巴西橡膠樹大、小橡膠粒子在乙烯調(diào)控天然橡膠合成中的作用分析

摘""要：巴西橡膠樹（Hevea"brasiliensis）是重要的產(chǎn)膠植物，膠乳中的橡膠粒子（RP）是合成天然橡膠的重要細(xì)胞器，但其響應(yīng)外源乙烯刺激調(diào)控天然橡膠合成的具體機(jī)制還不清楚。為了明確不同大小RP在此過程中的作用，本研究通過分離外源乙烯刺激后膠乳中不同直徑的RP，并與對照組進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在直徑較大的大橡膠粒子（LRP）中鑒定出響應(yīng)乙烯刺激差異蛋白37個，分別參與天然橡膠合成、糖酵解/糖異生、碳代謝及氨基酸生物合成等代謝通路，其中包含4個REF/SRPP家族成員；在直徑較小的小橡膠粒子（SRP）中鑒定出56個差異蛋白，分別參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、內(nèi)吞及剪接體等代謝通路，其中包含5個REF/SRPP家族成員。關(guān)鍵差異蛋白REF138具有較多等電點(diǎn)（pI）和分子量不同的蛋白亞型，LRP中低于標(biāo)準(zhǔn)等電點(diǎn)（4.80）的REF138亞型響應(yīng)乙烯刺激積累減少，高于標(biāo)準(zhǔn)等電點(diǎn)的REF138亞型響應(yīng)乙烯刺激積累增加；與LRP不同，SRP上有更多的REF138亞型響應(yīng)乙烯刺激發(fā)生變化，具有標(biāo)準(zhǔn)分子量（14.7"kDa）的REF138亞型響應(yīng)乙烯刺激積累增加，高于標(biāo)準(zhǔn)分子量的亞型響應(yīng)乙烯刺激積累減少。針對關(guān)鍵差異蛋白的互作蛋白功能分析發(fā)現(xiàn)，REF/SRPP家族成員REF138、REF175、REF258、SRPP117及SRPP204間存在相互作用，可能形成蛋白復(fù)合體結(jié)合在RP上。除REF/SRPP家族成員外，REF138的互作蛋白主要參與剪接體及內(nèi)吞代謝通路，REF258的互作蛋白主要參與脂代謝過程與次生代謝產(chǎn)物合成調(diào)控。綜上，通過對LRP及SRP上響應(yīng)乙烯刺激差異蛋白及其互作蛋白的功能分析初步揭示了LRP和SRP響應(yīng)外源乙烯刺激調(diào)控天然橡膠合成的代謝調(diào)控機(jī)制。

關(guān)鍵詞：巴西橡膠樹；橡膠粒子；乙烯；天然橡膠合成調(diào)控；蛋白互作中圖分類號：TQ332""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Role"of"Large"and"Small"Rubber"Particles"of"Hevea"Brasiliensis"in"Ethylene"Regulated"Natural"Rubber"Synthesis

WANG"Dan1，"XU"Bingqiang2，"SUN"Yong3，"PENG"Cunzhi1，"CHANG"Lili1，"TONG"Zheng1*

1."Institute"of"Tropical"Bioscience"and"Biotechnology，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Haikou，"Hainan"571101，"China;"2."Haikou"Experimental"Station"（Institute"of"Tropical"Fruit"Tree"Research），"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，nbsp;Haikou，"Hainan"571101，"China;"3."Rubber"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Danzhou，"Hainan"571737，"China

