高位池和工廠化養(yǎng)殖模式下斑節(jié)對(duì)蝦肝胰腺和腸道微生物特征分析

摘 要：為闡述在不同養(yǎng)殖模式下斑節(jié)對(duì)蝦（非洲群體）（Penaeus monodon）肝胰腺和腸道微生物的特征，基于高通量測(cè)序、Biolog ECO技術(shù)探討了高位池和工廠化養(yǎng)殖模式下斑節(jié)對(duì)蝦肝胰腺、腸道菌群結(jié)構(gòu)特征及腸道微生物代謝活性。高通量測(cè)序結(jié)果顯示，高位池養(yǎng)殖模式下對(duì)蝦腸道菌群多樣性及豐富度顯著高于工廠化養(yǎng)殖模式，且同類樣本距離較近，體現(xiàn)了不同模式對(duì)蝦樣品中物種的異質(zhì)性和多樣性。不同樣品中的細(xì)菌門類及相對(duì)豐度結(jié)果顯示，對(duì)蝦腸道菌群的優(yōu)勢(shì)菌門包括變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、放線菌門（Actinobacteria）等，其中比例最高的是變形菌門；在屬水平上，工廠化養(yǎng)殖模式中相對(duì)豐度最高的是發(fā)光桿菌屬（Photobacterium），高位池養(yǎng)殖模式中相對(duì)豐度最高的是紅桿菌屬（Rhodobacterium）和弧菌屬（Vibrio）?；赨nifrac距離的生態(tài)聚集分析結(jié)果顯示，生態(tài)聚集過(guò)程應(yīng)該與環(huán)境特征和養(yǎng)殖策略有直接的關(guān)系。腸道微生物代謝活性總體變化趨勢(shì)結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，72 h前微生物整體代謝活性呈現(xiàn)快速增加趨勢(shì)，隨后變緩并逐漸趨于平穩(wěn)；不同養(yǎng)殖模式下斑節(jié)對(duì)蝦腸道微生物代謝碳源種類和活性具有顯著差異。

關(guān)鍵詞：斑節(jié)對(duì)蝦；肝胰腺；腸道微生物；高通量測(cè)序；代謝活性

斑節(jié)對(duì)蝦（非洲群體）（Penaeus monodon）又稱金剛蝦、斑節(jié)王、草蝦王，隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼綱、十足目、對(duì)蝦科、對(duì)蝦屬，其體長(zhǎng)側(cè)扁、略呈梭形，體色鮮亮且較深，頭胸甲厚實(shí)，屬雜食性動(dòng)物，適宜在水溫25～32 ℃、鹽度30左右的沙底質(zhì)環(huán)境中生活。該蝦抗病能力較強(qiáng)，適宜工廠集約化、高位池、池塘等多種養(yǎng)殖模式 ^［1］。

工廠化養(yǎng)殖模式是一種高投入、高產(chǎn)出的新型養(yǎng)殖模式 ^［2］，因其對(duì)環(huán)境友好、節(jié)能、節(jié)水等優(yōu)勢(shì)特征被應(yīng)用較多 ^［3-5］。目前工廠化養(yǎng)殖主要有設(shè)施化養(yǎng)殖、流水養(yǎng)殖、半封閉循環(huán)水養(yǎng)殖和全封閉循環(huán)水養(yǎng)殖等幾種類型。但是，對(duì)蝦工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖往往初期投入大，能耗和運(yùn)行成本較高，在現(xiàn)階段我國(guó)的國(guó)情下較難立足。發(fā)展對(duì)蝦工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖必須立足各地不同的環(huán)境條件，借鑒現(xiàn)有經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行開(kāi)發(fā)。高位池養(yǎng)殖模式是推動(dòng)中國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)恢復(fù)和發(fā)展的重要模式，目前在我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中占據(jù)重要地位 ^［6］。高位池是1個(gè)半人工半天然的生態(tài)系統(tǒng) ^［7］，對(duì)蝦與殘飼、糞便、生物遺骸等在其中相互作用，通過(guò)跟蹤監(jiān)測(cè)微生物狀況等方法可探索不同區(qū)域?qū)ξr養(yǎng)殖模式和養(yǎng)殖效果之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系 ^［8-10］，最終促進(jìn)系統(tǒng)（氣候環(huán)境、養(yǎng)殖環(huán)境、生理環(huán)境、用藥環(huán)境）的健康循環(huán)。

