孑遺植物水松不同季節(jié)根際微生物群落結(jié)構(gòu)和功能特征

摘要：[目的]探索水松根際微生物群落結(jié)構(gòu)和功能及隨季節(jié)變化的規(guī)律。[方法]采用PCR-DGGE和Biolog-ECO微平板法測定不同季節(jié)水松根際土壤理化性質(zhì)、微生物群落結(jié)構(gòu)和功能，通過主成分分析和冗余分析等方法解析根際微生態(tài)各環(huán)境因子的內(nèi)在規(guī)律。[結(jié)果]水松根際微生物群落中優(yōu)勢細菌為α-變形菌（Alphapro-teobacteria）、酸桿菌（Acidobacteria）和δ-變形菌（Deltaproteobacteria），優(yōu)勢真菌為糞殼菌（Sordario-mycetes）。夏季水松根際微生物量和微生物多樣性最高。根際微生物的碳代謝能力在夏季最強，冬季最弱，大致表現(xiàn)為夏季gt;秋季gt;春季gt;冬季，速效氮可能是微生物群落碳代謝功能的主要驅(qū)動因子。[結(jié)論]水松根際微生物群落多樣性和碳代謝能力在夏季最優(yōu)，在冬季最差。季節(jié)因素顯著影響著根際微生物群落結(jié)構(gòu)和功能，開展相關研究時應充分考慮季節(jié)因素造成的波動。

關鍵詞：水松；根際微生物；季節(jié)動態(tài)；PCR-DGGE; Biolog-ECO

中圖分類號：Q145+．2 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2024）03-0118-11

孑遺植物水松（Glyptostrobus pensilis（Staunton ex D．Don）K．Koch）又名水帝松、水杉松、水樅等，是杉科水松屬中的唯一物種；水松因其古老而珍貴的基因被譽為植物界的活化石，具有極高的科研價值。水松曾是北半球的重要物種，廣泛分布于北半球，但第四紀冰期以來，其種群迅速衰弱，正面臨滅絕風險，目前已被列為國家一級瀕危保護植物，被國際自然資源保護聯(lián)盟（IUCN）列為極危種。水松相關研究在質(zhì)量和數(shù)量上遠落后于其他杉科喬木，為數(shù)不多的研究集中在種群生態(tài)學和遺傳生態(tài)學等領域，至今仍未見根際微生物群落的報道。

根際土壤是指植物根系周圍數(shù)毫米范圍內(nèi)受根系活動強烈影響的土壤，是根系-土壤-微生物互作的主要區(qū)域。雖然前人對植物根際開展過大量研究，但它仍是一個蘊藏著龐大未知信息的“黑匣子”。根際微生物是根際土壤中最活躍的部分，是土壤中有機質(zhì)轉(zhuǎn)化和養(yǎng)分元素循環(huán)的引擎，是物質(zhì)循環(huán)和能量流動的主要驅(qū)動因素。近年來，因根際微生物的重要性逐漸受到學界廣泛重視，有學者將根際微生物稱為“植物的第二基因組”，認為應該將植物和根際微生物視作一個宏生物體來研究。與腸道菌群類似，植物根際微生物群落也由數(shù)量龐大，種類繁多，功能各異的微生物組成，它們參與并影響著植物的養(yǎng)分吸收和抗逆性調(diào)節(jié)過程，在植物生命的全過程都扮演重要角色，發(fā)揮關鍵作用。植物能通過定向招募具有特定功能的微生物組以增強其特定功能，例如招募特基拉芽孢桿菌、叢植菌根真菌能夠促進植物生長、提高植物的抗旱性及養(yǎng)分吸收能力。根際微生物群落災變則會引起一系列病害，導致植物生產(chǎn)力下降甚至死亡。因此根際微生物群落健康和多樣性對土壤生態(tài)系統(tǒng)服務的功能和穩(wěn)定性至關重要，是土壤肥力和健康評價的重要指標。