Abstract："Hevea"brasiliensis"is"an"important"natural"rubber-producing"plant."Rubber"particles"（RP）"in"latex"are"important"organelles"for"the"synthesis"of"natural"rubber，"which"can"be"divided"into"large"rubber"particles"（LRP）"and"small"rubber"particles"（SRP）"according"to"the"diameter."Although"the"specific"mechanism"of"its"regulation"of"natural"rubber"synthesis"in"response"to"exogenous"ethylene"stimulation"has"been"studied."However，"the"specific"regulatory"mechanism"of"LRP"and"SRP"in"regulating"natural"rubber"synthesis"in"response"to"ethylene"stimulation"is"still"unclear."In"order"to"clarify"the"role"of"RP"with"different"diameters"in"the"synthesis"of"natural"rubber，"LRP"and"SRP"stimulated"by"ethylene"were"isolated"and"the"proteins"of"corresponding"samples"were"extracted"for"differential"protein"analysis."37"differential"proteins"in"response"to"ethylene"stimulation"were"identified"in"the"LRP，"which"were"involved"in"natural"rubber"biosynthesis，"glycolysis/gluconeogenesis，"carbon"metabolism"and"amino"acid"biosynthesis，"and"some"other"metabolic"pathways，"including"four"members"of"the"REF/SRPP"family."56"differential"proteins"were"identified"in"SRP，"which"were"involved"in"protein"processing，"endocytosis，"splicing"in"endoplasmic"reticulum，"and"some"other"metabolic"pathways，"including"five"members"of"the"REF/SRPP"family."The"key"differential"accumulation"protein"REF138"had"many"isoforms"with"different"isoelectric"points"（pI）"and"molecular"weights"（MW）."REF138"isoforms"below"the"standard"pI"（4.80）"on"LRP"were"down-regulated"in"response"to"ethylene"stimulation，"while"isoforms"above"the"standard"pI"were"up-regulated"to"ethylene"stimulation."Different"from"LRP，"more"isoforms"of"REF138"on"SRP"changed"in"response"to"ethylene"stimulation，"and"isoforms"with"standard"MW"（14.7"kDa）"were"up-regulated"in"response"to"ethylene"stimulation，"while"isoforms"with"higher"than"standard"MW"were"down-regulated"in"response"to"ethylene"stimulation."The"function"analysis"of"key"differential"proteins"showed"that"there"were"interactions"among"the"members"of"the"REF/SRPP"family."REF138，"REF175，"REF258，"SRPP117"and"SRPP204"may"form"protein"complexes"and"bind"to"RP."In"addition"to"the"members"of"the"REF/SRPP"family，"20"proteins"interacting"with"REF138"were"mainly"involved"in"the"spliceosome"and"endocytic"metabolic"pathways，"and"50"proteins"interacting"with"REF258"were"involved"in"the"regulation"of"lipid"metabolism"and"the"synthesis"of"secondary"metabolites."In"conclusion，"functional"analysis"of"differential"proteins"and"the"interaction"proteins"responsive"to"ethylene"stimulation"on"LRP"and"SRP"might"preliminarily"reveal"the"metabolic"regulatory"mechanism"of"LRP"and"SRP"in"regulating"natural"rubber"synthesis"in"response"to"exogenous"ethylene"stimulation.

Keywords："Hevea"brasiliensis;"rubber"particles;"ethylene;"regulation"of"natural"rubber"biosynthesis;"protein"interaction

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.06.005

巴西橡膠樹（Hevea"brasiliensis）是合成天然橡膠的重要產(chǎn)膠植物。位于其形成層中的乳管是合成天然橡膠的重要部位。乳管細(xì)胞中的橡膠粒子（RP）是天然橡膠合成的關(guān)鍵細(xì)胞器，內(nèi)部儲存天然橡膠，外部由含有蛋白質(zhì)和其他成分的單層膜組織包被[1]。RP的直徑通常在0.08～4"μm之間[2]，不同直徑的RP合成天然橡膠的效率不同，小橡膠粒子（SRP，直徑小于0.35"μm）中天然橡膠合成效率高于大橡膠粒子（LRP，直徑大于0.75"μm）[2-3]。結(jié)合在RP膜上的蛋白質(zhì)分別參與天然橡膠生物合成、應(yīng)激或防御相關(guān)反應(yīng)、蛋白質(zhì)加工和折疊、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)等代謝調(diào)控[4]。

