大青楊PuICE1基因克隆及生物信息學(xué)分析

摘要： "ICE1是bHLH類轉(zhuǎn)錄因子，能夠特異性結(jié)合CBF3基因啟動(dòng)子序列中的元件，從而激活下游冷誘導(dǎo)基因的表達(dá)，在響應(yīng)低溫脅迫時(shí)具有重要作用。本文從低溫條件下大青楊（Populus ussuriensis）cDNA中克隆得到一個(gè)受低溫誘導(dǎo)的PuICE1基因，利用生物信息學(xué)工具分析PuICE1的序列和編碼蛋白特征、利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析PuICE1基因在低溫脅迫條件下的表達(dá)模式。結(jié)果表明：大青楊PuICE1基因的cDNA全長序列長1 635 bp，含有完整的開放閱讀框，可編碼545個(gè)氨基酸。PuICE1編碼的蛋白序列含有1個(gè)典型的HLH結(jié)構(gòu)域，屬于bHLH類轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果表明，大青楊PuICE1與毛果楊（P.trichocarpa）和甜楊（P. suaveolens）ICE1存在著較高的同源性。通過qRT-PCR分析表明，在4 ℃低溫脅迫條件下，隨著脅迫處理時(shí)間（0、1.5、3、6、12、24、48、72 h）的延長，大青楊根、莖、葉片中的PuICE1基因表達(dá)量都是在72 h時(shí)達(dá)到峰值，而在芽中PuICE1基因表達(dá)量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在48 h表達(dá)量達(dá)到峰值。

關(guān)鍵詞： "大青楊； "PuICE1； "生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)： " S 792.113 " " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： " A " " " " " " " "文章編號(hào)：１００1 － 9499（２０24）04 － 0023 － 06

Cloning and Bioinformatics Analysis of PuICE1 in Populus ussuriensis

WANG Yanmin1 ， 2 ， 3 LI Jing2 ， 3 YIN Zhihui2 ， 3 LI Zhenghua2 ， 3

GUO Chengbo2 ， 3 LI Haixia2 ， 3 BAI Hui2 ， 3**

（1. "Forestry Research Academy of Heilongjiang Province， "Heilongjiang Harbin 150081; "2. "Forestry Research Institute of Heilongjiang Province， "Heilongjiang Harbin 150081; "3. "Key Laboratory of Fast-Growing Tree Cultivating of Heilongjiang Province， "Heilongjiang Harbin 150081）

Abstract ICE1 encodes a MYC-like bHLH transcriptional activator， which could specially band to active domain of CBF3 promoter and induce transcriptal expression of cold-responsive genes downstream of CBF3，play important roles in cold stress response. We cloned ICE1 in Populus ussuriensis using cDNA after 4 ℃ low temperature treatment of 24 hours， and named PuICE1.A 1 635 bp cDNA clone was obtained in our study， which contains a putatively entire open reading frame （ORF） and encodes a MYC-like protein of 545 amino acids. Bioinformatic analysis revealed that this cDNA was highly homologous to ICE1 from P.trichocarpa and P.suaveolens， indicating that the interest cDNA was PuICE1 gene. The result of qRT-PCR analysis showed that with the extension of treatment time（0， 1.5， 3， 6， 12， 24， 48， 72 h） at 4 ℃， the gene expression in roots， stems and leaves reached its peak at 72h， while the gene expression in buds showed a trend of first decreasing and then increasing， and reached its peak at 48 h.