對(duì)蝦腸道是動(dòng)物機(jī)體獲得外界能量、參與外界基礎(chǔ)物質(zhì)循環(huán)的主要“場(chǎng)所”，甚至被稱為機(jī)體的“第二大腦”。腸道菌群是寄居在腸道內(nèi)的龐大微生物群，與宿主呈相互依存、相互制約的共生狀態(tài) ^［11-12］。肝胰腺是對(duì)蝦健康生長(zhǎng)、代謝及免疫的前提基礎(chǔ)，其狀態(tài)不僅關(guān)系著機(jī)體對(duì)外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收，也影響著機(jī)體免疫系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。肝胰腺作為重要器官之一，同樣受到微生物菌群的影響。例如，弧菌的增加可能會(huì)改變肝胰腺的狀態(tài)結(jié)構(gòu)，提高疾病感染率 ^［13］；飼料等外源物質(zhì)的毒素亦可能損傷肝胰腺結(jié)構(gòu)，增加死亡率 ^［12］；對(duì)蝦肝胰腺還可以分泌各種消化酶，間接在免疫防御中發(fā)揮重要作用 ^［14］。

目前普遍認(rèn)為，肝臟與腸道是相互作用、相互影響的。有研究報(bào)道，對(duì)蝦肝胰腺病變的同時(shí)，機(jī)體腸道也會(huì)發(fā)生不同程度的病變 ^［15-16］。近年來(lái)，針對(duì)“腸-肝軸”的研究日益增多，關(guān)于條件性致病因素對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖物種致病機(jī)理的研究，特別是針對(duì)肝胰腺或者腸道免疫功能的研究越來(lái)越受到重視。動(dòng)物宿主微生物群對(duì)周圍生長(zhǎng)環(huán)境具有強(qiáng)烈的選擇性，機(jī)體微生物群和潛在的生態(tài)系統(tǒng)在生長(zhǎng)中會(huì)受到生物和非生物變異的影響，但其影響機(jī)制尚不清楚。本試驗(yàn)嘗試通過(guò)對(duì)蝦肝胰腺及腸道微生物的變化來(lái)反映養(yǎng)殖模式及環(huán)境的重要性，分析存在其中的密切而復(fù)雜的相互作用，以期為斑節(jié)對(duì)蝦健康養(yǎng)殖提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)動(dòng)物管理

試驗(yàn)在山東省濱州市無(wú)棣北海新區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行。分別采用高位池養(yǎng)殖和工廠設(shè)施化養(yǎng)殖兩種模式飼養(yǎng)斑節(jié)對(duì)蝦，其中高位池面積為337 m2/口，對(duì)蝦放養(yǎng)密度為300尾/m2；工廠設(shè)施化養(yǎng)殖池面積為36 m2/口，對(duì)蝦放養(yǎng)密度為600尾/m2。每種養(yǎng)殖模式設(shè)3口平行養(yǎng)殖池。

斑節(jié)對(duì)蝦（非洲群體）（以下簡(jiǎn)稱為“對(duì)蝦”）來(lái)自福建某養(yǎng)殖場(chǎng)，暫養(yǎng)后試驗(yàn)初始平均體質(zhì)量為（1.5±0.3）g。試驗(yàn)共進(jìn)行31 d（2021年7月2日—2021年8月1日）。試驗(yàn)水源為海水，經(jīng)砂濾、消毒后進(jìn)入蓄水池。試驗(yàn)水質(zhì)條件為：鹽度30.0±1.5，pH 7.8±0.5，水溫（28±1.5）℃，溶解氧（7.5±1.0）mg/L，氨氮＜0.5 mg/L。羅茨鼓風(fēng)機(jī)24 h充氣，每日上午10：00換水1次。每日投飼量為對(duì)蝦體質(zhì)量的8%～10%，分5次投喂（ 6：0 0、10：00、14：00、18：00、22：00），并根據(jù)當(dāng)日天氣、剩余飼料情況等進(jìn)行調(diào)整