天然橡膠生物合成過程中，蔗糖作為底物經(jīng)酶促反應(yīng)生成乙酰輔酶A[5]，經(jīng)由甲羥戊酸途徑（MVA）生成橡膠單體焦磷酸異戊烯基（IPP）。在多種酶的共同催化作用下，經(jīng)起始、聚合及終止等步驟合成天然橡膠[6-9]。其中橡膠鏈的聚合在RP上完成，由多種蛋白酶類共同催化調(diào)控[8]。橡膠延伸因子蛋白（REF）、小橡膠粒子蛋白（SRPP）和順式異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（CPT）是RP中參與橡膠生物合成的關(guān)鍵蛋白質(zhì)[4]。REF的二級結(jié)構(gòu)主要由β-折疊構(gòu)成且高度疏水，以嵌入的方式結(jié)合在RP膜上[10]，有利于調(diào)控跨膜運(yùn)輸過程[11]。膠乳中LRP的數(shù)量占RP總數(shù)量的6%以下，但其中的天然橡膠含量超過RP中總含量的93%[12]，LRP中存儲更多的天然橡膠。SRPP的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋構(gòu)成，僅與RP膜脂質(zhì)表面結(jié)合[10]，體外實(shí)驗(yàn)表明SRPP在橡膠鏈聚合過程中促進(jìn)了IPP的摻入[13]，并且能夠提升橡膠粒子穩(wěn)定性[14]。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶（HMGS）是MVA中的關(guān)鍵酶，在SRP上積累較多[3]。SRP與天然橡膠合成的起始過程相關(guān)，LRP與橡膠鏈合成的終止過程相關(guān)。然而，LRP和SRP分別調(diào)控天然橡膠生物合成的作用機(jī)制仍不清楚。

研究發(fā)現(xiàn)外源乙烯可以提高巴西橡膠樹天然橡膠產(chǎn)量。施加外源乙烯后，能夠抑制膠乳中參與凝集過程的一系列酶和蛋白質(zhì)表達(dá)，延遲乳管末端堵塞過程[15]，延長膠乳流出時間從而獲得更多的天然橡膠。RP及其蛋白質(zhì)與膠乳凝集密切相關(guān)。橡膠樹膠乳中的凝集素蛋白識別RP蛋白并誘導(dǎo)RP的迅速聚集[16]。然而，RP蛋白響應(yīng)乙烯信號并抑制膠乳凝集的調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚。另一方面，外源乙烯的施用可通過增加RP上天然橡膠合成關(guān)鍵蛋白質(zhì)的積累促進(jìn)其合成過程[17]，其中REF/SRPP蛋白質(zhì)家族在此過程中可能發(fā)揮重要作用[18]，但具體的調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

因此，本研究關(guān)注巴西橡膠樹膠乳中不同大小的橡膠粒子蛋白分別在乙烯刺激過程中的蛋白積累差異，并分析天然橡膠合成代謝調(diào)控關(guān)鍵蛋白的互作蛋白功能，明確LRP、SRP上響應(yīng)乙烯刺激的代謝調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步明確LRP、SRP在天然橡膠合成過程中的作用。

1""材料與方法

1.1""材料

供試材料為未進(jìn)行過割膠處理的10年樹齡巴西橡膠樹（H."brasiliensis"Mull."Arg.，"R7-"33-97）。處理方法參照WANG等[19]的方法，在距離地面120"cm處的樹干上開割線，24"h后在割線處涂抹5"mL的3%（V/V）乙烯刺激劑作為處理組（E），使用等體積的ddH2O涂抹割線作為對照組（D），使用封口膜對處理后的割線進(jìn)行包裹。處理24"h后進(jìn)行割膠，在冰上收集流出的膠乳。

1.2""方法

1.2.1""大、小橡膠粒子的分離純化及形態(tài)觀測""冰上收集的膠乳在40"000′g，4"℃條件下離心60"min，收集離心管上層的RP，按照1∶10（w/V）的比例用預(yù)冷的洗脫溶液（WS，20"mmol/L"Tris-HCl，300"mmol/L甘露醇，0.5"mmol/L"DTT，pH"7.0）洗滌。使用基于percoll介質(zhì)的密度梯度離心法（percoll，1.31"mg/mL，Pharmacia，密度梯度由上至下依次為5%、15%、30%，V/V）將洗滌后的RP分離為LRP和SRP[20]。具體操作如下：將RP按照1∶10（w/V）的比例重新懸浮在含有30%（V/V）percoll的預(yù)冷WS中，轉(zhuǎn)移到離心管底層。加入含有15%（V/V）percoll的預(yù)冷WS作為中間層和5%（V/V）percoll的預(yù)冷WS作為頂層。在5000′g，4"℃條件下離心15"min。離心后頂層樣本為LRP，底層樣本為SRP。