Key words Populus ussuriensis; PuICE1; bioinformatics analysis

大青楊（Populus ussuriensis）屬落葉喬木[ 1 ]，主要產(chǎn)地位于35°～55°N左右，海拔300～1 400 m，喜光、偏濕，大青楊木質(zhì)白且密，軟而輕，耐腐朽，速生、優(yōu)質(zhì)、適應(yīng)性強(qiáng)，易于繁殖、用途廣[ 2 ]。楊樹作為重要的木本植物之一，在生產(chǎn)發(fā)育階段也面臨著各種生物或非生物脅迫的影響。干旱、高溫、低溫、損傷等非生物脅迫嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育及產(chǎn)量。低溫脅迫嚴(yán)重限制了植物的生長發(fā)育和地理分布，影響作物的產(chǎn)量和質(zhì)量[ 3 - 6 ]。植物在漫長的演變過程中，已經(jīng)進(jìn)化出精確的細(xì)胞和分子機(jī)制來提高它們?cè)跇O端低溫條件下的生存機(jī)會(huì)[ 4 ， 6 - 8 ]。了解植物如何通過感知、轉(zhuǎn)導(dǎo)和響應(yīng)冷信號(hào)來適應(yīng)冷脅迫，對(duì)于培育抗低溫作物至關(guān)重要[ 4 ， 9 ]。

植物跨膜蛋白COLD1被鑒定為一個(gè)感知冷信號(hào)的傳感器，它與G-protein α subunit1 （RGA1）形成復(fù)合物，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+流動(dòng)，以提高cold-

regulated（COR）基因的表達(dá)[ 4， 10 ]。COR基因編碼的蛋白可以通過穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)來抵抗凍害[ 11 ， "12 ]。C-repeat binding factors （CBFs）是能夠與COR基因啟動(dòng)子中的CRT/DRE元件結(jié)合從而誘導(dǎo)其表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（TFs），CBFs轉(zhuǎn)錄因子本身在低溫非冰凍條件下會(huì)迅速上調(diào)[ 11 ， 13 ]。在過去的20多年里，多種TFs被證明可以調(diào)節(jié)CBF的表達(dá)[ 4 ]，其中，inducer of CBF expression 1 （ICE1）是能夠誘導(dǎo)CBF基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一[ 4， 14 - 16 ]。ICE1是一類MYC-

like basic helix-loop-helix （bHLH） 轉(zhuǎn)錄因子，在冷脅迫條件下直接與CBF基因啟動(dòng)子中的MYC序列（CANNTG）結(jié)合[ 14 ， 15 ， 17 ， 18 ]。與CBFs和CORs相比，ICE1是一個(gè)組成型表達(dá)基因，在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)冷脅迫沒有明顯的響應(yīng)[ 4 ， "14 ]。然而，泛素化、聚合化和磷酸化等多種翻譯后修飾對(duì)低溫條件下ICE1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控起著重要作用[ 19 - 23 ]。

本研究利用RT-PCR方法從大青楊中克隆PuICE1基因，對(duì)大青楊PuICE1基因及其蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并研究該基因在低溫脅迫下的表達(dá)模式，從而為研究大青楊PuICE1基因的功能研究提供基礎(chǔ)和線索。

1 試驗(yàn)材料及方法

1. 1 試驗(yàn)材料

對(duì)大青楊組培苗進(jìn)行4 ℃低溫處理24 h。

膠回收試劑盒購于Omega公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Ex Taq 聚合酶、dNTP、pGEM-T Easy載體、T4連接酶購于TaKaRa公司；大腸桿菌菌株DH5α購自天根生物技術(shù)公司。所用引物及測序委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司（Sangon，http：//www.sangon.biogo.net/）合成及完成。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 大青楊總RNA提取

采用百泰克公司通用植物總RNA大量提取試劑盒（RP3312）提取大青楊總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA用于RT-PCR。

1. 2. 2 大青楊PuICE1基因克隆

根據(jù)毛果楊（P.trichocarpa）基因組（http：//www.phytozome.net/poplar）中PtICE1基因序列設(shè)計(jì)特異引物（表1），以4 ℃低溫處理大青楊cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR。PCR擴(kuò)增體系：cDNA2.0 μL，10×Ex Taq PCR buffer2.0 μL，10 mmol/L dNTP Mix0.4 μL，10 μmol/L引物各1.0 μL，5 U/μL Ex Taq0.2 μL，補(bǔ)水至20.0 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性10 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取5 μ

LPCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，以DL2000 DNA Marker為參照。回收PCR產(chǎn)物，克隆至pGEM-T Easy載體。挑取陽性克隆送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1. 2. 3 大青楊PuICE1序列分析

