響應(yīng)面法優(yōu)化樺樹液沙棘復(fù)合酒發(fā)酵工藝

摘要： "以樺樹液和沙棘為原料，篩選出適合樺樹液沙棘復(fù)合酒酒精發(fā)酵的菌種；在此基礎(chǔ)上，通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化樺樹液沙棘復(fù)合酒的發(fā)酵工藝條件。結(jié)果表明：最適用于樺樹液沙棘復(fù)合酒酒精發(fā)酵的商業(yè)菌種為釀酒酵母DV10；最佳發(fā)酵工藝為：酵母菌接種量為0.07%，初始pH值為3.6，發(fā)酵溫度為25 ℃，SO2添加量為83 mg/L。在此條件下釀制的樺樹液沙棘復(fù)合酒呈金黃色，具有明顯的酒香以及樺樹液、沙棘的清香，香味協(xié)調(diào)，酒體豐滿，醇香濃厚，典型性佳，以期為樺樹液沙棘復(fù)合酒工業(yè)化開發(fā)以及樺樹液和沙棘的綜合利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： "樺樹液； "沙棘； "菌種篩選； "發(fā)酵工藝； "響應(yīng)面法

中圖分類號(hào)： " S 79; TS 2 " " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： " A " " " " " " " "文章編號(hào)：１００1 － 9499（２０24）04 － 0036 － 07

Optimization of Fermentation Process of Birch Sap and Sea Buckthorn Compound Wine by Response Surface Methodology

QU Wei HAO Diqiu LI Wenjia LI Peishan MENG Zhuoyi PENG Bo JIA Pengbo**

（Jiamusi Branch of Heilongjiang Academy of Forestry Sciences， "Heilongjiang Jiamusi 154000）

Abstract Using birch sap and sea buckthorn as raw materials， the strains suitable for alcoholic fermentation of birch sap and sea buckthorn compound wine were screened. On this basis， single factor and response surface tests were used to optimize the fermentation conditions of birch sap and sea buckthorn compound wine. The results showed that the most suitable commercial strain for alcoholic fermentation of birch sap and sea buckthorn compound wine was saccharomyces cerevisiae DV10. The optimum fermentation conditions were as follows： the inoculated amount of yeast was 0.07%， the initial pH value was 3.6， the fermentation temperature was 25 ℃， and the added amount of SO2 was 83 mg/L. Under these conditions， the birch sap and sea buckthorn compound wine was golden in color， with obvious aroma and fragrance of birch sap and sea buckthorn. The aroma was coordinated， the wine was full-bodied， mellow and good typical. It was expected to provide a certain theoretical basis for the industrial development of birch sap and sea buckthorn compound wine and the comprehensive utilization of birch sap and sea buckthorn.

Key words Birch sap; sea buckthorn; strain screening; fermentation process; response surface methodology

樺樹液是從樺樹流出的無色或淡黃色的透明液體，帶有獨(dú)特的木質(zhì)清香味[ 1 ]，樺樹液中蘊(yùn)含著人體所需的各種氨基酸、礦物質(zhì)、脂肪酸等常見營(yíng)養(yǎng)成分[ 2 ]，此外，還含有過氧化物酶、過氧化氫酶、樺芽酸、細(xì)胞分裂素、香精油和皂角甙化合物等活性成分[ 3 ]。樺樹液具有祛痰止咳、促進(jìn)人體新陳代謝、抗疲勞、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[ 4 ]。

沙棘是一種胡頹子科沙棘屬落葉性灌木，具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，主要分布在我國(guó)東北、華北、西北和西南等地區(qū)[ 5 ]。其果實(shí)富含維生素、黃酮、微量元素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，具有抗衰老、抗氧化、改善腸道菌群、增強(qiáng)免疫力、降血脂等作用[ 6 ]。

