蘋果雙脫毒矮化自根砧苗繁育保存技術(shù)

摘" "要" "病毒病對蘋果產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展構(gòu)成極大威脅，采用科學(xué)繁育、保存方法，利用雙脫毒苗木建園是防治蘋果病毒病的核心技術(shù)。從雙脫毒、檢測、微繁、建脫毒圃、無毒接穗保存等方面總結(jié)了蘋果雙脫毒矮化自根砧苗木繁育與保存技術(shù)，以期為雙脫毒苗生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞" "雙脫毒苗;熱處理;蘋果矮化自根砧;微繁;接穗保存

病毒病是影響蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。據(jù)報道，病毒病對我國不同蘋果產(chǎn)區(qū)造成的減產(chǎn)達到20%～35%。引起蘋果病毒病的病毒類型較多，國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)并鑒定有39種病毒病類型侵染蘋果樹，我國蘋果產(chǎn)區(qū)已有17種，其中包含6種重點病毒類型，分別是蘋果銹果類病毒（ASSVd）、蘋果綠皺果類病毒（AGCV）、蘋果花葉病毒（AMV）3 種顯性病毒病和蘋果莖溝病毒（ASGV）、蘋果莖痘病毒（ASPV）和蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）3種潛隱性病毒。這6種病毒是目前蘋果苗脫毒檢測的對照依據(jù)。其中，潛隱病毒病相對于顯性病毒病發(fā)病和傳播能力更強，約占病毒病總發(fā)病的50%～80%，分布范圍也更廣，在我國的遼寧、陜西、吉林、山東等地都可以檢測到，給當?shù)靥O果產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展造成了嚴重制約。病毒一般通過昆蟲或螨類傳播或通過修剪嫁接工具傳播。重茬地建園的，以前殘留的根系或帶病的植株根系直接接觸也可以傳播病毒。蘋果樹通過接觸感染病毒病后，經(jīng)過一段時間侵染，隨樹液流動，病毒很快遍布植株體，影響蘋果樹正常生理機能，如光合作用、養(yǎng)分合成運輸?shù)?，從而引起生長緩慢、植株矮小、缺素等一系列問題，甚至造成產(chǎn)量品質(zhì)下降。目前尚無良藥、良法防控病毒病，解決苗木帶毒問題是最根本的辦法。生產(chǎn)無毒苗木首先要通過組織培養(yǎng)對品種和砧木脫毒，再使用嫁接繁育保存等技術(shù)獲得品種和砧木雙脫毒苗木。生產(chǎn)實踐表明，采用無病毒苗具有樹勢強、新梢生長量大、萌芽率高，早花、早果、豐產(chǎn)，果實品質(zhì)優(yōu)等特點。

矮化自根砧苗木有矮化效果明顯、早果性強的特點。蘋果矮化自根砧雙脫毒苗木生產(chǎn)流程大致可以分成五個部分：一是砧木與品種脫毒;二是檢測;三是微繁;四是建立脫毒圃;五是脫毒接穗保存。

1" "砧木與品種脫毒

1.1" "砧木與品種的嫩梢準備" "在蘋果生長季，分別從健壯的母體植株上采集長勢健康的矮化砧木（如M9T337、M26、GM256等）和栽培品種（如瑞雪、瑞香紅、秦脆等）的嫩梢，取前端3～5 cm。

1.2" "枝條消毒培養(yǎng)與無菌體系建立" "首先對砧木和品種接穗枝條嫩梢用酒精進行表面消毒處理，然后放到裝有MS營養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶內(nèi)，待3～5 d發(fā)芽1 cm后取前端0.5～2 mm的頂芽。得到的嫩梢頂芽先用75%酒精浸泡30 s，然后用滅菌水沖洗4次，再用無菌吸水紙吸干表面水分，浸入0.1%升汞中消毒10 min，再用滅菌水沖洗5次，用無菌吸水紙吸干表面水分，最后接種在配好的培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L）中進行無菌培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，組培苗自身的激素被消耗后，培養(yǎng)基中的激素對其生長起到至關(guān)重要的作用。

1.3" "剝?nèi)∏o尖與接種培養(yǎng)" "無菌培養(yǎng)20 d后，在超凈工作臺上用鑷子和解剖刀仔細剝開幼葉，小心切下帶最頂部生長點，長0.3～0.5 mm（帶1～2個生長點）的莖尖，將其放入調(diào)配好培養(yǎng)基（MS+6-BA 2 mg/L+IBA 0.5 mg/L+瓊脂7 g/L+30 g/L蔗糖）的培養(yǎng)瓶進行二次培養(yǎng)，培養(yǎng)成無菌瓶苗。此時需要用光強為2 000～3 000 lx的日光燈照明，10 h/d，溫度保持在25 ℃左右。

