龜紋瓢蟲酪氨酸脫羧酶基因鑒定及其在卵黃沉積中功能初探

摘要：【目的】明確龜紋瓢蟲（Propylea japonica）酪氨酸脫羧酶（tyrosine decarboxylase， TDC）基因的結(jié)構(gòu)特征、分子特性和表達(dá)情況，探明其作為章魚胺關(guān)鍵合成酶基因在瓢蟲生殖發(fā)育中的調(diào)控作用?！痉椒ā客ㄟ^生物信息學(xué)軟件分析鑒定了龜紋瓢蟲PjTDC1～4基因及其結(jié)構(gòu)特征，選擇其中PjTDC1基因，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction， PCR）、實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time PCR， qRT-PCR）和RNA干擾（RNA interference， RNAi）技術(shù)，探索了PjTDC1基因在不同組織和不同發(fā)育時期的表達(dá)模式及其在龜紋瓢蟲中的功能。【結(jié)果】生物信息學(xué)分析表明，龜紋瓢蟲中存在4個TDC基因，并命名為PjTDC1～4。4個龜紋瓢蟲TDC蛋白均有PLN02880結(jié)構(gòu)域。 PjTDC1基因開放閱讀框共1 728 bp，編碼 575 個氨基酸殘基。龜紋瓢蟲PjTDC1蛋白與甘薯小象甲（Cylas formicarius）的TDC蛋白有最高的同源性。PjTDC1基因在龜紋瓢蟲不同發(fā)育階段均有表達(dá)，在幼蟲期和羽化1～7 d的雌蟲中的表達(dá)量均逐漸降低，其中在1齡幼蟲中表達(dá)量最高，在卵期、4齡幼蟲及7日齡雌成蟲中表達(dá)量較低。PjTDC1基因在不同組織中均有表達(dá)，但主要在卵巢、背部表皮和頭部中有較高的表達(dá)量。RNAi試驗結(jié)果顯示，PjTDC1基因沉默抑制龜紋瓢蟲卵母細(xì)胞中卵黃沉積，除此之外，在雙鏈RNA注射后的第1天和第3天，處理組初級卵母細(xì)胞寬度顯著小于對照組卵母細(xì)胞寬度，分別降低10.03%和18.60%?！窘Y(jié)論】明確了龜紋瓢蟲TDC基因的基本結(jié)構(gòu)特征，以及PjTDC1在龜紋瓢蟲不同發(fā)育階段和不同組織的時空表達(dá)模式，明確了其在龜紋瓢蟲卵母細(xì)胞的卵黃沉積過程中的正向調(diào)控作用，可為進(jìn)一步解決龜紋瓢蟲大規(guī)模人工擴繁難題提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：龜紋瓢蟲；酪氨酸脫酸酶；PjTDC1；章魚胺；時空表達(dá)；生殖發(fā)育；RNA干擾

Identification and preliminary function exploration of tyrosine decarboxylase gene in vitellogenin deposits of Propylea japonica

Tang Zhijuan1， 2， Zhu Xiangzhen2， Zhang Kaixin2， Li Dongyang2， Ji Jichao2， Gao Xueke2， Luo Junyu2， Cui Jinjie2， Wang Li2*， Huangfu Ningbo2*， Chen Zhaorong1*

（1. College of Horticulture and Landscape Architecture， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300392， China; 2. Institute of Cotton Research， Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Cotton Bio-breeding and Integrated Utilization， Anyang， Henan 455000， China）

Abstract： [Objective] The aim of this study is to analyze the structural and molecular characteristics of Propylea japonica tyrosine decarboxylase （TDC） genes， and their expression pattern and to explore their regulatory role as a key octopamine synthetase gene in the reproductive development of ladybird beetle. [Methods] Four PjTDC genes and their basic structural characteristics were identified by bioinformatics software. PjTDC1 gene was cloned by polymerase chain reaction. The expression pattern of PjTDC1 gene in different tissues and at different developmental stages were investigated by quantitative real-time polymerase chain reaction. And the function of PjTDC1 gene in P. japonica were studied by RNA interference techniques. [Results] There were four TDC genes in the P. japonica， which were named PjTDC1-4. All the TDC proteins of P. japonica have PLN02880 domain， and PjTDC1 gene has an open reading frame of 1 728 bp， encoding 575 amino acid residues. PjTDC1 protein has the highest homology with the TDC protein of Cylas formicarius. PjTDC1 gene was expressed in P. japonica at different developmental stages， with the highest expression level in the 1st instar larvae but lower expression level in the egg stage larvae， the 4th instar larvae， and 7-day-old female adults. Generally speaking， the expression level of PjTDC1 decreased gradually at larval stages and in the adults after eclosion for 1 to 7 days. PjTDC1 gene is also expressed in different tissues， but it is mainly expressed in the ovaries， dorsal cuticula and head of the 5-day-old female adults. The results of RNA interference experiment showed that silencing of PjTDC1 gene inhibited the deposition of vitellogenin in the oocytes of P. japonica. In addition， on the 1st and 3rd day after injection of double strand RNA， the width of primary oocytes in the treatment group was significantly 10.03% and 18.60% lower than that in the control group. These results suggest that PjTDC1， as a key gene for octopamine synthesis， also plays an important regulatory role in the reproductive development of P. japonica. [Conclusion] In this study， the basic structural features of PjTDC genes and the spatial and temporal expression pattern of PjTDC1 at different developmental stages and in different tissues of P. japonica were studied， and its positive regulatory role in the process of vitellogenin deposits in the oocytes of P. japonica were clarified， which will provide theoretical basis for further solving the problem of large-scale artificial propagation of P. japonica.