土壤微生物群落的研究方法眾多，傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法只能對0.1%～10%的土壤微生物進行研究，具有較大局限性。隨著分子生態(tài)學技術的發(fā)展，PCR-DGGE和Biolog-ECO微平板等能夠忽略微生物培養(yǎng)限制的研究技術逐漸取代了傳統(tǒng)方法，并被廣泛應用于生態(tài)學研究。變性梯度凝膠電泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）以甲酰胺和尿素為變性劑，將不同長度和堿基序列的DNA片段分離，染色處理后能夠獲取微生物群落結(jié)構(gòu)信息，具有操作簡便、檢測閾值低、重復性高和結(jié)果準確可靠等優(yōu)點。Srivastava等利用DGGE技術揭示了印度稻田土壤微生物群落的優(yōu)勢菌群及其與土壤理化性質(zhì)間的相關性規(guī)律。Biolog Eco微平板法通過量化微生物群落對31種碳源代謝能力獲取其特定的“代謝指紋”，能夠表征微生物群落的碳代謝特征，具有操作簡便，靈敏度高等優(yōu)點。Feigl等利用Biolog-ECO微平板監(jiān)測赤泥添加對土壤微生物群落碳代謝特征的影響，確定了合適赤泥添加比例。

基于此，本研究以不同季節(jié)水松為研究對象，從根際-土壤-微生物角度切入，采用PCR-DGGE和Biolog-ECO微平板等技術對水松根際微生物群落特征及其季節(jié)動態(tài)變化規(guī)律開展研究，揭示不同季節(jié)水松根際微生物群落結(jié)構(gòu)和碳代謝功能特征，尋找根際微生態(tài)中驅(qū)動根際微生物群落變化的關鍵環(huán)境因子，為水松進一步的研究提供有益理論參考。

1 材料和方法

1.1 研究地概況

本試驗采樣地點位于福建省寧德市屏南縣上樓村（26°58＇N，118°57＇E），閩東北鷲峰山脈中段，東峰尖北麓的一片沼澤地中，該林是世界上林地面積最大、種群數(shù)量最多的天然水松林。林中生長著72株水松，胸徑多在40～70 cm之間，樹高多為15～20 m，平均樹齡約為418歲。該區(qū)域?qū)賮啛釒Ъ撅L氣候，年平均氣溫為15℃，年積溫5 214.2℃，年平均降水量約為1 800 mm，氣候溫暖濕潤，雨水充沛，四季分明，冬無嚴寒，夏無酷暑。水松林位于山谷地帶，林下土壤細膩肥沃，植被物種豐富，伴生植物有柳杉（Cryptomeriafortunei Hooibrenk ex Otto et Dietr．）、馬尾松（Pinus massoniana Lamb.）等。

1.2 樣品采集

參考吳則焰的調(diào)查結(jié)果，選擇5株具有代表性的（長勢良好，胸徑20～60 cm之間）水松為研究對象，表征林中72棵水松。分別于2021年12月25日（冬季）、2022年3月16日（春季）、2022年6月12日（夏季）和2022年9月30日（秋季）采集土壤樣品。用鏟子去除土壤表面的腐質(zhì)層，挖取0～20 cm深度的水松根系，輕輕抖落表面土壤，收集附著在根系上的土壤為根際土壤，于室內(nèi)風干至可過篩狀態(tài)，除去殘留的根系和小石子，置于4℃冰箱保存，用于后續(xù)試驗測定。

1.3 土壤理化性質(zhì)測定

含水量采用烘箱烘干法測定；pH采用電位法（水土比為2.5：1）測定；速效氮（AN）采用堿擴散法測定；速效磷（AP）采用NaHCO3法測定；速效鉀（AK）采用醋酸銨-火焰光度法測定；土壤以HC104-H2S04法處理后，全氮（TN）和全磷（TP）采用全自動間斷化學分析儀測定，全鉀（TK）采用火焰光度法測定。具體步驟參照鮑士旦的方法。

1.4 土壤酶活性測定

纖維素酶和蔗糖酶采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定；脲酶采用苯顯色法測定；酸性磷酸酶采用對硝基苯磷酸二鈉比色法測定；過氧化氫酶采用高錳酸鉀滴定法測定。具體步驟參照關松蔭的方法。

