋1）。說明GUS基因以正向插入方式直接與受體基因組相連。以上結(jié)果表明，本次外源T-DNA插入到了陸地棉基因組D13染色體的57 019 068～57 019 106 bp之間，同時造成受體基因組37 bp片段的缺失。

為了檢測外源T-DNA插入片段的大小，利用插入位點兩端的引物D13-F1、D13-F2和D13-R1、D13-R2分別進(jìn)行組配擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因受體蘇研060和轉(zhuǎn)GbTMEM214基因TMEM-1株系的基因組DNA，均未擴(kuò)增出符合預(yù)期的條帶。為證明本次轉(zhuǎn)基因事件是否含有串聯(lián)重復(fù)，利用外源T-DNA左右邊界上的引物對TMEM-1株系的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增使用的上下游引物分別位于外源T-DNA的左右邊界上，若不存在串聯(lián)重復(fù)，使用這些引物組配不能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶。PCR結(jié)果表明，引物L(fēng)B35STR-4和RBGUS-2組配能夠擴(kuò)增出660 bp大小的目標(biāo)條帶（圖4C），測序結(jié)果表明，擴(kuò)增序列分別屬于T-DNA左右邊界。

2.4 外源T-DNA插入方式

為了檢測轉(zhuǎn)GbTMEM214基因TMEM-1株系中的GUS活性，對TMEM-1株系頂端倒2葉進(jìn)行GUS染色。結(jié)果顯示，葉片出現(xiàn)藍(lán)色，說明轉(zhuǎn)入棉花基因組的T-DNA區(qū)段中的GUS基因可以在TMEM-1株系中正常表達(dá)，表明該轉(zhuǎn)化體中至少有1個完整的GUS基因（圖5）。

以上結(jié)果表明，本次的轉(zhuǎn)基因事件包括反向串聯(lián)重復(fù)和正向的插入缺失。對RB端擴(kuò)增結(jié)果表明，GUS基因直接與受體基因組連接，且插入方向為正向。因此，推測該位置外源DNA的插入方式可能是n個完整的T-DNA與1個缺失的T-DNA串聯(lián)（圖6）。由于插入片段串聯(lián)重復(fù)使得PCR擴(kuò)增難度加大，因此對于本次轉(zhuǎn)基因事件發(fā)生了多少次外源T-DNA的串聯(lián)重復(fù)還需后續(xù)的實驗檢測。

2.5 插入位點側(cè)翼序列的特征分析

根據(jù)以上分析，攜帶GbTMEM214基因的T-DNA插入到陸地棉基因組D13染色體上，位于57 019 068～57 019 106 bp（圖6）。對該區(qū)段分析發(fā)現(xiàn)，本次外源T-DNA的插入事件并未導(dǎo)致轉(zhuǎn)化受體本身基因的缺失；該插入?yún)^(qū)段的上游57 017 904～57 018 134 bp存在1個功能未知的基因GH_D13G1925；插入?yún)^(qū)段下游57 046 267～57 046 914 bp存在1個編碼乙烯響應(yīng)因子ERF1B基因GH_D13G1926。通過對外源T-DNA插入位點兩側(cè)各500 bp側(cè)翼序列分析，堿基腺嘌呤（adenine， A）、胸腺嘧啶（thymine， T）的含量分別為69.2%、74.6%，說明插入位點側(cè)翼序列的AT含量較高。

3 討論

生物育種是目前作物育種的重要方向。而轉(zhuǎn)基因育種是生物育種的重要組成部分，轉(zhuǎn)基因育種的關(guān)鍵是克隆具有潛力的基因。深入研究目標(biāo)基因的調(diào)控機(jī)理，對提升作物的產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性等具有重要意義[19]。黃萎病是棉花生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害之一。目前防治棉花黃萎病最經(jīng)濟(jì)有效的措施是種植抗黃萎病品種。通過外源基因?qū)肱嘤共∞D(zhuǎn)基因品種已取得突破性進(jìn)展，但由于缺乏高抗黃萎病資源，阻礙了棉花抗黃萎病關(guān)鍵基因的克隆，棉花抗黃萎病機(jī)制解析不夠深入，抗黃萎病生物育種進(jìn)展緩慢[20]。本研究的目標(biāo)基因GbTMEM214編碼1個跨膜蛋白，動物中Gb-TMEM214的同源蛋白主要通過調(diào)節(jié)半胱氨酸蛋白酶caspase-4的活性，參與細(xì)胞凋亡過程和癌細(xì)胞的信號傳導(dǎo)[21]，但其在植物中的相關(guān)研究鮮有報道。本研究創(chuàng)制的轉(zhuǎn)GbTMEM214基因TMEM-1株系為棉花抗黃萎病生物育種提供候選抗病基因和抗性資源。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為農(nóng)業(yè)領(lǐng)域發(fā)展最快、應(yīng)用最廣的高新技術(shù)之一，打破了不同物種間的隔離障礙。隨著轉(zhuǎn)基因作物的廣泛應(yīng)用及商業(yè)化發(fā)展，其種植面積持續(xù)擴(kuò)大，安全問題也備受關(guān)注[1， 22]。在轉(zhuǎn)基因過程中，T-DNA在受體植物基因組中的插入具有隨機(jī)性，但每個轉(zhuǎn)化事件插入位點的側(cè)翼序列具有唯一性，因此明確T-DNA插入位點的側(cè)翼序列對識別轉(zhuǎn)化體有重要作用，有利于轉(zhuǎn)基因作物的環(huán)境釋放安全評估[23]。目前，完成基因組高精度組裝的陸地棉品種（系）很少，多數(shù)研究都是以陸地棉的遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1作為參考基因組；同時，由于陸地棉基因組具有種間差異較小、序列高度保守的特點[24]，因此本研究未對受體材料蘇研060進(jìn)行基因組測序組裝，而是以陸地棉的遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1的基因組作為參考基因組。通過對轉(zhuǎn)GbTMEM214基因TMEM-1株系T-DNA的側(cè)翼序列進(jìn)行驗證，分析了插入位點的序列特征，獲得了特異性檢測引物，為轉(zhuǎn)GbTMEM214基因棉花的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