Keywords： Propylea japonica; tyrosine decarboxylase; PjTDC; octopamine; spatio-temporal expression pattern; reproductive development; RNA interference

龜紋瓢蟲（Propylea japonica）是我國最重要的捕食性天敵昆蟲之一，屬鞘翅目（Coleoptera）瓢蟲科（Coccinellidae），廣泛分布在我國北方和南方大多數(shù)地區(qū)的農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中[1-2]。龜紋瓢蟲具有生命周期長、產(chǎn)卵量大、耐高溫干旱、喜高濕等特點，因此在我國多數(shù)農(nóng)田農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)絕對優(yōu)勢，并逐漸成為我國溫室瓜果、蔬菜產(chǎn)業(yè)以及景觀園林作物等高附加值農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中生物防治的重要天敵[3-5]。龜紋瓢蟲幼蟲和成蟲均以蚜蟲、葉蟬、飛虱、鱗翅目昆蟲的卵和低齡幼蟲為食，喜食蚜蟲，是蚜蟲的天然“克星”[6-8]。但目前在人工飼料飼養(yǎng)條件下，龜紋瓢蟲存在卵巢發(fā)育慢，產(chǎn)卵前期延長，產(chǎn)卵量少，卵孵化率低等問題[9-11]。因此，了解龜紋瓢蟲的生殖調(diào)控機理，明確影響其生殖發(fā)育的關(guān)鍵因子是解決當(dāng)前其大規(guī)模擴繁困難的關(guān)鍵。

章魚胺（octopamine， OA）是在無脊椎動物中廣泛存在的1種神經(jīng)遞質(zhì)，最早發(fā)現(xiàn)是在章魚（Octopus vulgaris）唾液腺中，其結(jié)構(gòu)和功能類似于脊椎動物的去甲狀腺類激素[12-13]。在昆蟲中，OA的生物合成主要以酪氨酸（tyrosine， Tyr）為底物，在酪氨酸脫羧酶（tyrosine decarboxylase， TDC）的催化下發(fā)生脫羧反應(yīng)生成酪胺（tyramine， TA），接著在酪胺β-羥化酶（tyramine β-hydroxylase， Tβh）的作用下發(fā)生羥化反應(yīng)而最終合成[13-14]。目前在昆蟲中的研究表明，OA作為1種神經(jīng)遞質(zhì)分子主要參與下列生命活動：調(diào)節(jié)昆蟲的運動、記憶、取食、神經(jīng)信號的傳導(dǎo)；調(diào)節(jié)昆蟲的脂類和碳代謝；調(diào)節(jié)昆蟲生殖發(fā)育等多種生理功能。例如，給蜜蜂、蟑螂和蒼蠅注射OA，能夠顯著增加其伸吻反射，從而增加對蔗糖水的吸入[15-18]。近年來的研究表明，OA能夠參與調(diào)控昆蟲交配后的卵巢發(fā)育，調(diào)節(jié)雌蟲的交配行為，調(diào)控昆蟲保幼激素和蛻皮激素合成與分泌，調(diào)節(jié)卵形成和卵黃的生成，進(jìn)而影響昆蟲的生殖發(fā)育[19-22]。