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，采用5點(diǎn)取樣法在每口養(yǎng)殖池各采集100尾健康對(duì)蝦。隨即獲取其腸道內(nèi)容物和肝胰腺組織?；靹蚝笱杆僦糜谝旱袔Щ貙?shí)驗(yàn)室備用。樣品分為兩個(gè)部分，一部分用于 Biolog分析，另一部分用于DNA提取及高通量測(cè)序分析。

1.2.2 基因組DNA提取、擴(kuò)增、純化

采用E.Z.N.A.Stool DNA Kit提取對(duì)蝦肝胰腺及腸道內(nèi)容物微生物總基因組DNA，按照操作說(shuō)明方法進(jìn)行。提取得到的DNA經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并由超微量核酸蛋白分析儀（Biodropsis BD-1000）測(cè)定其濃度，于 -80 ℃保存作為模板使用。反應(yīng)體系為25 μL，包括基因組DNA模板50 ng，V3+V4區(qū)通用引物338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）各2.5 μL， Pusion Hot start flex 2×Master Mix 12.5 μL，補(bǔ)充ddH2O至25 μL。反應(yīng)條件為：98 ℃變性30 s，擴(kuò)增98 ℃ 10 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、純化后備測(cè)。

1.2.3 高通量測(cè)序及分析

純化后的產(chǎn)物由杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司通過(guò)文庫(kù)制備和庫(kù)檢后進(jìn)行Illumina MiSeq "2×300 bp paired-end上機(jī)測(cè)序。Miseq測(cè)序完成后，得到原始的下機(jī)數(shù)據(jù)，去除reads（讀長(zhǎng)）的barcode（樣品標(biāo)簽）和接頭序列，利用overlap將雙端數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，去除含有N（N表示無(wú)法確定堿基信息）的比例大于5%的tags（標(biāo)簽），去除低質(zhì)量tags（質(zhì)量值Q＜10的堿基數(shù)占所有tags的20%以上），通過(guò)質(zhì)控和過(guò)濾后，獲得高質(zhì)量的clean數(shù)據(jù)（有效數(shù)據(jù)）。對(duì)有效數(shù)據(jù)進(jìn)行97%的相似度聚類，采用CD-HIT將序列相似性大于97%的clean tags定為一個(gè)OUT（operational "taxonomy unit），過(guò)濾后獲得最終的OTU豐度及代表序列，進(jìn)一步進(jìn)行多樣性分析和差異分析等。分析內(nèi)容包括原始數(shù)據(jù)優(yōu)化及有效優(yōu)質(zhì)序列統(tǒng)計(jì)、OTU Venn圖、Alpha多樣性指數(shù)分析、基于weighted UniFrac距離PCoA分析、Rank- aboundance曲線分析、分類學(xué)豐度分析、物種差異分析。

1.2.4 ECO代謝活性分析

腸道微生物的整體代謝活性可通過(guò)平均吸光值（average well color development，AWCD）來(lái)分析，即計(jì)算一定時(shí)間內(nèi)微生物的整體代謝平均活性。本研究通過(guò)BiologTM的ECO測(cè)試板（ECO MicroPlate，USA）對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。ECO板含有3套31種不同碳源，其中氨基酸類6種、糖類10種、羧酸類7種、聚合物類4種、胺類2種和酚類2種（見(jiàn)表1）。將不同模式的對(duì)蝦腸道樣品混合物按照一定比例用0.9%生理鹽水稀釋后，倒在無(wú)菌加樣槽中，然后加樣于25 ℃預(yù)熱的ECO 96孔微板中，每孔加入150 μL；加好樣的微板加蓋后于28 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔24 h讀取各孔在590 nm波長(zhǎng)下的光密度，連續(xù)測(cè)定120 h，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。其計(jì)算公式為：

D=∑（Ci-R）/n （1）

式（1）中：D為平均吸光值，Ci為所測(cè)定的31個(gè)碳源孔的吸光值，R為對(duì)照孔的吸光值，n為培養(yǎng)基碳源總數(shù)（本試驗(yàn)中n=31）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