將RP、LRP和SRP懸浮在固定溶液（50"mmol/L二甲基砷鈉，1%（w/V）單寧酸，6%（V/V）戊二醛）中室溫靜置2"h。離心收集固定后的RP、LRP和SRP，ddH2O洗滌3次。加入1%（w/V）的四氧化鋨室溫固定1"h，ddH2O洗滌2次后加入適量的ddH2O重新懸浮。將懸浮液滴加在錫箔紙上，風(fēng)干后的RP、LRP和SRP樣品經(jīng)掃描電子顯微鏡（SEM）觀測。

1.2.2""LRP和SRP的蛋白提取及差異蛋白分析""使用酚抽提法獲得LRP和SRP的蛋白質(zhì)樣本。加入雙倍LRP和SRP體積的蛋白提取液BPP（100"mmol/L"EDTA，50"mmol/L硼砂，50"mmol/L維生素C，1%（w/V）PVPP，1%（w/V）Triton"X-100，2%（w/V）β-巰基乙醇，30%（w/V）蔗糖，pH"8.0），震蕩10"min后加入等體積的Tris飽和苯酚（pHgt;7.8），混合物在15"000′g，4"℃條件下離心5"min。取離心后的上層液體再加入等體積BPP，震蕩5"min后相同條件離心，取離心后的上層液體加入5倍體積的預(yù)冷硫酸銨飽和甲醇溶液并在–20"℃環(huán)境中靜置12"h以上，在15"000′g，4"℃條件下離心15"min獲得粗蛋白，加入緩沖液LB"[7"mol/L尿素，2"mol/L硫脲，30"mmol/L"Tris，2%（w/V）CHAPS，pH"8.5]充分溶解獲得蛋白樣本，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)，通過Bradford法測定樣本濃度。

將獲得的蛋白質(zhì)樣本進(jìn)行雙向熒光差異凝膠電泳（DIGE）。50"μg"SRP蛋白樣本和LRP蛋白樣本，分別以400"pmol/L的Cy3和Cy5熒光染料標(biāo)記，所有樣本等量混合后用Cy2熒光染料標(biāo)記作為內(nèi)標(biāo)。電泳后凝膠圖像使用Typhoon"Trio掃描儀（GE"healthcare）采集，DIGE凝膠圖譜經(jīng)DeCyder"7.0軟件分析獲得差異蛋白（differential"accumulation"proteins，"DAPs），差異蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解后進(jìn)行質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF"MS，"ABsciex）分析檢測。

1.2.3""關(guān)鍵DAPs的Western印跡分析""膠乳（TL）在40"000′g，4"℃條件下離心60"min，離心后最上層是RP，中間層是C乳清（CS），底部是黃色體（LO）。TL、CS、LO蛋白樣本按照1.2.2中的方法提取。蛋白樣本完成單向凝膠電泳，經(jīng)膜轉(zhuǎn)印后，使用5%（w/V）脫脂牛奶封閉，分別與實(shí)驗(yàn)室前期獲得的多個DAPs多克隆兔血清抗體和HRP綴合的羊抗兔IgG孵育，經(jīng)顯色后由LAS"4000"mini成像儀（GE"Healthcare）采集圖譜。

1.2.4""關(guān)鍵DAPs在巴西橡膠樹膠乳中互作蛋白鑒定及分析""采用免疫沉淀結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)，對巴西橡膠樹膠乳中關(guān)鍵DAPs的互作蛋白進(jìn)行鑒定。使用多克隆兔血清抗體及Protein"A+G"Agarose"（Fast"Flow，"for"IP）試劑盒（Beyotime）進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。具體步驟如下：冰上采集1"mL的新鮮膠乳加入等體積預(yù)冷的WS溶液，加入2nbsp;μg多克隆兔血清抗體后4"℃孵育過夜。加入100"μL充分重懸的Protein"A+G"Agarose，4"℃孵育3"h后在1000′g，4"℃條件下離心5"min，除去上清后加入1"mL的PBS溶液洗滌沉淀5次，加入適量緩沖液LB獲得互作蛋白樣本。對該樣本進(jìn)行胰蛋白酶解后，使用液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜HPLC"（Dionex"Ultra"3000"nano）-ESI-MS/MS（TripleTOF"5600，"ABsciex）進(jìn)行鑒定，經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫分析后，獲得互作蛋白質(zhì)信息。