TDC作為OA合成的關(guān)鍵酶，除了直接參與合成OA，在昆蟲產(chǎn)卵行為調(diào)控中同樣起著重要的作用，然而具體的調(diào)控機理仍不明確[19]。因此，TDC的相關(guān)研究不僅可以為揭示TDC基因本身的重要調(diào)控作用提供依據(jù)，還可以為研究OA重要生理功能提供方向。本研究基于龜紋瓢蟲基因組和轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)[23]，分析龜紋瓢蟲和其他昆蟲TDC基因的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，探索了PjTDC1基因在不同組織和不同發(fā)育時期的表達(dá)模式，初步研究PjTDC1基因在龜紋瓢蟲生殖發(fā)育中的功能，為進(jìn)一步研究章魚胺合成的關(guān)鍵酶在瓢蟲生殖發(fā)育中的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試?yán)ハx：本實驗最初的龜紋瓢蟲種群采自河南安陽的棉田，并在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所溫室連續(xù)純化飼養(yǎng)多代。龜紋瓢蟲于紗網(wǎng)籠（30 cm×30 cm×30 cm）中飼養(yǎng)，籠中放置接有豌豆修尾蚜（Megoura crassicauda）的蠶豆苗，并定期更換生長狀況良好的帶有豌豆修尾蚜的蠶豆苗。飼養(yǎng)條件為光照時間14 h/黑暗時間10 h，溫度（25±1）℃，相對濕度（60±5）%。

1.2 總RNA 的提取及cDNA 的合成

使用TRIzol試劑（Invitrogen，美國）并根據(jù)操作說明，提取龜紋瓢蟲總RNA。采用賽默飛世爾分光光度計NanoDrop 2000和1.4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量和完整性。使用翌圣生物科技（上海）股份有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒Hifair○R" V one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR以1.0 μg RNA為模板合成cDNA，并保存于－20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因克隆

在已經(jīng)公開的龜紋瓢蟲基因組數(shù)據(jù)庫（NCBI 登錄號： SRR10076377）中通過基因組注釋文件關(guān)鍵詞檢索和同源搜索的方法篩選4個TDC基因（PjTDC1、PjTDC2、PjTDC3、PjTDC4），根據(jù)PjTDC1基因序列，利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計全長引物（表1）用于克隆PjTDC1。以反轉(zhuǎn)錄得到的龜紋瓢蟲的cDNA為模板利用寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司的Ex Taq○R" DNA Polymerase進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction， PCR），反應(yīng)體系：10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTP Mix 2.0 μL，Ex Taq 酶0.4 μL，上下游引物各1.0 μL，cDNA 3.0 μL，加入ddH2O補至25 μL。擴增程序為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。使用1.4%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，選取單一條帶進(jìn)行測序。引物合成和測序均由生工生物工程（上海）公司完成。

1.4 基因及其編碼產(chǎn)物的生物信息學(xué)分析

在美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information of USA， NCBI）的ORF finder 網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）對PjTDC1進(jìn)行開放閱讀框（open reading frame， ORF）分析；使用Expasy在線網(wǎng)站ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam）分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；使用在線軟件SignalP-4.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/））和TMHMM-2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）預(yù)測蛋白質(zhì)的信號肽并分析跨膜區(qū)；使用在線網(wǎng)站W(wǎng)oLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）對蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位；使用在線軟件SOPMA（https：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）分析蛋白的二級結(jié)構(gòu)和預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)。在NCBI的CDD網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）查找基因功能結(jié)構(gòu)域；在NCBI下載29條TDC同源蛋白的氨基酸序列，利用MEGA 6 軟件中的鄰接法（neighbor joining）在自展值（bootstrap）1 000次下構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并通過在線工具 iTOL（https：//itol.embl.de/itol.cgi）對進(jìn)化樹進(jìn)行美化。

1.5 雙鏈RNA合成和RNA干擾實驗

設(shè)計具有T7啟動子序列（TAATACGACTCACTATAGGN）的引物T7-dsPjTDC1和T7-

dsGFP（表1），使用T7 RiboMAXTM Express RNAi System試劑盒（Promega，美國）合成PjTDC1的雙鏈RNA（double strand RNA， dsRNA）。RNA干擾實驗選用羽化不超過24 h的雌成蟲，使用微量注射器在試蟲的第3、第4腹節(jié)間注射3 μg·μL－1 dsRNA，每頭注射0.5 μL，對照組注射相同劑量的dsGFP。試驗設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)12頭試蟲。注射dsRNA后的龜紋瓢蟲用豌豆修尾蚜正常飼養(yǎng)。在注射dsRNA后1 d、2 d和3 d，使用羅氏實時熒光定量儀qRT-PCR LightCycler 480檢測干擾效率。選取注射dsRNA后 1 d、3 d、5 d、7 d的龜紋瓢蟲，在磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline， PBS）里進(jìn)行活體解剖，采用蔡司體式顯微鏡SteREO Discovery V8觀察卵巢形態(tài)并拍照，同時測量卵巢小管長度和初級卵母細(xì)胞寬度。實驗共設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)共觀察12頭試蟲卵巢，每個卵巢測量5～8個卵巢小管長度和初級卵母細(xì)胞寬度。

