采用Cell-SELEX技術的核酸適配體在腫瘤靶向治療的研究進展

摘要： 闡述細胞-配體指數(shù)富集系統(tǒng)進化（Cell-SELEX）技術特點，以及通過該技術篩選得到的核酸適配體在腫瘤靶向治療中的應用進展和挑戰(zhàn)，通過查閱近年的相關文獻，綜述核酸適配體作為藥物及藥物載體在腫瘤靶向治療中的應用研究進展。結果表明：基于Cell-SELEX技術篩選得到的核酸適配體在腫瘤靶向治療中的療效顯著，可開發(fā)成為腫瘤靶向治療的潛力藥物及良好的藥物載體。

關鍵詞： 核酸適配體； 細胞-配體指數(shù)富集系統(tǒng)進化（Cell-SELEX）技術； 腫瘤； 靶向治療

中圖分類號： R 944文獻標志碼： A"" 文章編號： 1000 5013（2024）04 0439 06

Research Progress of Aptamers Using Cell-SELEX Technology in Cancer Targeted Treatment

CHENG Zhiyun， CHEN Jiayi， BAI Ruyu， YANG Huiyong， MOHSAN Ullah， DIAO Yong

（School of Medicine， Huaqiao University， Quanzhou 362021， China）

Abstract： "The characteristics of cell-systematic evolution of ligands by exponential enrichment （Cell-SELEX） technology as well as the application progress and challenges of screened aptamers in cancer-targeted treatment through this technology were expounded. And the research progress about cancer-targeted treatment applications of aptamers as drugs or drug carriers were reviewed by consulting relevant literature in recent years. The results show that the aptamers screened based on Cell-SELEX technology have significant therapeutic effects and can be developed as potential drugs and good drug carriers in cancer-targeted treatment.

Keywords： aptamers； cell-systematic evolution of ligands by exponential enrichment （Cell-SELEX） technology； cancer； targeted treatment

核酸適配體又稱適配子、適體、化學抗體，是通過配體指數(shù)富集系統(tǒng)進化（SELEX）技術篩選獲得的能與靶分子專一、高效結合的單鏈脫氧核糖核酸（ssDNA）或核糖核酸（RNA），一般由20～80個堿基構成。與傳統(tǒng)蛋白抗體相比，核酸適配體具有制備方便、穩(wěn)定性好、靶標廣泛、無免疫原性、易滲透入組織內(nèi)部等多項獨特優(yōu)勢。

20多年來，核酸適配體在多個領域得到了普遍關注和廣泛應用，大量疾病相關分子的核酸適配體被篩選出來，并被應用于疾病診斷及藥物研發(fā)。" 第1個核酸適配體藥物Pegaptanib（商品名為Macugen）已于2004年通過美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準上市［1］， 它是針對血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）設計，用于治療老年性黃斑變性，成為核酸適配體研究領域的一個里程碑。由于癌變細胞基因突變，其表面分子類型及表達水平發(fā)生變化，故篩選得到的核酸適配體具有高度的腫瘤細胞特異性，從而在腫瘤的早期診斷和靶向治療中顯示出巨大的潛能和優(yōu)越性。

腫瘤相關蛋白如蛋白酪氨酸磷酸酶受體、血小板源性生長因子（PDGFR）、蛋白酪氨酸激酶7（PTK7）、核轉(zhuǎn)錄因子kB、VEGF、整合素α4、高密度脂蛋白結合蛋白、應激誘導磷蛋白1、c-Kit 蛋白、唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素5、組織蛋白酶D、酪氨酸蛋白激酶蛋白117（CD117）、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體CD71（CD71）、白細胞分化抗原109（CD109）等的核酸適配體已被篩選出并應用于腫瘤診斷及治療中［2-7］，這些核酸適配體大部分是通過細胞-配體指數(shù)富集系統(tǒng)進化（Cell-SELEX）技術篩選得到，得到的核酸適配體可直接用于腫瘤的靶向治療，也可作為腫瘤治療藥物的載體。基于此，本文對采用Cell-SELEX技術的核酸適配體在腫瘤靶向治療的研究進展進行綜述。