1.4" "熱處理鈍化" "熱處理脫毒的原理是利用正常的植物細胞和病毒對溫度忍耐極限的不同，經(jīng)過一定的溫度和時長的處理，使正常植物細胞生長速度快于病毒發(fā)展速度，從而讓新長出的幼嫩組織不帶毒。此方法對溫度和時間的掌控要求非常嚴格，溫度過高或時間過長會影響組培苗成活率，溫度過低或時間短又會影響脫毒效果。有報道顯示，34～38 ℃是合適的熱處理溫度，處理30 d后，組培苗存活率高達90%以上。具體操作方法：無菌瓶苗長到2 cm左右時，先放在34 ℃環(huán)境中生長7 d左右，再放在38 ℃環(huán)境中生長30 d左右。

1.5" "二次莖尖剝離" "熱處理一段時間后，先觀察并統(tǒng)計無菌瓶苗的存活率，在無菌臺的解剖鏡下，對還存活的無菌瓶苗進行莖尖采集（二次莖尖剝離），處理方法同第1次，得到0.2～1 mm長的莖尖（此時的莖尖經(jīng)過莖尖培養(yǎng)和熱處理，基本可實現(xiàn)無毒），再次轉(zhuǎn)移到原培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

2" "病毒檢測

組培苗高度達到2 cm后，采用SiO2吸附法提取RNA，采用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù)進行病毒檢測。

3" "微繁與生根

3.1" "無毒莖尖接種快繁" "經(jīng)過病毒檢測，得到理想的脫毒組培苗材料后，需要利用植物“克隆”技術(shù)進行微繁，以獲得大批量的無毒苗木。

操作方法：先在無菌操作臺上取下脫毒苗的莖尖，置于事先準備好的快繁培養(yǎng)基（MS+6-BA 0.8～1.5 mg/L+ IBA 0.1～0.3 mg/L+GA3 0.3 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L，采用該配方組培材料繁殖系數(shù)較高，且因玻璃化苗死亡的概率較?。┥线M行擴繁培養(yǎng)。

不同蘋果砧木和品種的擴繁培養(yǎng)基最佳配方存在差異。有研究表明，蘋果砧木M9T337的擴繁配方為MS+BA 0.8 mg/L+NAA 0.15 mg/L+IAA 0.05 mg/L時，其擴繁系數(shù)為5.4，較為適宜;B9、GM256砧木的擴繁配方為MS+BA 0.8 mg/L+NAA 0.05 mg/L+IAA 0.1 mg/L時，其擴繁系數(shù)分別為4.2、4.6;M26砧木擴繁配方為MS+NAA 0.15 mg/L+BA 0.5 mg/L+IAA 0.15 mg/L，其繁殖系數(shù)為4。

培養(yǎng)環(huán)境溫度25 ℃左右為宜，利用日光燈，光強1 800～2 500 lx下，14 h/d，培養(yǎng)1個月。此時培養(yǎng)瓶內(nèi)會分生大量不定芽或不定苗，在無菌操作臺上完成分瓶接種。

3.2" "生根培養(yǎng)" "分瓶接種后的瓶苗長到3 cm左右后，需要進行生根培養(yǎng)，即把瓶苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上使其繼續(xù)生長16～20 d，不定根長到1 cm。培養(yǎng)室溫度23±2 ℃，光強1 000～2 500 lx，日光燈照明，12 h/d。

一般認為適合蘋果的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IAA 1～1.5 mg/L+IBA 0.15～0.2 mg/L+瓊脂5.3 g/L+蔗糖20 g/L，pH值5.8。有研究表明，不同蘋果品種或砧木的最佳生根培養(yǎng)基存在較大差異，長富1號適合在1/2MS+IBA1.5 mg/L培養(yǎng)基上生根;早喬納金適合在1/2MS+IBA 1 mg/L培養(yǎng)基上生根。培養(yǎng)基中IBA的濃度對生根率有很大影響，其值在1～1.5 mg/L范圍內(nèi)生根效果好。培養(yǎng)基中IAA的濃度對蘋果無菌瓶苗生根效果影響不大。但有研究表明，在王林、5D2-36和秦月等品種的生根培養(yǎng)基中加入0.5 mg/L IBA，其無菌瓶苗生根效果最好，蜜脆在0.7 mg/L" IBA培養(yǎng)基中生根率高。