研究表明，外源T-DNA 的插入伴隨著插入位點序列的刪除、復(fù)制、基因組重排、染色體易位或倒位等現(xiàn)象的發(fā)生[25]。并且由于外源T-DNA是以雙鏈DNA斷裂修復(fù)機(jī)制的整合方式插入至受體基因組，在整合過程中由于宿主DNA雙鏈發(fā)生斷裂，可能會導(dǎo)致宿主基因組序列的缺失[26]。陳天子等[27]研究發(fā)現(xiàn)含有GbVe1基因的外源T-DNA的插入造成了插入位點處21 bp的丟失。馮翠蓮等[28]發(fā)現(xiàn)在外源T-DNA序列插入受體基因組時，插入位點左右兩側(cè)都有不同程度的缺失，左側(cè)更容易缺失。本研究中，利用基因組重測序技術(shù)及PCR對攜帶GbTMEM214基因的T-DNA插入位點的側(cè)翼序列進(jìn)行分析驗證，結(jié)果表明，T-DNA的整合造成棉花受體基因組37 bp序列缺失。使用上下游分別位于LB與RB的引物組配，對插入位點的PCR檢測結(jié)果表明，存在RB與LB串聯(lián)的情況，推測外源T-DNA以串聯(lián)重復(fù)方式插入陸地棉基因組中；對TMEM-1株系葉片進(jìn)行GUS染色，葉片變藍(lán)，說明該轉(zhuǎn)化體中至少存在1個能夠正常表達(dá)的GUS基因，但是具體存在多少個完整的T-DNA尚不清楚。因此，推測轉(zhuǎn)基因株系外源DNA插入方式可能是n個完整的T-DNA與1個缺失的T-DNA串聯(lián)，但具體的串聯(lián)方式以及缺失的片段序列仍需進(jìn)一步分析和驗證。另外，對插入位點處上下游基因序列分析發(fā)現(xiàn)，缺失序列處沒有基因；在插入?yún)^(qū)段上游57 017 904～57 018 134 bp存在1個功能未知的基因GH_D13G1925，插入?yún)^(qū)段下游57 046 267～57 046 914 bp存在1個ERF1B編碼基因GH_D13G1926。因而本次轉(zhuǎn)基因事件中外源基因的插入未對其他基因的序列完整性產(chǎn)生影響。

研究表明，T-DNA更易與植物基因組中AT堿基含量較高的區(qū)域連接，AT堿基富集區(qū)作為T-DNA的重組熱點，可能是因為AT配對的堿基只含有2個氫鍵，相較于GC配對的3個氫鍵斷裂更容易，這也造成AT堿基富集區(qū)的DNA不穩(wěn)定[29-30]。Brunaud等[29]通過分析9 000個T-DNA整合的擬南芥基因組側(cè)翼序列，認(rèn)為T-DNA容易整合進(jìn)入富含AT堿基的區(qū)域。李述田等[31]通過統(tǒng)計247個水稻T-DNA整合區(qū)域的AT含量發(fā)現(xiàn)，插入位點側(cè)翼序列的AT平均含量高達(dá)61.2%。本研究中，外源T-DNA反向插入在陸地棉D(zhuǎn)13號染色體的57 019 068～57 019 106 bp，插入位點兩側(cè)的側(cè)翼序列（500 bp）AT堿基含量較高，分別為69.2%和74.6%，這與已報道的T-DNA更容易插入到AT含量較高的區(qū)域相符。

通過分析插入位點的序列特征，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因棉花株系TMEM-1中T-DNA為單位點、多拷貝串聯(lián)反向插入。由于單次轉(zhuǎn)化事件中外源T-DNA的插入具有唯一性，且已經(jīng)明確插入位點兩側(cè)的側(cè)翼序列，因此拷貝數(shù)的多少并不會影響后續(xù)轉(zhuǎn)化事件的檢測。為更清楚地了解插入位點的序列特征，在后續(xù)需要對拷貝數(shù)進(jìn)行檢測，同時，Gb-TMEM214基因插入如何導(dǎo)致具體的結(jié)構(gòu)變異也有待分析和驗證。

4 結(jié)論

本研究基于基因組重測序技術(shù)獲得含有GbTMEM214基因的T-DNA序列在陸地棉基因組中的插入位點和側(cè)翼序列，利用PCR技術(shù)驗證了T-DNA的整合區(qū)域，分析了插入位點的序列特征，構(gòu)建了GbTMEM214基因轉(zhuǎn)化事件的特異性檢測方法。

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（責(zé)任編輯：王小璐 責(zé)任校對：王國鑫）