16S rDNA測(cè)序結(jié)果經(jīng)QIIME 2軟件分析獲得，數(shù)據(jù)庫(kù)包括RDP、Greengenes、NCBI 16S Microbial和Customized database。通過(guò)SPSS 20.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 序列質(zhì)量及特征分析

從每個(gè)樣本的測(cè)序下機(jī)原始數(shù)據(jù)整理發(fā)現(xiàn)，模糊堿基非常少，G+C堿基數(shù)量占比約53.0%，90.0%以上的堿基測(cè)定準(zhǔn)確率達(dá)99.9%，95.0%以上的堿基測(cè)定準(zhǔn)確率達(dá)99.0%（見(jiàn)表2）。因此，本次測(cè)序原始數(shù)據(jù)的平均質(zhì)量達(dá)到預(yù)期，可以進(jìn)行后續(xù)分析。

對(duì)蝦肝胰腺樣品高通量測(cè)序結(jié)果顯示，工廠化養(yǎng)殖模式下對(duì)蝦肝胰腺樣品高質(zhì)量序列平均為85 036條，有效序列數(shù)達(dá)到94.54%，樣本中有758個(gè)操作分類單元（OUT）；腸道樣品高質(zhì)量序列平均為80 759條，有效序列數(shù)達(dá)到90.17%，樣本中有906個(gè)OTU。高位池養(yǎng)殖模式下對(duì)蝦肝胰腺樣品高質(zhì)量序列平均為55 022條，有效序列數(shù)達(dá)到96.02%，樣本中有819個(gè)OTU；腸道樣品高質(zhì)量序列平均為81 455條，有效序列數(shù)達(dá)到 78.99%，樣本中有1 026個(gè)OTU。高位池養(yǎng)殖模式的OTU數(shù)量（相似度大于97%）多于工廠化養(yǎng)殖模式的。

2.2 不同養(yǎng)殖模式下對(duì)蝦肝胰腺和腸道菌群 Alpha多樣性特征分析

表3呈現(xiàn)了工廠化和高位池養(yǎng)殖對(duì)蝦腸道菌群Alpha多樣性特征，反映了不同模式下對(duì)蝦腸道菌群特征與模式環(huán)境的相互關(guān)系。從菌種豐富度指數(shù)（Chao1 index）、香農(nóng)指數(shù)（Shannon "index）、辛普森多樣性指數(shù)（Simpson index）等數(shù)據(jù)結(jié)果分析，高位池養(yǎng)殖模式的菌群多樣性和豐富度均大于工廠化養(yǎng)殖模式的。

圖1是使用97%相似度的OTU制作的稀釋曲線圖，表現(xiàn)了樣本中物種的豐富度，說(shuō)明本研究中測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性；折線圖橫軸上的長(zhǎng)度表示樣本中的可操作分類單元數(shù)量，平緩或陡峭現(xiàn)象反映均勻度大小，說(shuō)明高位池養(yǎng)殖模式下對(duì)蝦腸道和肝胰腺樣品中的菌落豐富度和菌落組成均勻度略高于工廠化養(yǎng)殖模式。對(duì)各個(gè)樣品細(xì)菌多樣性的相互關(guān)系進(jìn)行分析，并構(gòu)建Venn圖（見(jiàn)圖2），結(jié)果顯示，工廠化和高位池不同養(yǎng)殖模式下對(duì)蝦肝胰腺樣品中共有294個(gè)OTUs，腸道樣品中共有401個(gè)OTUs。差異可操作分類單元比較結(jié)果顯示，高位池養(yǎng)殖模式的OTUs多于工廠化養(yǎng)殖模式，說(shuō)明養(yǎng)殖模式與微生物菌群結(jié)構(gòu)存在必然的聯(lián)系。