樺樹液酒釀造過程中存在發(fā)酵困難、易氧化、口感平淡的問題；沙棘果由于其過高的酸度，制得果酒口感較酸，且易渾濁[ 7 ]。樺樹液與沙棘混合釀酒，能夠優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，解決單一原料釀酒存在的問題，并且復(fù)合酒的顏色穩(wěn)定、口感較好，但目前國(guó)內(nèi)對(duì)樺樹液沙棘復(fù)合酒釀造工藝鮮有報(bào)道。本研究以樺樹液、沙棘為主要原料制備樺樹液沙棘復(fù)合酒。通過試驗(yàn)篩選適用于樺樹液沙棘復(fù)合酒發(fā)酵的商業(yè)菌種，并采用單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化樺樹液沙棘復(fù)合酒的發(fā)酵工藝，旨在為樺樹液沙棘復(fù)合酒工業(yè)化開發(fā)以及樺樹液、沙棘的綜合利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 材料與試劑

樺樹液、沙棘果：采自伊春市帶嶺區(qū)東方紅林場(chǎng)；白砂糖：天津市鼎盛鑫化工有限公司；殼聚糖（食品級(jí)）：廣州天佳生物科技有限公司；DV10、EC1118和K1型號(hào)酵母菌：上海杰兔工貿(mào)有限公司；檸檬酸（分析純）：長(zhǎng)春健鷹食品添加劑公司；氫氧化鈉（分析純）哈爾濱新春化工產(chǎn)品有限公司；偏重亞硫酸鉀（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1. 2 儀器與設(shè)備

ESJ182-4型電子天平：上海拓西電子科技有限公司；PHS-3C型精密PH計(jì)：杭州雷磁分析儀器廠；HJ-6磁力攪拌器：天津市濱海新區(qū)大港紅杉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；HWS-70B恒溫恒濕箱：青島明博環(huán)?？萍加邢薰?；721紫外可見分光光度計(jì)：上海力辰儀器科技有限公司；YXQ-LS-50SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

1. 3 試驗(yàn)方法

1. 3. 1 樺樹液沙棘復(fù)合酒的加工工藝流程

1. 3. 2 操作要點(diǎn)

工藝操作要點(diǎn)

（1）沙棘汁的制備：挑選果實(shí)完整、飽滿、無霉變的沙棘果，清洗，去梗后，用榨汁機(jī)破碎，稱量果汁重量后，加入0.8%的果膠酶，在30 ℃下酶解2 h。酶解完成后，將果汁進(jìn)行過濾，得到沙棘汁。

（2）樺樹液的采集：在樺樹葉還未長(zhǎng)出前，樺樹液開始流動(dòng)時(shí)對(duì)樺樹液進(jìn)行采集，并對(duì)采集的樺樹液進(jìn)行過濾后，待用。

（3）調(diào)配：經(jīng)過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)將樺樹液與沙棘的混合比例確定為3∶1。

（4）糖酸度調(diào)整：使用蔗糖調(diào)節(jié)混合汁調(diào)節(jié)初始糖度為180 g/L，使用檸檬酸鈉或碳酸氫鈉調(diào)節(jié)混合汁和酸度。

（5）酒精發(fā)酵：在釀酒酵母中加入10倍質(zhì)量的5%蔗糖溶液后，將其放置在32 ℃下活化20 min，得到酵母菌種子液。將酵母菌種子液接種到樺樹液沙棘混合汁中，攪拌均勻后，進(jìn)行酒精發(fā)酵。每隔12 h測(cè)一次糖度和比重，糖度和比重不再變化時(shí)判斷達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)。

（6）過濾、澄清：將復(fù)合酒通過過濾去除果肉和酒腳，靜置一段時(shí)間，進(jìn)行澄清處理。

（7）陳釀、滅菌：將果酒置于橡木桶內(nèi)進(jìn)行陳釀1個(gè)月后，置于80 ℃條件下處理30 min，無菌裝瓶，即得樺樹液沙棘復(fù)合酒成品。

1. 3. 3 酵母菌的篩選

在試驗(yàn)過程中將活化好的DV10、EC1118和K1型號(hào)的酵母，按照0.06%的接種量分別接入到樺樹液與沙棘果混合汁中，初始pH調(diào)至3.6，SO2添加量為90 mg/L，在26 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵，以酒精度和感官評(píng)價(jià)作為復(fù)合酒發(fā)酵狀況的評(píng)價(jià)指標(biāo)，選出發(fā)酵性能好，復(fù)合酒口感佳的酵母。