2""結(jié)果與分析

2.1""乙烯處理后巴西橡膠樹膠乳中LRP和SRP的分離

采用基于percoll的密度梯度離心法，分別從乙烯和ddH2O處理后的巴西橡膠樹膠乳中成功分離獲得了高純度的LRP和SRP。通過SEM觀測到RP的直徑范圍在0.05"μm至1.0"μm（圖1）。直徑小于0.3"μm的為SRP，同時直徑大于0.5"μm的為LRP。

2.2""乙烯刺激后巴西橡膠樹膠乳中LRP和SRP的蛋白質(zhì)組差異分析

通過2D-DIGE對乙烯處理（E）和ddH2O處理（D）24"h后的橡膠樹膠乳LRP和SRP蛋白質(zhì)進(jìn)行差異分析（圖2）。在LRP中，共檢測到37個蛋白點(diǎn)在處理組和對照組之間發(fā)生變化（Plt;0.01，Tlt;0.05，變化率高于1.2倍）（圖2，表1）。從這些蛋白點(diǎn)中鑒定到25個差異蛋白質(zhì)（DAPs）。其中，13個蛋白點(diǎn)對應(yīng)的4個DAPs與天然橡膠合成直接相關(guān)，屬于REF/SRPP家族成員。蛋白點(diǎn)L6和L25鑒定到同一種含有175"個氨基酸的橡膠延伸因子蛋白（REF175），在乙烯刺激后2種分子量相同但等電點(diǎn)不同的REF175蛋白亞型的含量在LRP上呈現(xiàn)不同的變化趨勢，蛋白點(diǎn)L6高調(diào)3.08倍，蛋白點(diǎn)L25低調(diào)1.27倍。L8、L18、L36和L37均鑒定為含有138個氨基酸的橡膠伸長因子蛋白（REF138），這4種不同蛋白亞型的積累量在乙烯刺激后具有不同變化趨勢，等電點(diǎn)較高的REF138亞型經(jīng)乙烯刺激后積累量增加；等電點(diǎn)較低的REF138亞型積累量減少。L27、L29、L30、L33和L35均鑒定為含有258個氨基酸的橡膠伸長因子蛋白（REF258），這5種不同蛋白亞型的積累量經(jīng)乙烯刺激后在LRP上的積累量都明顯減少。S11和S22鑒定為含有204個氨基酸的小橡膠顆粒蛋白（SRPP204），這2個蛋白亞型經(jīng)乙烯刺激后在LRP上積累量均呈現(xiàn)增加的趨勢。除REF/SRPP家族成員外還鑒定到21個DAPs，分別參與丙酮酸代謝、內(nèi)吞、三羧酸循環(huán)、谷胱甘肽代謝、RNA降解、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、磷酸肌醇代謝等通路（圖3，表1）。

SRP中，響應(yīng)乙烯刺激積累量變化的蛋白點(diǎn)較LRP多，共檢測到56個蛋白點(diǎn)在對照組和處理組之間發(fā)生變化（圖2，表2）。其中22個蛋白點(diǎn)鑒定到5個REF/SRPP家族成員。在乙烯刺激后，REF175（S28）在SRP上的積累量增加。有13個蛋白點(diǎn)鑒定為REF138，其中8個響應(yīng)乙烯刺激積累量增加。REF258的3個蛋白亞型（S33、S36和S38）受乙烯刺激后在SRP上的積累量減少（圖2，表2）。SRPP204的4個蛋白亞型（S5、S29、S30和S31）經(jīng)乙烯刺激后在SRP上積累量均增加。一種含有117個氨基酸的小橡膠顆粒蛋白亞型（SRPP117，"S16）受乙烯刺激后SRP上的積累量增加。此外，鑒定到29個不屬于REF/SRPP家族成員的DAPs，分別參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、谷胱甘肽代謝、糖酵解/糖異生、花生四烯酸代謝、剪接體和氧化磷酸化等代謝通路（圖3，表2）。