1 Cell-SELEX技術及其特點

Cell-SELEX是一種將整個活細胞作為靶標篩選核酸適配體的技術。目前，常用腫瘤細胞作為正篩靶標，相應正常細胞作為反篩靶標，從而得到腫瘤細胞特異性核酸適配體。

1.1 篩選的基本步驟

核酸適配體的篩選有以下5個步驟。

步驟1 將 ssDNA隨機文庫與腫瘤細胞孵育，進行正向篩選。

步驟2 洗滌細胞，去除未結合的ssDNA，然后高溫加熱，離心得到與靶細胞結合的ssDNA。

步驟3 將得到的ssDNA與對應正常細胞孵育，進行反向篩選，去除與腫瘤細胞非特異性結合的ssDNA。

步驟4 將步驟3未結合的ssDNA作為模板，進行大規(guī)模不對稱聚合酶鏈式反應（PCR）擴增，分離單鏈，得到次級文庫，用于下一輪篩選。

步驟5 步驟1～4循環(huán)，一般經(jīng)過15～20輪正向與反向篩選，即可得到與腫瘤細胞特異性結合的ssDNA，即特異性核酸適配體（圖1）。然后，克隆、測序，對篩選得到的核酸適配體進行親和力等特性檢測并驗證。

1.2 Cell-SELEX技術特點

相較于SELEX技術篩選得到的核酸適配體，以整個活細胞為靶標篩選得到的核酸適配體具有多種獨特優(yōu)勢，Cell-SELEX技術不需了解靶分子的種類、數(shù)量、分布及構象，使工作量減少；Cell-SELEX技術以整個活細胞為靶標，可實現(xiàn)多靶點的篩選。

腫瘤Cell-SELEX 技術的核心是利用任意兩種完整活細胞膜表面所有分子水平之間的差異（不是單個或幾個純化的靶分子） 來篩選能特異性識別靶細胞的核酸適配體，從而準確地區(qū)分正常細胞和腫瘤細胞［8］。

Calzada等［9］通過對急性T淋巴細胞白血病前體細胞CCRF-CEM的篩選，得到核酸適配體sgc8，通過質(zhì)譜分析證實其靶蛋白為PTK7，與正常骨髓細胞相比，PTK7在CCRF-CEM上特異性高表達，在白血病發(fā)展過程中起重要作用，利用AlexaFluor647和6-hydrazinonicotinamide兩種熒光染料標記該適配體，在荷瘤小鼠中成功對黑色素瘤和淋巴瘤細胞進行標記，表明Cell-SELEX技術用于篩選腫瘤細胞特異性核酸適配可行、可靠。

Dharmasiri等［10］用前列腺特異性膜抗原適配體捕獲前列腺癌細胞，得到高達96%的捕獲率。同時，Xu等［11］利用固定的核酸適配體在“S”形微流體裝置中富集多種血漿中低濃度的腫瘤細胞，細胞純度可達96%。這些研究顯示腫瘤細胞特異性核酸適配體具有高親和力、靶向性和區(qū)分細胞的能力，為此技術用于腫瘤靶向、精準治療提供了依據(jù)。

2 經(jīng)Cell-SELEX技術篩選的核酸適配體在腫瘤治療中的應用

在腫瘤治療中，特異性靶向藥物具有治療效果顯著、毒副作用低的優(yōu)點，采用Cell-SELEX技術篩選得到的核酸適配體具有高度的腫瘤特異性，在腫瘤靶向治療方面有巨大的潛能。