1.5 微生物量測定

微生物量碳、氮含量的測定采用氯仿熏蒸法。具體步驟參照吳金水的方法。

1.6 微生物群落結(jié)構(gòu)測定

使用土壤DNA提取試劑盒（OMEGA，美國）提取土壤DNA。PCR反應體系均為50 μL：1.25 μL 100 mol·L-1上下游引物，25 μL 2×HieffRobust PCR MasterMix．10ng DNA模板，ddH2O補齊至50μL。細菌第一輪PCR引物為27F和1 492R，PCR擴增程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1min，循環(huán)35次；72℃終延伸5 min。第二輪PCR引物為GC-357F（5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGG GCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和518R（5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’），PCR擴增程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，48℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35次；72℃終延伸5 min。真菌PCR引物為GC-Fung（5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCATTCCCCGTTACCCGTTG-3’）和NS1（5’．GTAGTCA TATGCTTGTCTC-3’），PCR擴增程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35次；72℃終延伸10 min。使用膠回收試劑盒（OMEGA，美國）回收目的基因。細菌凝膠的變性梯度為45%～60%，丙烯酰胺凝膠強度為8%，在80 V，60℃條件下電泳12 h。染色采用銀染法：①加入固定液（10%乙醇，0.5%冰醋酸），100 r·min-1振蕩15 min，用雙蒸水清洗；②加入染色液（AgNO3 0.2%，甲醛0.1%），避光條件下100 r·min-1振蕩15 min，用雙蒸水清洗；③加入顯色液（NaOH 1.5%，甲醛0.1%），100 r·min-l振蕩15 min，用雙蒸水清洗。使用凝膠成像儀（BIO-RAD，美國）掃描凝膠圖片。使用軟件Quantity One將圖片信息轉(zhuǎn)化為數(shù)字信息。條帶DNA轉(zhuǎn)入Trans-T1 Phage Resistant化學感受態(tài)細胞后送公司（生工，上海，中國）測序，使用NCBI數(shù)據(jù)庫比對測序結(jié)果。

1.7 微生物碳代謝功能測定

稱取10 9（精確至0.001 9）土壤加入至50mL 0.85% NaCl溶液中，搖床中30℃，200r·min-1振蕩30 min。冰浴靜置5 min。吸取5mL上層浸提液，加入至45 mL 0.85% NaCl溶液中，重復稀釋制得1：1000提取液。向Biolog-ECO微平板的各孔中加入150 μL 1：1 000土壤浸提液。30℃避光培養(yǎng)168 h，每隔24 h使用酶標儀讀取各孔在590 nm處的吸光值用于數(shù)據(jù)分析。

1.8 數(shù)據(jù)分析

在軟件SPSS 19中采用Duncan （D）法進行單因素方差分析以檢驗樣本顯著性差異。使用ORIGIN 2021 pro繪制柱狀圖；使用軟件STAMPv2.1.3分別以微生物類群相對豐度和31種碳源在168 h處的吸光值為數(shù)據(jù)進行主成分分析；使用軟件TBtools以微生物類群相對豐度為數(shù)據(jù)進行熱圖分析；使用軟件Canoco 5以微生物類群相對豐度和土壤理化性質(zhì)為數(shù)據(jù)進行冗余分析。

2 結(jié)果

2.1 水松根際土壤微生物量與酶活性季節(jié)變化

微生物量碳、氮測定結(jié)果（圖1）顯示，不同季節(jié)水松根際土壤微生物量碳和微生物量氮含量表現(xiàn)為夏季gt;秋季gt;春季gt;冬季，不同季節(jié)間差異顯著，說明水松根際的微生物數(shù)量在夏季最高，在冬季最低。水松根際土壤纖維素酶和蔗糖酶在夏季最高，在冬季最低，說明夏季根際微生物的有機質(zhì)代謝能力最強土壤有機質(zhì)的降解速率在夏季最高。脲酶和酸性磷酸酶活性在春季最高，說明土壤中含氮、磷化合物的礦化速率在春季最高。過氧化氫酶活性在秋季最高，說明根際土壤的抗氧化能力和抗逆性在秋季最強（圖2）。