2.3""乙烯處理后RP、LRP、SRP中關(guān)鍵差異蛋白積累量的Western"Blot分析

為了檢測與天然橡膠合成調(diào)控相關(guān)關(guān)鍵蛋白在膠乳中不同組分間的分布差異，對TL、CS、LO、RP、LRP和SRP等不同膠乳組分蛋白樣本進(jìn)行Western"Blot分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，響應(yīng)乙烯差異積累的REF/SRPP家族成員REF138、REF175和REF258主要分布在RP上，并且蛋白積累量在LRP上要多于SRP。REF258在膠乳不同組分中都檢測到分子量不同的2條帶，這2種REF258主要在RP中積累，CS中檢測到少許，LO中未檢出。SRPP117主要在CS中大量積累，RP中有

微量檢出，并主要在SRP中積累（圖4）。SRPP117與其他具有完整REF"domain的REF/SRPP蛋白家族成員不同，其REF"domain存在部分缺失；并且與SRPP亞家族成員具有短N(yùn)-末端及可變長度的C端不同，只有一個位于REF結(jié)構(gòu)域兩側(cè)的短N(yùn)端和C端序列[18]。Western"Blot檢測到SRPP117在CS和SRP組分中積累。SRPP117的不同蛋白亞型在SRP上響應(yīng)乙烯刺激積累量增加（圖2，表2），并存在與REF138和REF258相互作用的可能（表3），SRPP117可能通過參與REF138和REF258構(gòu)成的膜蛋白復(fù)合體參與天然橡膠合成的調(diào)控。

以ddH2O處理組作為對照，比較乙烯刺激后CS、RP、LRP及SRP上REF/SRPP家族蛋白的積累差異。Western"Blot分析顯示，乙烯刺激后SRPP117僅在CS組分中檢出，并響應(yīng)乙烯刺激積累量明顯增加；REF138在CS及RP組分中都略有增加；REF175在RP中且主要是LRP中積累量增加；REF258在RP及SRP中變化不明顯（圖5）。研究認(rèn)為REF是LRP上的主要蛋白而SRPP是SRP上的主要蛋白[10-11，"13]，但有一項(xiàng)針對LRP與SRP間的差異蛋白研究表明，REF138在LRP和SRP上的表達(dá)量接近[3]，本研究也證實(shí)這一發(fā)現(xiàn)，并且REF138在LRP和SRP中均響應(yīng)乙烯刺激積累量增加（圖5）。經(jīng)2D-DIGE證實(shí)LRP及SRP中都存在不同等電點(diǎn)的REF138蛋白亞型，并且這些蛋白亞型在乙烯刺激后的積累量存在差異（圖2，表1，表2）。在LRP上低于標(biāo)準(zhǔn)等電點(diǎn)（4.80）的REF138蛋白亞型響應(yīng)乙烯刺激低積累，高于標(biāo)準(zhǔn)等電點(diǎn)的REF138蛋白亞型響應(yīng)乙烯刺激高積累（表1）。與LRP不同，SRP上有更多的REF138蛋白亞型響應(yīng)乙烯刺激發(fā)生變化，并且具有標(biāo)準(zhǔn)分子量（14.7"kDa）的不同蛋白亞型絕大部分響應(yīng)乙烯刺激上調(diào)，高于標(biāo)準(zhǔn)分子量的蛋白亞型響應(yīng)乙烯刺激下調(diào)（表2），暗示了乙烯可能通過誘導(dǎo)REF138不同蛋白亞型的差異積累調(diào)控天然橡膠合成。2D-DIGE發(fā)現(xiàn)LRP和SRP上REF258的一些不同等電點(diǎn)的蛋白亞型表現(xiàn)出明顯下調(diào)趨勢（表1，表2），但Western"Blot分析發(fā)現(xiàn)REF258的總含量變化不大（圖5），這些結(jié)果暗示乙烯刺激后REF258可能通過調(diào)節(jié)其不同蛋白亞型等電點(diǎn)的改變對天然橡膠合成過程進(jìn)行調(diào)控，具體作用機(jī)制需進(jìn)一步研究加以證實(shí)。