1. 3. 4 樺樹液沙棘復(fù)合酒發(fā)酵的單因素實(shí)驗(yàn)

在試驗(yàn)過程中分別將接種量、pH值、溫度和SO2添加量作為自變量，以酒精度和感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探究不同的酵母菌接種量、初始pH值、發(fā)酵溫度和SO2添加量對(duì)樺樹液沙棘復(fù)合酒的影響。

1. 3. 5 樺樹液沙棘復(fù)合酒發(fā)酵工藝優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)接種量、pH值、溫度和SO2添加量進(jìn)行優(yōu)化（表1），以酒精度和感官評(píng)價(jià)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，從而明確復(fù)合酒發(fā)酵最佳工藝參數(shù)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

1. 3. 6 理化指標(biāo)測(cè)定

總糖測(cè)定參照張開平[ 8 ]等采用的3，5-二硝基水楊酸（DNS）法；酒精度測(cè)定參照GB 5009.225-2016；揮發(fā)酸、總二氧化硫和干浸出物的測(cè)定參照GB/T 15038-2006。

1. 3. 7 感官評(píng)價(jià)

選擇食品專業(yè)10名感官品評(píng)人員對(duì)樺樹液沙棘復(fù)合酒進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，并按照表2樺樹液沙棘復(fù)合酒的感官評(píng)分細(xì)則給予相應(yīng)的分?jǐn)?shù)。

表2 樺樹液沙棘復(fù)合酒的感官評(píng)分細(xì)則

1. 3. 8 微生物微指標(biāo)測(cè)定

菌落總數(shù)、大腸菌群及沙門氏菌的測(cè)定分別參照GB 4789.2-2016、GB 4789.3-2016和GB 29921-

2021項(xiàng)下方法及標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2. 1 酵母菌的篩選

由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，發(fā)酵液內(nèi)的酒精度數(shù)逐漸升高。其中使用酵母菌EC1118發(fā)酵用時(shí)6 d，最短，樺樹液沙棘復(fù)合酒的酒精度數(shù)達(dá)到9.5 %vol；使用酵母菌DV10發(fā)酵用時(shí)為7 d，樺樹液沙棘復(fù)合酒的酒精度為9.5 %vol；使用酵母菌K1發(fā)酵用時(shí)為7 d，樺樹液沙棘復(fù)合酒的酒精度為9.0 %vol。

2. 1. 1 不同酵母菌對(duì)樺樹液沙棘復(fù)合酒感官品質(zhì)的影響

不同酵母菌對(duì)樺樹液沙棘復(fù)合酒感官品質(zhì)的影響如圖2所示，使用酵母菌EC1118制備的復(fù)合酒酒樣呈土黃色，酒味較重，苦澀，入喉有刺激感，感官評(píng)分最低；使用酵母菌K1制備的復(fù)合酒酒樣呈橙黃色，比較澄清，具有淡酒香和樺樹液、沙棘的清香，但后味苦澀；使用酵母菌DV10制備的復(fù)合酒酒樣呈金黃色，澄清度高，香氣純正，具有酒香和樺樹液、沙棘的清香，入口綿軟醇厚，無苦澀味，感官評(píng)分最高。

2. 2 樺樹液沙棘復(fù)合酒發(fā)酵單因素試驗(yàn)結(jié)果

2. 2. 1 酵母菌接種量對(duì)樺樹液醋酸度的影響

由圖3可知，隨著酵母菌接種量的增加，樺樹液沙棘復(fù)合酒的酒精度和感官品質(zhì)均呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，這是因?yàn)榻湍妇漠a(chǎn)酒精速度隨著酵母菌數(shù)量的增多而加快。接種量為0.06%時(shí)，酒精度和感官評(píng)分達(dá)到最大值，分別為9.5 %vol和88.2分；當(dāng)接種量高于0.06%時(shí)，酒精度和感官品質(zhì)均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。這可能是酵母菌接種量過大，菌體增長(zhǎng)繁殖耗費(fèi)了樺樹液沙棘混合汁中大部分營(yíng)養(yǎng)，使得酒精發(fā)酵相關(guān)的底物含量降低，不利于酒精發(fā)酵[ 9 ]，并且酵母味過重，導(dǎo)致復(fù)合酒的酒精度和感官評(píng)分降低。因此，樺樹液沙棘復(fù)合酒的最適酵母菌接種量為0.06%。