2.3 不同養(yǎng)殖模式下對(duì)蝦肝胰腺和腸道菌群Beta多樣性特征分析

PCoA結(jié)果計(jì)算了weighted UniFrac距離（考慮了樣本之間物種類別差異以及各類別物種的豐富度差異），依據(jù)距離矩陣進(jìn)行主成分分析，與Alpha多樣性構(gòu)成不同菌群的異質(zhì)性（見(jiàn)圖3）。結(jié)果顯示，加權(quán)法橫坐標(biāo)PCoA1，貢獻(xiàn)率值為 86.08%；縱坐標(biāo)PCoA2，貢獻(xiàn)率值為13.81%，說(shuō)明不同養(yǎng)殖模式的對(duì)蝦樣品來(lái)自于不同的養(yǎng)殖環(huán)境，體現(xiàn)了不同物種的異質(zhì)性和多樣性，同類樣本距離較近，多樣性差異較小。

2.4 不同養(yǎng)殖模式下對(duì)蝦肝胰腺和腸道菌群組成分析

不同養(yǎng)殖模式下對(duì)蝦腸道及肝胰腺樣品中細(xì)菌群落的組成見(jiàn)圖4、圖5。從細(xì)菌門水平上分析（見(jiàn)圖4），不同樣品中的優(yōu)勢(shì)菌門包括變形菌門Proteobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、浮霉菌門Planctomycetes、放線菌門Actinobacteria、疣微菌門Verrucomicrobia、衣原體門Chlamydiae、厚壁菌門Firmicutes，其中占比最高的是變形菌門，工廠化養(yǎng)殖模式的相對(duì)豐度（肝胰腺98.22%，腸道 96.08%）顯著高于高位池養(yǎng)殖模式（肝胰腺 77.02%，腸道85.47%）。從細(xì)菌屬水平上分析（見(jiàn)圖5），工廠化養(yǎng)殖模式下相對(duì)豐度最高的是發(fā)光桿菌屬Photobacterium（肝胰腺96.40%，腸道89.07%），其次是紅桿菌屬Rhodobacter、弧菌屬Vibrio等，這些菌屬的豐度比例相對(duì)較低；高位池養(yǎng)殖模式下對(duì)蝦肝胰腺中相對(duì)豐度最高的是紅桿菌屬（33.04%），其次是假交替單胞菌屬Pseudoalteromonas（14.12%），對(duì)蝦腸道中相對(duì)豐度最高的是弧菌屬（48.45%），其次是紅桿菌屬（ 10.38%），而發(fā)光桿菌屬、魯杰氏菌屬Ruegeria等的豐度比例相對(duì)較低。為進(jìn)一步探索細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)與不同樣本之間的聯(lián)系，基于可分類的不同級(jí)別水平構(gòu)建了含系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)、樣品聚類關(guān)系樹(shù)的熱圖（heatmap）。分析表明，門、屬水平上細(xì)菌菌群進(jìn)化關(guān)系聚為兩大分支，其中工廠化模式肝胰腺和腸道菌群構(gòu)成一支，高位池模式構(gòu)成另一支，說(shuō)明不同養(yǎng)殖模式下的細(xì)菌群落聚類不同。

2.5 不同養(yǎng)殖模式下樣品細(xì)菌群落的生態(tài)分析

生態(tài)相似性（ecological resemblance）以計(jì)算不同樣本群落組成相似程度或距離（相異程度）為基礎(chǔ)，是處理多元生態(tài)數(shù)據(jù)的基本方法之一。

在Unifrac距離中，除了關(guān)注物種的存在與否及其豐度外，還將物種之間的進(jìn)化關(guān)系考慮在內(nèi)，距離0更側(cè)重于表示兩個(gè)群落的進(jìn)化分類完全一致。由表4可見(jiàn)，工廠化養(yǎng)殖模式下對(duì)蝦腸道與肝胰腺的微生物群落距離系數(shù)為0.05，生態(tài)相似度極高，工廠化養(yǎng)殖模式與高位池養(yǎng)殖模式對(duì)蝦腸道的微生物群落距離系數(shù)為0.44；工廠化養(yǎng)殖模式和高位池養(yǎng)殖模式下的對(duì)蝦肝胰腺微生物群落距離系數(shù)達(dá)到0.70，而且高位池養(yǎng)殖模式下對(duì)蝦肝胰腺微生物群落與工廠化養(yǎng)殖模式下對(duì)蝦腸道微生物群落的距離系數(shù)為0.66?？梢?jiàn)生態(tài)聚集過(guò)程應(yīng)該與環(huán)境和飲食有直接的關(guān)系。