運(yùn)用NCBI網(wǎng)站中的ORF Finder程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）查找PuICE1基因的開放閱讀框。ProtParam程序（http：//au.expasy.org/tools/protparam.html）用于蛋白分子量、理論等電點(diǎn)、半衰期、脂肪系數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)、總平均疏水性的預(yù)測。利用Expasy工具（http：//au.expasy.org/tools）中提供的ProtScale軟件在線分析氨基酸的親、疏水性，通過Pfam27.0（http：//pfam.sanger.ac.uk/）和protein blast （http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）查找其保守結(jié)構(gòu)域，選取10個(gè)其他物種的ICE1蛋白質(zhì)用Bioedit軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，并用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1. 2. 4 大青楊PuICE1基因表達(dá)模式分析

提取低溫脅迫下大青楊不同組織部位（芽、葉、莖、根）RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA作為qRT-PCR模板，檢測低溫脅迫條件下大青楊不同組織部位在不同脅迫時(shí)間下的表達(dá)情況。根據(jù)克隆得到的PuICE1基因的ORF序列，使用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)定量分析引物PuICE1-RT-F和PuICE1-RT-R（表1），以大青楊PuActin基因作為內(nèi)參基因，其引物為PuActin-F和PuActin-R（表1），進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR， qRT-PCR）分析。PCR反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex Taq

TMⅡ10μL，正、反向引物各0.5 μL，ROX Reference " Dye（50×）0.4 μL，cDNA 模板2.0 μL，ddH2O6.6 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2. 1 PuICE1基因序列結(jié)構(gòu)分析

以4 ℃低溫處理24 h的cDNA為模板，利用設(shè)計(jì)的ICE-F和ICE-R引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條1.6 kb左右的特異片段（圖1），膠回收特異片段，連接T載體，進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆，對(duì)陽性克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證，送樣測序，對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，該基因開放讀碼框1 635 bp，推測其編碼一個(gè)含545個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為134 704.2，理論等電點(diǎn)（pI）為5.00、脂肪系數(shù)為28.93、不穩(wěn)定系數(shù)為39.63，是穩(wěn)定蛋白（參數(shù)大于40是不穩(wěn)定蛋白）。利用Expasy工具（http：//au.expasy.org/tools）中提供的ProtScale軟件在線分析氨基酸的親、疏水性，氨基酸殘基總平均疏水性（GRAVY）為0.701，說明蛋白疏水性較強(qiáng)。對(duì)其蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析（http：//pfam.sanger.ac.uk/search/sequence），發(fā)現(xiàn)在序列C端1084-1218堿基序列之間存在一個(gè)HLH（Helix-loop-helix DNA-binding domain）結(jié)構(gòu)域（圖2）。

2. 2 PuICE1蛋白序列分析

利用Blast程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）進(jìn)行序列同源性搜索，選擇與其相似程度高的其他6種不同植物的ICE1氨基酸序列，用多序列聯(lián)配程序Clustalx進(jìn)行多序列比對(duì)。所選擇的5種植物的ICE1基因分別為：擬南芥（Arabidopsis thaliana）、毛果楊、甜楊（P. suaveolens）、藍(lán)桉樹（Eucalyptus globulus）、赤桉（Eucalyptus camaldulensis）。通過Clustal軟件對(duì)該基因編碼蛋白序列與其他相似程度高的5種植物的ICE1序列同源性比較發(fā)現(xiàn)，大青楊PuICE1蛋白序列與其他5種植物的ICE1蛋白的同源性分別為49%、87%、71%、55%、54%，其中與毛果楊的同源性最高。用Bioedit軟件對(duì)上述ICE1序列做多序列比對(duì)分析（圖4），可以看到ICE1保守結(jié)構(gòu)域序列與其他物種同類的ICE1蛋白有著非常高的序列一致性。多重比對(duì)結(jié)果顯示，大青楊I(lǐng)CE1蛋白與其他植物ICE1蛋白在N端差異較大，但它們?cè)赽HLH功能域和C端高度保守。