2.1 Cell-SELEX技術篩選核酸適配體直接作為靶向藥物

與抗體藥物相比，核酸適配體藥物因具有高穩(wěn)定性、耐高溫、低免疫原性、低成本、短周期等優(yōu)點而備受關注，針對腫瘤細胞和正常細胞表達差異的VEGF、核仁素、細胞粘合素C等蛋白的核酸適配體藥物已陸續(xù)篩選出來［12］。然而，Cell-SELEX技術開發(fā)和應用之后，更多更具意義的腫瘤標志物被鑒定出來，相應的核酸適配體藥物也隨之開發(fā)。Rong等［13］以具有轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細胞MHCC97L作為模型，以具有高轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細胞HCCLM9為對象，采用Cell-SELEX技術進行篩選，得到特異性適配體LY-1。LY-1可直接作用于HCCLM9，體外實驗表明HCCLM9遷移和侵襲性能降低，而體內(nèi)實驗表明HCCLM9抑制了腫瘤的生長。核酸適配體還可作為信號分子影響細胞生長、凋亡相關信號通路。Cerchia等［14］采用Cell-SELEX技術篩選得到了分泌腺腫瘤的核酸適配體，其靶標為人受體酪氨酸激酶RET，識別RET胞外結構域，不但能抑制RET的激活，還能有效抑制RET介導的信號通路，影響細胞生長和分化，起到治療作用，又將惡性人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系U87MG作為正向篩選細胞，將致瘤性差的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系T98G作為反向篩選細胞，得到U87MG的特異核酸適配體，其可通過抑制細胞增殖中關鍵分子ERK1/2和cyclin D1的活性，影響胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導從而抑制腫瘤細胞增殖。上述研究為以膜受體為靶點進行腫瘤治療提供了方法。Zueva等［15］根據(jù)惡性倉鼠細胞細胞系HET-SR-1（HM）和HET-SR（LM）致瘤性和生長性相同，但前者體內(nèi)更容易轉(zhuǎn)移的特性，采用Cell-SELEX技術將HM作為正向篩選靶標，LM作為反向篩選靶標，得到兩個特異性結合高侵襲細胞系HM的核酸適配體E10和E37。實驗表明，E10主要作用于細胞膜，而E37作用于細胞內(nèi)，兩者通過改變酪氨酸激酶的磷酸化抑制腫瘤細胞的遷移，抑制率高達85%，僅E10對腫瘤細胞也有高達75%的侵襲抑制率。E37雖不具有抑制遷移的作用，但其可被細胞攝取的特性能用于胞內(nèi)成像和藥物傳遞。同時，研究人員發(fā)現(xiàn)E10和E37無論是對人乳腺癌細胞系MDA-MB231，還是小鼠永生成纖維細胞系NIH3T3都沒有結合作用，表明不同種屬或同種屬不同器官的腫瘤細胞具有不同的轉(zhuǎn)移相關分子，進一步說明了采用Cell-SELEX技術可篩選出針對特定腫瘤細胞的高特異性核酸適配，靶向性精確，不會對其他細胞造成損傷。核酸適配體和傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合使用，可達到協(xié)同增效的目的，如以非小細胞肺癌細胞A549為靶標，通過Cell-SELEX技術獲得能以高親和力結合表皮生長因子受體（EGFR）的核酸適配體CL4，它可通過抑制EGFR活性及其介導的信號通路誘導EGFR陽性腫瘤細胞的凋亡，但對EGFR陰性細胞沒有作用。A549細胞對EGFR常用抑制劑吉非替尼和西妥昔單抗顯示耐藥性，體外和小鼠體內(nèi)移植瘤實驗證明，聯(lián)合使用CL4和西妥昔單抗在誘導細胞凋亡方面有協(xié)同作用［16］。Mahlknecht等［17］篩選得到N87胃癌細胞異常分子ErbB-2/HER2的核酸適配體2-2（t），實驗表明，其在體外具有抑制癌細胞生長，體內(nèi)有降低人胃癌移植瘤生長率的作用，抑瘤效果為ErbB-2/HER2單克隆抗體的兩倍。以埃利希氏腹水癌細胞為陽性細胞，采用Cell-SELEX技術經(jīng)過10輪篩選，得到核酸適配體AS-14和AS-9，體外細胞實驗表明，AS-14對腺癌細胞具有誘導凋亡的作用，AS-9具有抑制增殖的作用，AS-14對應的靶標為腫瘤發(fā)展和細胞增殖過程中的關鍵分子filamin A，AS-9的靶標為線粒體ATP合成酶α亞基，為線粒體氧化磷酸化的重要組成部分［18］。Camorani等［19］采用Cell-SELEX技術，以惡性膠質(zhì)瘤細胞為靶標，經(jīng)過14輪篩選得到可特異性結合于PDGFRβ胞外結構域的核酸適配體Gint4.T，其可抑制人膠質(zhì)瘤細胞上PDGFR的激活及下游信號的傳遞，在體內(nèi)Gint4.T通過抑制腫瘤細胞增殖和遷移，抑制腫瘤的生長。聯(lián)合應用適配體Gint4.T與CL4抑腫瘤效果增強，說明靶點不同的核酸適配體可聯(lián)合使用，多靶點抑制腫瘤生長。