2.6 不同養(yǎng)殖模式下腸道樣品代謝活性分析

由圖6可見(jiàn)，不同養(yǎng)殖模式下腸道微生物代謝活性總體變化趨勢(shì)相似，72 h內(nèi)微生物整體代謝活性呈現(xiàn)快速增強(qiáng)的趨勢(shì)，但隨時(shí)間的推移，吸光值上升趨緩，微生物代謝活性逐漸趨于平穩(wěn)。從總體代謝活性來(lái)看，高位池養(yǎng)殖模式下對(duì)蝦樣品微生物對(duì)其中6類主要碳源的利用情況由強(qiáng)到弱表現(xiàn)為：羧酸類gt;氨基酸類gt;糖類gt;聚合物類gt;胺類gt;酚酸類；工廠化養(yǎng)殖模式下則表現(xiàn)為：羧酸類gt;聚合物類gt;氨基酸類gt;糖類gt;胺類gt;酚酸類，平均吸光值均隨著時(shí)長(zhǎng)的增加而增強(qiáng)。

表5列出了兩種養(yǎng)殖模式中利用率較高的碳源，其中高位池養(yǎng)殖模式下利用率較高（AWCDgt;3.00）的糖類有3種，氨基酸類有2種，聚合物類有1種，羧酸類有1種，酚酸類和胺類相對(duì)較弱；工廠化養(yǎng)殖模式下利用率較高（AWCDgt;2.00）的糖類有5種，氨基酸類有2種，聚合物類有2種，羧酸類有3種，酚酸類和胺類相對(duì)較弱。

由圖7可見(jiàn)，不同養(yǎng)殖模式下微生物群落對(duì)底物碳源的利用種類和利用強(qiáng)度表現(xiàn)出差異的趨勢(shì)，兩種模式的微生物群落均對(duì)酚酸類的利用程度最小。

3 討論

3.1 高位池和工廠化養(yǎng)殖模式下對(duì)蝦腸道和肝胰腺微生物菌群結(jié)構(gòu)的差異

通過(guò)了解不同養(yǎng)殖模式對(duì)蝦肝胰腺和腸道微生物菌群的結(jié)構(gòu)特征，可預(yù)警宿主疾病狀態(tài)，影響制定宿主養(yǎng)殖過(guò)程的病害防控措施，從而降低養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)，提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。對(duì)蝦肝胰腺微生物主要來(lái)自周圍環(huán)境菌群的定植，腸道微生物群主要是由對(duì)蝦主動(dòng)選擇后定植共存 ^［17-19］，因此，養(yǎng)殖環(huán)境是決定或控制對(duì)蝦機(jī)體微生物菌群的決定性因素 ^［20-21］。本研究工廠化模式下對(duì)蝦肝胰腺和腸道優(yōu)勢(shì)菌主要是發(fā)光桿菌屬，原因可能是發(fā)光桿菌屬來(lái)源于養(yǎng)殖水體環(huán)境及飼（餌）料的機(jī)會(huì)菌，攝入后定植于對(duì)蝦機(jī)體內(nèi)成為共生菌、常居菌，在菌群結(jié)構(gòu)單一且外源營(yíng)養(yǎng)不充分的情況下，可通過(guò)合成和分泌多種初生和次生代謝產(chǎn)物來(lái)提供良好的生理環(huán)境，維持宿主常規(guī)的代謝規(guī)律。高位池養(yǎng)殖模式對(duì)蝦肝胰腺中相對(duì)豐度最高的是紅桿菌屬和假交替單胞菌屬，對(duì)蝦腸道中相對(duì)豐度最高的是弧菌屬，這些菌屬均是對(duì)蝦實(shí)際養(yǎng)殖過(guò)程中的條件致病菌，而且，腸道微生物群在一定程度上是受某個(gè)或某些外部因素（例如養(yǎng)殖水體的鹽度、溫度和溶解氧等）的影響，驅(qū)動(dòng)對(duì)蝦腸道微生物群的演替 ^［22-23］。有研究報(bào)道，水體環(huán)境中的硝酸鹽等物質(zhì)可以作為某些細(xì)菌的底物能源而促進(jìn)微生物菌群的結(jié)構(gòu)形成 ^［24］，水環(huán)境因子變化通過(guò)直接或間接的作用影響了對(duì)蝦肝胰腺的菌群結(jié)構(gòu)。這與本研究結(jié)果是一致的，可能是高位池養(yǎng)殖模式下對(duì)蝦養(yǎng)殖水體環(huán)境中的硝酸鹽濃度相對(duì)偏高，導(dǎo)致條件性致病菌的生長(zhǎng)富集，這些結(jié)果也為后續(xù)研究提供了思路。在高位池養(yǎng)殖模式下，養(yǎng)殖過(guò)程中要更多地關(guān)注弧菌相對(duì)豐度，在菌群結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討病害防控措施。從PCoA圖也可看出，不同養(yǎng)殖模式下菌群結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)關(guān)系可能與微生物的代謝差異有關(guān)，而代謝差異是由選擇不同碳源的差異引起的，這對(duì)于后續(xù)研究微生物代謝差異的限制性因子或碳源選擇偏好性提供了豐富的信息。