2.2 水松根際微生物群落結(jié)構(gòu)及其季節(jié)變化

PCR產(chǎn)物的檢測結(jié)果（圖3A～D）顯示，條帶明亮清晰且長度與預期相符，說明擴增成功。從水松根際微生物的PCR-DGGE圖譜（圖3E、F）中各選取45和9個條帶，由上至下進行編號，依次分別為X-1至X-45和Z-1至2-9。主成分分析結(jié)果（圖4A、B）顯示，不同季節(jié)水松根際的細菌和真菌群落差異均顯著。從水松根際土壤中共鑒定到35種細菌和5種真菌，在綱水平上可將其細歸為1 1個微生物類群，分別為酸桿菌（Acidobacteria），α-變形菌（Alphaproteobacteria）、β-變形菌（Betaproteobacteria）、δ-變形菌（Deltaproteobacteria）、厚壁菌（Firmicutes）、γ-變形菌（Gammaproteobacteria）、纖線桿菌（Ktedonobacteria）、硝化螺旋菌（Nitrospirae）、Oligoflexi、Saccharibacteria和其他類群。細菌群落中的優(yōu)勢類群為α-變形菌（Alphaproteobacteria）、酸桿菌（Acidobacteria）和δ-變形菌（Deltaproteobacteria）（表1）；將真菌歸為4個微生物類群，分別為座囊菌（Dothideomycetes）、錘舌菌（Leotiomycetes）、糞殼菌（Sordariomycetes）和銀耳菌（Tremellomycetes），其中真菌群落中的優(yōu)勢類群為糞殼菌（Sordariomycetes）（表1）。聚類分析結(jié)果（圖4C、D）顯示，夏季與秋季的根際細菌群落較為接近，春季與冬季的根際細菌群落較為接近。春季與冬季的真菌群落較為接近，秋季與其他季節(jié)的真菌群落差異最大。

2.3 水松根際微生物群落碳代謝特征及其季節(jié)變化

Biolog-ECO微平板實驗結(jié)果（圖5）顯示，AWCD值（Average well color development）均在夏季最高，在冬季最低，說明夏季水松根際微生物群落的碳代謝能力最強，冬季最弱。依據(jù)化合物的基團特性將Biolog-ECO板中的31種碳源分為6大類，分別為多聚合物類、羧酸類、糖類、酚酸類、氨基酸類和胺類，結(jié)果（圖5B）顯示微生物群落代謝氨基酸類碳源的能力最強，其余依次為胺類、羧酸類、糖類、多聚合物類和酚酸類碳源。水松根際微生物群落代謝羧酸類、氨基酸類、酚酸類、多聚合物類和糖類的能力在夏季最強，在冬季最弱，代謝胺類碳源的能力在秋季最強，冬季最弱。微生物多樣性指數(shù)分析結(jié)果（表2）顯示，Shannon指數(shù)、Brillouin指數(shù)和均勻度指數(shù)均在夏季出現(xiàn)最高值，說明夏季水松根際微生物的群落多樣性最高。主成分分析結(jié)果（圖5C）中，不同季節(jié)的樣本點間距顯著大于相同季節(jié)，說明不同季節(jié)水松根際微生物群落碳代謝特征差異顯著。微生物群落碳代謝特征和土壤理化性質(zhì)（表3）的冗余分析結(jié)果（圖5D）顯示，速效氮含量與根際微生物群落的碳代謝特征的相關性最強，其余依次為速效鉀、速效磷、全氮、全鉀、全磷、pH和含水量。

3 討論

3.1 水松根際土壤微生物量和酶活性

微生物量碳、氮指構(gòu)成微生物的碳、氮元素，能夠反映土壤中的微生物量，也是土壤各生態(tài)轉(zhuǎn)化過程中的關鍵驅(qū)動因子。微生物量碳、氮對土壤環(huán)境變化的響應十分靈敏，被認為是評價土壤質(zhì)量的良好指標。植物與微生物經(jīng)過漫長的歷史演化，逐漸進化出了一套互利共生的合作模式，植物通過分泌物為微生物提供有機養(yǎng)分，而微生物通過降解有機化合物為植物提供無機養(yǎng)分，這種機制提高了植物與微生物的環(huán)境適應性，因此生物量的高低能夠表征植物和土壤健康狀況。本研究中，水松根際微生物量在冬季最低，在夏季達到了最高值，說明水松根際活動在夏季最為活躍，根際土壤質(zhì)量在夏季最優(yōu)。其原因可能是夏季水松生長旺盛，對無機養(yǎng)分的需求相比冬季大大提高，因此增加了根系分泌物的分泌量，同時林地中茂盛生長植被也向土壤中輸入了大量有機物，這些碳源的輸入極大地豐富了土壤微生物量。這與Lepcha等的研究結(jié)果相符。酶是土壤養(yǎng)分循環(huán)的重要驅(qū)動力，是土壤健康評價體系的重要指標之一，微生物是其重要來源之一。水松根際土壤纖維素酶和蔗糖酶活性在夏季最高，即有機養(yǎng)分的分解速率在夏季達到最高。本研究中的微生物量、酶活性和養(yǎng)分含量的季節(jié)變化規(guī)律相吻合，推測在夏季，水松通過影響土壤碳源的輸入來調(diào)控根際微生物量和相關酶活性，進而改變有機質(zhì)礦化速率和養(yǎng)分積累，提高土壤質(zhì)量，使根際微生態(tài)系統(tǒng)生態(tài)功能與水松生長周期相協(xié)調(diào)。