通過以上研究可知，針對腫瘤細胞的Cell-SELEX技術篩選核酸適配體切實可行，且篩選得到的適配體對腫瘤靶的向性高，抑制作用顯著。適配體通過對腫瘤細胞表面失調(diào)分子的抑制，進一步調(diào)控下游信號通路來影響腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲等活動，以實現(xiàn)抗腫瘤作用。此外，核酸適配體之間或和其他藥物聯(lián)合用藥，可發(fā)揮協(xié)同作用，抑瘤效果增強。

2.2 Cell-SELEX技術篩選核酸適配體作為藥物靶向載體

采用Cell-SELEX技術篩選得到特異識別腫瘤細胞的核酸適配體，將其與抗腫瘤單克隆抗體、siRNA、脂質(zhì)體、膠束、納米粒和納米管等具有抗腫瘤作用的藥物通過物理結合或化學鍵合，定點導向于腫瘤細胞，藥物特異性地在腫瘤細胞周圍或細胞內(nèi)富集，藥物濃度增加，停留時間延長，可提高治療效力。

2.2.1 核酸適配體偶聯(lián)藥物 核酸適配體和藥物偶聯(lián)的方式有化學的共價結合和物理的分子間相互作用力結合兩種方式，將藥物靶向遞送到腫瘤細胞。Esposito等［20］采用Cell-SELEX技術篩選得到可特異性結合CD19蛋白的核酸適配體B85.T2，其對純化的人重組CD19糖蛋白的解離常數(shù)為（49.9±13.0） nmol·L-1，可特異性結合表達CD19的慢性淋巴細胞白血病細胞，且能夠內(nèi)化進入CD19陽性細胞，和miRNA互補雜交非共價偶聯(lián)后處理腫瘤細胞，顯著抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，說明適配體靶向性運載藥物到腫瘤細胞是可行的。Meraviglia-Crivelli等［21］構建AS1411 和RNAi綴合物AS1411-SMG1 AsiCs，無論是局部給藥還是系統(tǒng)給藥，結合體都可顯著抑制腫瘤生長，且無毒副作用。

適配體與蛋白偶聯(lián)是通過適配體的核苷酸與蛋白質(zhì)中氨基酸側鏈的氫鍵、鹽橋、范德華力等非共價鍵相互作用。植物毒素Gelonin可通過破壞rRNA的糖苷鍵，阻斷蛋白質(zhì)的合成，有效殺死腫瘤細胞，但其缺少移位結構域，不易入胞達到有效的殺傷濃度。Kelly等［22］將Gelonin蛋白與核酸適配體A9偶聯(lián)，不但克服了Gelonin不易入胞的缺點，其對前列腺癌細胞的殺傷力是單用Gelonin的180倍，還減少了其對正常細胞的毒性，適配體扮演了“護衛(wèi)”的角色。

Qiao等［23］以紫杉醇耐藥的食管鱗狀細胞癌（ESCC）細胞系為靶標，采用Cell-SELEX技術篩選靶向阻抑素-2的核酸適配體SYL-6。阿霉素（Dox）能夠嵌入DNA的-GC-富集區(qū)域阻斷DNA復制導致細胞死亡，是常用腫瘤化療藥物，將Dox插入SYL-6中，通過非共價結合形成SYL-6-Dox偶聯(lián)藥物，體內(nèi)實驗證明，SYL-6-Dox組可顯著抑制腫瘤生長，且副作用較Dox單獨用藥組更低，說明核酸適配體SYL-6可作用化療藥物的有效載體。研究人員采用Cell-SELEX技術篩選得到靶向蛋白酪氨酸激酶7（PTK7）的核酸適配體sgc8c，sgc8c通過PH敏感的腙鍵共價連接Dox，形成sgc8c-Dox絡合物，在腫瘤組織的酸性微環(huán)境中，腙鍵斷裂，靶向釋放藥物到目標組織［24］。

2.2.2 核酸適配體-生物材料結合 將包裹紫杉醇的聚乙二醇納米粒子與適配體Apt（S1.5）連接形成復合物Apt（S1.5）-PTX-NP，Apt（S1.5）靶向乳腺癌中高度表達的乙酰肝素酶。相較于非靶向的PTX-NP，復合物具有更強的抗侵襲和抗血管生成能力，是一種有前途的三陰性乳腺癌治療的靶向藥物［25］。