用MEGA6軟件構(gòu)建了不同植物ICE1的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），結(jié)果顯示，ICE1基因家族按照其保守結(jié)構(gòu)的不同發(fā)現(xiàn)大青楊的ICE1基因與毛果楊關(guān)系較近，而與擬南芥、藍(lán)桉樹、赤桉親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2. 3 大青楊PuICE1基因的表達(dá)模式分析

對(duì)移栽1個(gè)月左右的野生型大青楊進(jìn)行4 ℃低溫脅迫，脅迫時(shí)間分別為0、1.5、3、6、12、24、48、72 h，分析在這幾個(gè)不同脅迫時(shí)間下的PuICE1基因表達(dá)模式（圖5）。4 ℃低溫脅迫下，PuICE1基因在大青楊芽中表達(dá)量處于先降后升的趨勢，在脅迫48 h時(shí)的表達(dá)量最高，隨后表達(dá)量有所下降。PuICE1基因在大青楊葉片、莖段、根中的表達(dá)量逐漸升高，脅迫72 h時(shí)的表達(dá)量最高，整體上每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量處于穩(wěn)定上升的趨勢。

3 討 論

ICE1（inducer of CBF expression1）也被稱為誘導(dǎo)CBF表達(dá)基因，是能夠調(diào)節(jié)冷誘導(dǎo)基因（cold- regulated，COR）表達(dá)的最上游轉(zhuǎn)錄因子。它編碼一個(gè)類似轉(zhuǎn)錄激活基因（MYC）的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，在常溫下鈍化，在低溫情況下能夠特異地結(jié)合CBF3啟動(dòng)子中的MYC作用元件，誘導(dǎo)CBF3的表達(dá)，CBF3進(jìn)一步結(jié)合到其下游目的基因啟動(dòng)子的DRE序列，誘導(dǎo)下游一系列冷誘導(dǎo)基因以及其他在植物寒冷適應(yīng)中起作用的基因的表達(dá)，繼而提高轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性[ 14 ， 24 ]。

本研究根據(jù)毛果楊PtICE1基因序列設(shè)計(jì)特異引物克隆大青楊PuICE1基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，序列比對(duì)結(jié)果顯示，大青楊PuICE1基因與其他物種的ICE1轉(zhuǎn)錄因子相似度較高，其中毛果楊87%、甜楊71%，用Bioedit軟件對(duì)上述ICE1序列做多序列比對(duì)分析，可以看到ICE1保守結(jié)構(gòu)域序列與其他物種同類的ICE1蛋白序列一致性較高。多重比對(duì)結(jié)果表明，大青楊I(lǐng)CE1蛋白與其他植物ICE1蛋白相比，在N端存在較大差異，但它們?cè)赽HLH功能域以及C端都具有高度保守的特性。此外，在一個(gè)由11個(gè)氨基酸組成的區(qū)域中，大青楊I(lǐng)CE1與其他物種相比（除甜楊I(lǐng)CE1外）均完全一致，另外，大青楊I(lǐng)CE1中也存在SUMO結(jié)合位點(diǎn)，且與毛果楊I(lǐng)CE1完全一致，與甜楊的ICE1同源序列有較小差異，但與擬南芥等的ICE1差異明顯，這說明大青楊的在蘇素化作用途徑中大青楊I(lǐng)CE1作用原理與毛果楊和甜楊類似，而有別于擬南芥等植物。進(jìn)一步用MEGA軟件構(gòu)建了不同植物PuICE1基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，ICE1基因家族按照其保守結(jié)構(gòu)的不同發(fā)現(xiàn)大青楊的PuICE1基因與毛果楊親緣關(guān)系較近。

分離并克隆基因是研究基因功能及其表達(dá)調(diào)控機(jī)理的前提基礎(chǔ)，與傳統(tǒng)生物學(xué)研究相比，利用生物信息學(xué)方法對(duì)基因進(jìn)行比較研究，可在較快時(shí)間獲得可靠結(jié)果。本研究從大青楊中克隆PuICE1基因，對(duì)該基因和其蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從而為大青楊PuICE1基因和蛋白功能研究提供重要依據(jù)。

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