2. 2. 2 初始pH值對(duì)樺樹液沙棘復(fù)合酒品質(zhì)的影響

由圖4可知，隨著初始pH的增大，樺樹液沙棘復(fù)合酒酒精度和感官評(píng)分均呈現(xiàn)先升后降低趨勢(shì)。當(dāng)初始pH值低于3.6時(shí)，不利于酵母菌的生長(zhǎng)繁殖，使得復(fù)合酒的酒精度較低，酒香不足。當(dāng)pH值為3.6時(shí)，酒精度和感官評(píng)分達(dá)到最大值，分別為9.5 %vol和87.5分。當(dāng)pH值高于3.6時(shí)，酒精度和感官評(píng)分均降低，這主要是因?yàn)檫^高的初始pH值使酵母菌的成長(zhǎng)、代謝受到限制[ 10 ]，從而導(dǎo)致了復(fù)合酒的酒精度和感官評(píng)分下降。因此，樺樹液沙棘復(fù)合酒的最適初始pH值為3.6。

2. 2. 3 發(fā)酵溫度對(duì)樺樹液沙棘復(fù)合酒品質(zhì)的影響

由圖5可以看出，隨溫度升高酒精度及感官評(píng)分增大。當(dāng)溫度為26 ℃時(shí)，酒精度和感官評(píng)分最高，分別為9.5 %vol和87.6分。當(dāng)溫度高于26 ℃時(shí)，酒精度和感官評(píng)分開始下降，溫度過高會(huì)導(dǎo)致酵母菌快速繁殖和衰老，并且還會(huì)產(chǎn)生不良的發(fā)酵味[ 11 ]，從而導(dǎo)致復(fù)合酒的酒精度和感官評(píng)分降低。因此，最適溫度為26 ℃。

2. 2. 4 SO2添加量對(duì)樺樹液沙棘復(fù)合酒品質(zhì)的影響

由圖6可以看出，隨著SO2添加量的增加，樺樹液沙棘復(fù)合酒的酒精度和感官評(píng)分呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)。當(dāng)SO2添加量低于90 mg/L時(shí)，復(fù)合酒的酒精度和感官評(píng)分較低，這主要是因?yàn)镾O2添加量過低時(shí)，對(duì)雜菌的抑菌作用并不完全，干擾了酵母菌的正常生長(zhǎng)和代謝過程[ 8 ]，從而降低了復(fù)合酒的酒精度和感官評(píng)分。當(dāng)SO2添加量為90 mg/L時(shí)達(dá)到最大值，分別為9.5 %vol和89.1分。當(dāng)添加量高于90 mg/L時(shí)，抑制酵母菌的活性且硫味較重，使得酒精度和感官評(píng)分降低。因此，樺樹液沙棘復(fù)合酒的最適SO2添加量為90 mg/L。

2. 3 樺樹液沙棘復(fù)合酒發(fā)酵工藝響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及樺樹液沙棘復(fù)合酒的酒精度和感官評(píng)價(jià)如表3所示。

利用Design-Expert13.0軟件對(duì)表5數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，回歸方程方程為：