脂質(zhì)體是一種將藥物包裝于脂質(zhì)或類脂質(zhì)雙分子層內(nèi)形成的微型囊泡，AS1411適配體可以特異性地與癌細胞表面過表達的核仁蛋白結合，研究人員將AS1411 核酸適配體偶聯(lián)脂質(zhì)體靶向結直腸癌細胞，遞送siRNA干擾COL1A1基因表達，提高了腫瘤細胞對化療藥物的敏感性［26］。研究還發(fā)現(xiàn)核酸適配體可以增強腫瘤細胞對藥物的敏感性，AS1411與金納米粒子連接，S1411適配體增強了金納米顆粒向癌細胞的傳遞，并增強了輻射誘導的癌細胞死亡［27］，為適配體的又一臨床應用提供了依據(jù)。Wang等［28］利用紅細胞膜制備囊泡包裹siRNA和阿霉素，用于治療多藥耐藥的腫瘤。修飾在囊泡上的適配體賦予了囊泡腫瘤靶向能力，通過P-gp沉默和Dox誘導的生長抑制作用，成功克服耐藥問題，協(xié)同殺傷腫瘤細胞。這種靶向思路為腫瘤耐藥提供了一種克服策略。

適配體不僅可做載體，特異性核酸適配體還能募集免疫細胞調(diào)動自身免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞進行殺傷，Boltz等［29］采用Cell-SELEX技術，以CD16陽性的Jurkat細胞為正向篩選細胞，得到的核酸適配體成功將NK細胞募集靶向定位于人肺癌細胞EBC-1、人胃癌細胞GTL-16和MKN-45，說明采用Cell-SELEX技術篩選高特異性核酸適配體不僅可作為腫瘤靶向治療藥物或藥物運載體，還可以募集免疫細胞趨于癌變細胞，為腫瘤的免疫治療提供了新的策略。

3 總結與展望

核酸適配體由于高特異性、親和性、易體外合成等優(yōu)點，廣泛應用于蛋白檢測、生物傳感器和藥物篩選中，而采用Cell-SELEX技術可篩選靶向腫瘤細胞表面未知蛋白的核酸適配體，進而用于腫瘤細胞的富集、檢測、成像及腫瘤治療［30］。采用Cell-SELEX技術篩選適配體用于腫瘤的靶向治療日益受到關注，并已在體內(nèi)和體外研究中顯示出對腫瘤細胞的高靶向作用。采用Cell-SELEX技術，實驗室可以篩選高親和力和特異性的靶向劑，使之成為一種有前途的研究工具，也是應用適配體到個體化診斷和醫(yī)學應用的第一步。在多年的研究中，研究人員已經(jīng)克服了適配體應用中的多個缺點，但在腫瘤靶向治療這一領域，核酸適配體仍然面臨多方面的挑戰(zhàn)。首先，在技術層面，Cell-SELEX技術以活細胞為靶標，篩選過程受細胞生長溫度改變、死細胞、細胞表面分子結構改變等因素的影響，導致假陽性甚至篩選失敗，研究人員雖通過技術避免這個問題，但其仍是Cell-SELEX技術的困擾。其次，核酸適配體作為靶向藥物而言，對細胞功能性方面的研究較少，核酸適配體作為靶向遞送載體而言，與藥物偶聯(lián)方式及其遞釋系統(tǒng)的有效性有待進一步考察。最后，作為治療藥物的核酸適配體較少進入臨床試驗階段，更少應用于臨床，其在體內(nèi)的穩(wěn)定性、可能的副作用、體內(nèi)清除率都還未研究清楚，這使臨床應用受到了限制，核酸適配體的穩(wěn)定性、非特異性結合及安全性等問題仍需進一步研究考察［31］。采用Cell-SELEX技術篩選得到的細胞特異性適配體在治療人類疾病方面展現(xiàn)了巨大的潛力和優(yōu)勢，但也面臨諸多挑戰(zhàn)，相信隨著研究的深入，Cell-SELEX篩選技術的不斷完善，這些問題將會一一解決，從而使Cell-SELEX技術篩選核酸適配體技術在腫瘤的靶向治療方面發(fā)揮更大的作用。

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（責任編輯：" 錢筠" 英文審校： 劉源崗）