3.2 高位池和工廠化養(yǎng)殖模式下對(duì)蝦腸道和肝胰腺微生物菌群代謝活性的差異

群落水平多樣性（community-level "physiological profile）不僅要關(guān)注微生物對(duì)碳源利用模式，更要關(guān)注其中某一碳源的絕對(duì)利用情況，再結(jié)合其生態(tài)學(xué)意義，能更好地了解微生物群落代謝特征 ^［25］。ECO生態(tài)微板分析是根據(jù)微生物整體對(duì)單一碳源利用活性而進(jìn)行的一種不同微生物群體的差異分析方法，因其具有靈敏度高、分辨力強(qiáng)、無(wú)需分離純培養(yǎng)、測(cè)定簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)而被研究者們廣泛使用 ^［26-28］。本試驗(yàn)中，兩種養(yǎng)殖模式的水源均來(lái)自北海新區(qū)潮汐海水，水體理化性質(zhì)同源，AWCD總活性表現(xiàn)出相似的特征，表明在同一區(qū)域相似水體的不同養(yǎng)殖模式下微生物的代謝活性表征沒(méi)有太大差異。

微生物代謝能力可能影響環(huán)境中“廢物”的存在 ^［29-30］，由兩種養(yǎng)殖模式微生物對(duì)碳源的總體利用能力對(duì)比發(fā)現(xiàn)，相比工廠化養(yǎng)殖模式，高位池養(yǎng)殖模式的AWCD活性較高，表明高位池養(yǎng)殖模式下微生物群落對(duì)碳源的總體利用能力較強(qiáng)，原因可能是高位池養(yǎng)殖環(huán)境中浮游動(dòng)植物或無(wú)機(jī)鹽等物質(zhì)為對(duì)蝦腸道微生物提供了一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，加速了其對(duì)碳源的利用，而且其優(yōu)勢(shì)菌屬（弧菌屬和紅桿菌屬等）對(duì)羥基丁酸、蘋果酸等相應(yīng)底物的降解增多，這與優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)的結(jié)果相呼應(yīng)。此外，大功率增氧機(jī)等設(shè)備的使用，增加了高位池水層的攪動(dòng)，微生物AWCD總活性增強(qiáng)直觀地體現(xiàn)出微生物群落的反應(yīng)速度和營(yíng)養(yǎng)消耗效率。有研究報(bào)道，腸道微生物菌群中異養(yǎng)微生物的結(jié)構(gòu)和活性與碳源種類有很大的相關(guān)性 ^［31-32］。本研究中，兩種養(yǎng)殖模式下的微生物碳源代謝也呈現(xiàn)出選擇性差異，這可能與兩種模式的養(yǎng)殖策略相關(guān)。高位池養(yǎng)殖模式下投喂配合飼料相對(duì)較少，而配合其他改良底質(zhì)或調(diào)控水質(zhì)的微生態(tài)制劑較多，且高位池中天然餌料豐富，受自然環(huán)境的影響更直接，這些波動(dòng)性因素都可促使對(duì)蝦機(jī)體內(nèi)以及水體中微生物的差異繁殖，進(jìn)而導(dǎo)致微生物結(jié)構(gòu)及代謝活性的不同。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，微生物在碳源利用中對(duì)胺類和酚類的利用率較低，活性較弱，這一結(jié)果可為對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中微生物營(yíng)養(yǎng)需求的研究提供方向，并可在水質(zhì)調(diào)控方面為研究C/N平衡和物質(zhì)循環(huán)的微生物定向強(qiáng)化提供依據(jù)。