3.3" "溫室馴化穴盤苗" "生根培養(yǎng)過程中，當根系生長到理想狀態(tài)，就得到了完整的無毒組培苗。此時即可開始苗木馴化。先在溫室內(nèi)讓生根瓶苗帶蓋生長1周，然后打開瓶蓋生長4 d左右。將苗從培養(yǎng)瓶中取出，放到干凈的托盤中，用凈水沖洗掉根上粘連的培養(yǎng)基，放入0.1%多菌靈溶液中3 s，防止病菌感染。最后將苗小心移栽到消過毒的營養(yǎng)盤內(nèi)。待苗生長到5片葉時，轉(zhuǎn)移到溫室外的遮陽網(wǎng)下適應(yīng)3～5 d，逐漸從弱光到強光、變溫（18～35 ℃）適應(yīng)自然環(huán)境。

4" "建脫毒圃

4.1" "建立脫毒品種、砧木母本采穗圃" "經(jīng)過馴化，即可得到正常的無毒品種和砧木苗。3月下旬至5月上旬將其定植到防蟲網(wǎng)室中（防止昆蟲傳毒），分別建立砧木和品種母本脫毒采穗圃。在苗圃生長50 d 左右，苗木粗度達到0.6 cm以上，芽體成熟，就可以提供母本采穗圃無毒苗木接穗。為保證采穗圃的純度，母本脫毒采穗圃每3～5年進行更新。

4.2" "建立雙脫毒苗圃" "經(jīng)過溫室和溫室外馴化鍛煉的矮化砧（如M9T337、M26、GM256）穴盤苗，于3月下旬至5月上旬移栽到育苗圃中，當作繁育矮化自根砧苗的砧木，8月或翌年4月用脫毒品種的接穗（一般在脫毒母本采穗圃中采集）嫁接到砧木上，即可得到矮化雙脫毒苗木。注意嫁接操作中的嫁接刀要嚴格消毒，最好專用。

嫁接好的芽苗生長1～2年后出圃。采穗圃和育苗圃內(nèi)都采用寬窄行栽植，寬行距60～80 cm，窄行距20～30 cm，株距5～10 cm。

5" "無毒接穗的保存

無毒接穗的保存環(huán)節(jié)非常關(guān)鍵，對后期嫁接成活率有很大影響，既要保護接穗芽體的生命力，又要防止感染病毒。

5.1" "無毒接穗的采集" "接穗采集一般在冬季果樹休眠期進行，此時芽體養(yǎng)分已完成回流，芽體成熟度高、質(zhì)量好。蘋果樹正常落葉后，從脫毒苗圃中對應(yīng)品種編號尋找到已脫毒的母本樹，確保品種純正。選擇樹勢健壯、芽體飽滿、無病蟲害的1年生枝條。在母本樹上采集接穗時，要留5 cm左右短樁，確保下個生長周期能發(fā)出更多的有效接穗。采好接穗后要對接穗進行整理，先去掉基部老化彎曲、芽體瘦弱的部分，再去掉梢部幼嫩部分，去掉沒有自然脫落的葉片和其他異物，浸泡在0.1%多菌靈溶液中30 s，取出晾干，用蠟液密封住接穗兩端的剪口。封蠟后按照接穗長短分類，一般分為長、中、短三類，每50根為1捆，掛上標簽牌，寫明是否無毒、采集地點、品種、數(shù)量等信息。

5.2" "無毒接穗的保存" "無毒接穗的采集和保存要與一般接穗?yún)^(qū)分開，不僅采集工具要單獨使用，接穗也要單獨存放。想要穩(wěn)妥且長期存放，可選擇冷庫或冷柜，溫度-4～0 ℃，濕度70%～80%。先制作無毒濕沙或濕鋸末，濕度以手握成團、松手即散為宜。將接穗放置在濕沙或濕鋸末中，保證接穗周圍有10 cm包裹。

6" "果園管理注意事項

建園時嚴禁選擇重茬地，防止苗木從土壤中感染病毒。所有接穗都應(yīng)來自網(wǎng)室脫毒采穗圃，以保證無病毒砧木和品種的純度。雙脫毒接穗采集和嫁接時要對刀剪等工具進行酒精消毒處理，防止工具傳毒，最好使用脫毒苗專用刀具。果樹生長期間重點防治蝽類、蚜蟲類、葉蟬類、螨類等刺吸式害蟲，防止害蟲傳毒。修剪期和腐爛病刮治期，要將修剪刀鋸、刮刀等工具進行消毒處理，最好做到工具專用。后期若發(fā)現(xiàn)品種不良，需要高接換種，還應(yīng)選擇脫毒且保存完好的接穗。

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