2.4""關(guān)鍵蛋白REF138、REF258的互作蛋白鑒定

對巴西橡膠樹膠乳中與REF138和REF258互作的蛋白分別進(jìn)行鑒定后發(fā)現(xiàn)，與REF138存在相互作用關(guān)系的可信蛋白有25個，其中與已知

的天然橡膠合成調(diào)控相關(guān)的蛋白有5個；與REF258存在相互作用關(guān)系的可信蛋白有55個，其中與已知的天然橡膠合成調(diào)控相關(guān)的蛋白有5個（表3）。通過對比發(fā)現(xiàn)，REF138、REF175、REF258、SRPP117與SRPP204等5個天然橡膠合成調(diào)控關(guān)鍵蛋白質(zhì)間存在相互作用，可能組成蛋白復(fù)合體存在于RP膜上，進(jìn)而高效調(diào)控天然橡膠的合成。

除與天然橡膠合成直接相關(guān)的蛋白外，與REF138互作的蛋白還參與到乙醛酸和二羧酸代謝、RNA降解與轉(zhuǎn)運(yùn)、內(nèi)吞作用以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工等過程；與REF258互作的蛋白參與到甘油磷脂代謝、戊糖磷酸途徑、糖酵解/糖異生、異喹啉生物堿生物合成、脂肪酸代謝、RNA降解、氧化磷酸化及MAPK信號通路等代謝過程中（圖6）。此外，REF138和REF258都能夠與一種幾丁質(zhì)酶hevamine-A相互作用，可能參與了膠乳凝集過程的調(diào)控。

3""討論

3.1""LRP與SRP響應(yīng)乙烯刺激后，被抑制和促進(jìn)的代謝通路存在差異

乙烯響應(yīng)因子蛋白（ethylene"response"factor）是茉莉酸和乙烯信號通路的重要因子，調(diào)控植物防御相關(guān)基因協(xié)同作用[21]。巴西橡膠樹中的乙烯響應(yīng)因子蛋白（HbERF-IXc5）在乳管代謝和應(yīng)激耐受過程中發(fā)揮功能，促進(jìn)乳膠的再生[22]。HbERF-IXc4在膠乳中有較高的轉(zhuǎn)錄豐度，乙烯刺激后激活其靶基因HbSUT3促進(jìn)其表達(dá)[23]，

HbSUT3的高水平表達(dá)能夠促進(jìn)天然橡膠產(chǎn)量。本研究中，乙烯刺激后LRP上的elicitor-respon sive"protein"3-like"isoform"X1和參與糖酵解/糖異生代謝途徑中的蛋白及酶類高積累，存在相似代謝調(diào)控機(jī)制的可能。糖酵解/糖異生代謝途徑能夠?yàn)槊复俜磻?yīng)提供能量，并為橡膠鏈的延伸提供碳骨架[24]，加速供能可能是LRP在乙烯促進(jìn)天然橡膠生物合成過程中的作用之一。

乙烯促進(jìn)了SRP上的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工相關(guān)的蛋白積累，同時抑制了內(nèi)吞過程相關(guān)的蛋白積累。單層膜包被的RP可能起源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[25-26]，SRP上參與橡膠生物合成的關(guān)鍵蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜密切相關(guān)[27]。乙烯刺激可能通過促進(jìn)SRP從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上招募更多的天然橡膠合成相關(guān)蛋白并進(jìn)一步與SRP膜結(jié)合，進(jìn)而增加橡膠產(chǎn)量。通過分析REF138和REF258的互作蛋白功能后發(fā)現(xiàn)，這一過程可能主要由REF138及其互作蛋白調(diào)控。有研究表明，乙烯刺激能夠明顯增加膠乳中SRP的比例[19]，可能進(jìn)一步促進(jìn)天然橡膠的合成。