Y1=9.42+0.2A-0.033 3B-0.058 3C-0.225D-

0.225AB-0.075AC-0.1AD+0.05BC+0.075BD+

0.35CD-0.380 8A2-0.530 8B2-0.543 3C2-0.193 3D2

Y2=88.76+1.42A-0.266 7B-0.475C-1.55D-

1.77AB- 0.65AC-0.85AD+0.3BC+0.475BD+

2.38CD-3.16A2-3.93B2-4.24C2-1.75D2

酒精度和感官評(píng)分的相關(guān)系數(shù)R2分別為0.886 8和0.896 6，校正系數(shù)R2Adj分別為0.773 5和0.793 2，變異系數(shù)C.V.分別為2.54%和1.90%，說明該模型的擬合度、可信度和重現(xiàn)性較好，可以對(duì)樺樹液沙棘復(fù)合酒發(fā)酵工藝進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。由表5可知，各因素酒精度的影響依次為：SO2添加量（D）gt;酵母菌接種量（A）gt;發(fā)酵溫度（C）gt;初始pH值（B），其中一次項(xiàng)A、D，交互項(xiàng)CD以及二次項(xiàng)A2、B2和C2對(duì)復(fù)合酒的酒精度有極顯著影響（P＜0.01），二次項(xiàng)D2對(duì)復(fù)合酒的酒精度有顯著影響（P＜0.05）。由圖7可知，溫度和SO2添加量對(duì)復(fù)合酒的酒精度影響最為顯著。

由表5可知，SO2添加量對(duì)感官評(píng)分的影響最為顯著，其次是接種量，再次是溫度，最后是初始pH值。其中一次項(xiàng)A、D，交互項(xiàng)CD以及二次項(xiàng)A2、B2和C2對(duì)復(fù)合酒的感官評(píng)分有極顯著影響（P＜0.01），交互項(xiàng)AB和二次項(xiàng)D2對(duì)復(fù)合酒的感官評(píng)分有顯著影響（P＜0.05）。由圖8可知發(fā)酵溫度和SO2添加量對(duì)樺樹液沙棘復(fù)合酒的感官評(píng)分影響最為顯著。

通過軟件Design-Expert 13.0分析，酵母菌接種量為0.068%，pH值為3.563，溫度為25.372 ℃，SO2添加量為82.691 mg/L時(shí)，復(fù)合酒酒精度理論值達(dá)到最高，為9.607 %vol；接種量為0.068%，pH值為3.603，溫度為25.388 ℃，SO2添加量為83.148 mg/L時(shí)，復(fù)合酒感官評(píng)分理論值達(dá)到最高為89.76分。為便于實(shí)際操作，將復(fù)合酒最佳工藝修正為：接種量為0.07%，pH值為3.6，溫度為25 ℃，SO2添加量為83 mg/L。平行3次試驗(yàn)，樺樹液沙棘復(fù)合酒酒精度和感官評(píng)分實(shí)際值分別為9.61±0.02 %vol和89.79± " 0.40分，與模型的理論預(yù)測(cè)值接近。因此，該方法對(duì)樺樹液沙棘復(fù)合酒的工藝優(yōu)化真實(shí)可信。

2. 4 優(yōu)化發(fā)酵工藝后樺樹液沙棘復(fù)合酒的感官評(píng)價(jià)

根據(jù)優(yōu)化后的發(fā)酵工藝制得的樺樹液沙棘復(fù)合酒澄清透明，呈金黃色，具明顯酒香及樺樹液、沙棘的清香，香味協(xié)調(diào)，醇香濃厚。

2. 5 樺樹液沙棘復(fù)合酒的理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)優(yōu)化后的發(fā)酵工藝制得復(fù)合酒，其理化指標(biāo)和微生物檢測(cè)結(jié)果如表5和表6所示，可以看出樺樹液沙棘復(fù)合酒均滿足GB 2758-2012和QB/T 5476-2020的要求。

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)篩選出適用于樺樹液沙棘復(fù)合酒酒精發(fā)酵的商業(yè)菌種為釀酒酵母DV10。根據(jù)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)得到的最佳發(fā)酵工藝條件為：酵母接種量為0.07%，pH值為3.6，溫度為25 ℃，SO2添加量為83 mg/L。在此條件下制得的樺樹液沙棘復(fù)合酒酒精度為9.61 %vol，酒體澄清透明，呈金黃色，具有明顯的酒香以及樺樹液、沙棘的清香，香味協(xié)調(diào)，醇香濃厚，且其理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

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