3.2 水松根際微生物群落結(jié)構(gòu)特征

群落結(jié)構(gòu)是微生物群落主要生物學特征之一。PCR-DGGE技術能夠突破絕大多數(shù)微生物不可培養(yǎng)的限制，直接對土壤中的基因組進行分析，解析土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，獲得微生物優(yōu)勢類群等重要的信息。大量研究表明，土壤的生態(tài)學功能與微生物群落結(jié)構(gòu)息息相關。微生物群落結(jié)構(gòu)變化通過影響土壤養(yǎng)分礦化速率、土壤抑病性和植物促生能力等途徑調(diào)控土壤微生態(tài)的生態(tài)學功能。因此微生物群落結(jié)構(gòu)的解析對于加深植物理解至關重要。本研究結(jié)果顯示，不同季節(jié)下水松根際微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大，但其中的優(yōu)勢類群較為穩(wěn)定，細菌優(yōu)勢類群均為α-變形菌（Alphaproteobacteria）、酸桿菌（Acidobacteria）和δ-變形菌（Deltaproteobacteria），真菌優(yōu)勢類群均為糞殼菌（Sordariomycetes）。不同季節(jié)間水松根際微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著，說明季節(jié)因素對水松微生物群落造成了顯著影響，季節(jié)因素可能通過改變根際微生物群落從而影響水松的生長發(fā)育。Marschner等在其他植物研究中得到了類似結(jié)果。

3.3 水松根際微生物群落碳代謝特征

微生物群落的碳代謝特征能夠表征土壤有機質(zhì)的降解能力和微生物多樣性，是微生物群落關鍵特征之一。本研究結(jié)果顯示，水松根際微生物群落的碳代謝能力在夏季最強，在冬季最弱，這閆法軍等的研究結(jié)果類似。值得注意的是，水松根際微生物群落對氨基酸類碳源的代謝能力最強，說明水松根際微生物對氨基酸類碳源具有很強的偏好性，而氨基酸類物質(zhì)是植物向土壤中分泌的大量低分子化合物之一，因此這種偏好性可能是水松對根際微生物群落定向調(diào)控結(jié)果，這體現(xiàn)出了水松植株與根際微生物之間的高度協(xié)調(diào)。宋賢沖等也得到了類似研究結(jié)果。微生物多樣性與群落的代謝能力息息相關，微生物多樣性指數(shù)顯示，春季和夏季的水松根際微生物群落多樣性優(yōu)于秋季和春季。水松根際微生物群里碳代謝特征的主成分分析結(jié)果表明，季節(jié)因素對水松根際微生物群落碳代謝特征存在顯著影響。冗余分析結(jié)果顯示，速效氮含量對水松根際微生物碳代謝特征影響最大，即速效氮含量是微生物碳代謝特征變化的主要驅(qū)動因子。

4 結(jié)論

水松根際微生物群落多樣性和碳代謝能力在夏季最優(yōu)，在冬季最差，季節(jié)因素顯著影響著根際微生物群落結(jié)構(gòu)和功能。因此在開展水松根際微生態(tài)相關研究時應充分考慮到季節(jié)因素造成的波動，以增強研究結(jié)果的代表性。本研究首次揭示了不同季節(jié)水松根際微生物群落結(jié)構(gòu)和碳代謝特征，填補了水松在根際微生態(tài)領域研究的空白，為水松在根際微生態(tài)領域的進一步研究提供了有益理論依據(jù)。

（責任編輯：張研）

基金項目：國家自然科學基金（31500443）；福建省自然科學基金（2022J01139）；福建省財政林業(yè)科技研究項目（2023FKJ26）；福建農(nóng)林大學科技創(chuàng)新專項（KFb22046XA、KJb22019XA）；福建農(nóng)林大學生態(tài)學一流學科建設項目資助。