3.2""LRP與SRP響應(yīng)外源乙烯刺激調(diào)控天然橡膠合成的模式存在差異

REF/SRPP蛋白家族成員可與其他參與天然橡膠合成調(diào)控的蛋白形成復(fù)合體結(jié)合在RP膜上。橡膠轉(zhuǎn)移酶（HRT1，"HRT2）、REF、SRPP及一種橋聯(lián)蛋白（HRBP）以多種復(fù)合體形式結(jié)合在SRP上[28]。其中HRT1與HRBP形成的復(fù)合體具有異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶活性，并對脂膜及蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)域具有親和力，介導(dǎo)蛋白與膜的結(jié)合過程[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，REF138、REF175、REF258及SRPP117、SRPP204間存在相互作用的可能）。乙烯刺激后，LRP上積累量發(fā)生變化的REF/SRPP蛋白家族成員蛋白點(diǎn)有13個，SRPP上有22個，SRP上的蛋白復(fù)合體響應(yīng)外源乙烯刺激后具備更為復(fù)雜和精細(xì)的天然橡膠合成調(diào)控機(jī)制。

針對RP膜上脂類化合物組成成分分析后發(fā)現(xiàn)，其磷脂含量遠(yuǎn)高于半乳糖苷含量[28]。本研究發(fā)現(xiàn)REF258與大量的脂代謝通路蛋白及相關(guān)酶類存在相互作用的可能，而乙烯刺激后LRP及SRP上的REF258不同亞型的積累均受到抑制。乙烯刺激可能通過改變RP膜的通透性影響跨膜運(yùn)輸，極有可能使某些相關(guān)蛋白與RP膜的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生改變，進(jìn)而影響天然橡膠的合成調(diào)控。

外源乙烯的施用能夠延長巴西橡膠樹膠乳從乳管中流出的時間，進(jìn)而增加單次割膠收集的橡膠產(chǎn)量[30]。膠乳凝集過程是影響膠乳流出時間的關(guān)鍵因素。巴西橡膠樹膠乳LO中的膠乳凝集素樣蛋白與SRPP結(jié)合，促進(jìn)RP及LO的聚集進(jìn)而導(dǎo)致膠乳凝集[31]。Hevein是膠乳中重要的凝固因子，貯存于LO中，一旦LO膜破碎釋放后膠乳迅速凝集[32]。膠乳中的幾丁質(zhì)酶是一類抗凝固因子，能夠提高膠乳穩(wěn)定性延長排膠時間。乙烯刺激后，膠乳中幾丁質(zhì)酶活性隨乙烯濃度增加而增加，膠乳產(chǎn)量較施用乙烯前也有所增加[33]。本研究發(fā)現(xiàn)REF138及REF258均可同膠乳中一種幾丁質(zhì)酶（hevamine-A）相互作用，乙烯刺激后，SRP上分子量為14"kDa左右的REF138蛋白亞型顯著提升了積累水平，由于REF138同hevamine-"A的相互作用，SRP上hevamine-A的積累水平可能也相應(yīng)提升，緩解SRP間、SRP與LO的聚集，延緩膠乳凝集過程。

在本研究中，通過分離LRP及SRP并獲得乙烯刺激后的蛋白樣本進(jìn)行差異分析，LRP上響應(yīng)乙烯刺激發(fā)生積累差異的蛋白共計(jì)37個，SRP上共計(jì)56個。LRP的差異蛋白分別參與天然橡膠合成、糖酵解/糖異生、碳代謝及氨基酸生物合成等代謝通路，SRP的差異蛋白分別參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、內(nèi)吞及剪接體等代謝通路。并通過Western"Blot分析部分關(guān)鍵差異蛋白在膠乳不同組分間及相同組分乙烯刺激后的積累差異。對其中的REF138及REF258的互作蛋白進(jìn)行檢測，分別獲得與REF138相互作用的25個以及與REF258存在互作關(guān)系的55個蛋白質(zhì)信息，初步揭示了LRP和SRP響應(yīng)外源乙烯刺激調(diào)控天然橡膠合成及增加膠乳產(chǎn)量的代謝調(diào)控機(jī)制。

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