4 結(jié)論

斑節(jié)對(duì)蝦（非洲群體）在工廠化和高位池養(yǎng)殖模式下肝胰腺和腸道微生物的豐富度和多樣性呈現(xiàn)差異，高位池模式下菌群多樣性和相對(duì)豐度較高，體現(xiàn)了不同模式的異質(zhì)性和多樣性。在群落組成上，工廠化養(yǎng)殖模式下的優(yōu)勢(shì)菌屬是發(fā)光桿菌屬，高位池養(yǎng)殖模式下的優(yōu)勢(shì)菌屬是紅桿菌屬和弧菌屬。相同養(yǎng)殖模式的樣品相似性高于不同養(yǎng)殖模式，表明生態(tài)聚集過(guò)程應(yīng)該與養(yǎng)殖環(huán)境及飼養(yǎng)策略有直接的關(guān)系。微生物代謝活性結(jié)果表明，高位池和工廠化養(yǎng)殖模式下對(duì)蝦肝胰腺和腸道微生物的碳代謝能力有顯著的差異。該研究結(jié)果可為分析養(yǎng)殖系統(tǒng)微生物群落的調(diào)理和代謝活性提供理論支撐。

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Distribution characteristics of microorganisms in hepatopancreas and intestine of

Penaeus monodon under industrial and high-pond culture modes

YU Xiaoqing1， WANG Youhong1， BI Yijia2， WANG Xiaolu1， WANG Shuxian1，

GAI Chunlei1， XU La1， YE Haibin1， LI Li1， DIAO Jing1， LIU Xintian2， LIU Hongjun1， FAN Ying1

［1. Marine Science Research Institute of Shandong Province; Key Laboratory for

Disease Control in Mariculture of Shandong Province（National Oceanographic Center， Qingdao），

Municipal Engineering

Research Center of Aquatic

Biological Quality Evaluation and Application，

Qingdao

266104， China; 2. Weihai Oceanic Development Research Institute， Weihai 264200， China］

Abstract： To describe the characteristics of microorganisms in the hepatopancreas and intestine of Penaeus "monodon under different culture modes， the structural characteristics of the hepatopancreas and intestinal "microbiota and the metabolic activities of intestinal microorganisms of P. monodon under high-level pond and "industrial culture modes were investigated based on high-throughput sequencing and Biolog ECO technology. The results of high-throughput sequencing showed that the diversity and richness of intestinal microbiota in the "high-level pond culture mode were significantly higher than those in the factory culture mode， and the similar "samples were closer， reflecting the heterogeneity and diversity of species in the shrimp samples of different modes. The results of bacterial phyla and relative abundance in different samples showed that the dominant phyla of shrimp intestinal flora included Proteobacteria， Bacteroidetes， Planctomycetes， Actinobacteria， etc.， and the highest proportion was Proteobacteria. At the genus level， the highest relative abundance in the factory culture mode was Photobacterium， and the highest relative abundance in the high-pond culture mode was Rhodobacterium and "Vibrio. Based on the results of Unifrac distance ecological aggregation analysis， the ecological aggregation process should be directly related to environmental characteristics and breeding strategies. The metabolic activity of "intestinal microorganisms increased rapidly in first 72 hours， but then slowed down and stabilized gradually with time extends. The types and activities of intestinal microbial metabolic carbon sources of shrimp under different culture modes showed different trends.

Key words： Penaeus monodon; hepatopancreas; intestinal microbiome; high-throughput sequencing; metabolic activity