1.6 龜紋瓢蟲PjTDC1時空表達(dá)模式分析

選取龜紋瓢蟲卵，1齡、2齡、3齡、4齡幼蟲，蛹，羽化第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第7天和第9天的雌性成蟲，進(jìn)行時間表達(dá)模式分析。選取羽化第5天的龜紋瓢蟲雌成蟲頭、胸部、腸道、鞘翅、背部表皮和卵巢進(jìn)行空間表達(dá)模式分析。通過Primer Premier 6.0軟件設(shè)計引物q-PjTDC1（表1）用于實時定量PCR（quantitative real-time PCR， qRT-PCR），使用RPS18作為內(nèi)參基因[24]，并采用2－△△Ct法計算靶標(biāo)基因的表達(dá)水平[25]，均設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，4個技術(shù)重復(fù)。其中：用于時間表達(dá)的卵及1齡、2 齡、3 齡幼蟲，每個生物學(xué)重復(fù)樣本量均為20頭，4齡幼蟲、蛹、成蟲的樣本量為5頭；用于組織表達(dá)的樣品，每個重復(fù)為5頭。qRT-PCR混合反應(yīng)體系：模板cDNA 2.0 μL，上下游引物各0.4 μL，2× TransStart○R" Top Green qPCR SuperMix（＋Dye Ⅰ）5.0 μL，用超純水補足至 10 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃ 5 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 10 s，40個循環(huán)。qRT-PCR試劑購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.7 數(shù)據(jù)分析

實驗結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用 t 檢驗法分析2組樣本均值的差異顯著性；采用單因素方差分析，采用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。數(shù)據(jù)分析和作圖采用SPSS 26.0和Graphpad Prism 6軟件。圖片處理采用 Photoshop 2022和Adobe Illustrator 2020軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 PjTDC1蛋白的理化性質(zhì)以及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

基于龜紋瓢蟲的基因組和轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，共鑒定到4個龜紋瓢蟲TDC基因，并根據(jù)氨基酸序列長短依次命名為PjTDC1、PjTDC2、PjTDC3和PjTDC4。這4個PjTDC基因分別編碼Pjao029185.1、Pjao027134.1、Pjao029478.1、Pjao-

027327.1，分別包含575、215、205和106個氨基酸殘基，均含有與TDC相關(guān)的PLN02880結(jié)構(gòu)域，PLN02880結(jié)構(gòu)域分別位于PjTDC1～4蛋白第1～475、9～69、56～203和1～106個氨基酸（圖1A）。PLN02880結(jié)構(gòu)域?qū)儆诹姿徇炼呷╬yridoxal phosphate， PLP）依賴性酶中的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase， AAT）超家族成員的典型結(jié)構(gòu)域。

PjTDC1基因的ORF長度為1 728 bp，預(yù)測PjTDC1蛋白分子量和理論等電點（isoelectirc point， pI）分別為65 074.79 Da和6.17。PjTDC1蛋白的親水性平均系數(shù)為－0.220，是親水性蛋白。對PjTDC1蛋白進(jìn)行分析，未發(fā)現(xiàn)明顯的信號肽切割位點，推測為非分泌蛋白。預(yù)測顯示，PjTDC1蛋白無跨膜區(qū)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，PjTDC1蛋白被定位在細(xì)胞質(zhì)中。通過二級結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)PjTDC1蛋白由α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)組成，占比分別為46.96%、14.26%、5.39%、33.39%（圖1B）。以白蠟窄吉?。ˋgrilus planipennis）的TDC蛋白三級結(jié)構(gòu)為模板（A0A1W4XJ75.1.A）通過同源建模構(gòu)建龜紋瓢蟲PjTDC1蛋白三級結(jié)構(gòu)，PjTDC1蛋白構(gòu)建三級結(jié)構(gòu)的序列與模板蛋白序列的覆蓋度為0.86，序列相似度為73.69%（圖1C）。PjTDC1蛋白的三級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋組成，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。

2.2 TDC基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)龜紋瓢蟲與其他物種的TDC蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖 2）顯示，龜紋瓢蟲PjTDC1蛋白與甘薯小象甲（Cylas formicarius）的XP_060529679.1聚在同一分支，同源性最高；龜紋瓢蟲PjTDC2與米象（Sitophilus oryzae）XP_030761693.1親緣關(guān)系最近；PjTDC3與牛犀金龜（Onthophagus taurus）XP_022920893.1親緣關(guān)系最近，有最高的同源性；PjTDC4與白蠟窄吉丁XP_018332420.1親緣關(guān)系最近。4個PjTDC蛋白與馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata）XP_023025865.1和小蜂窩甲蟲（Aethina tumida）XP _019873389.1親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 PjTDC1時空表達(dá)模式分析

通過qRT-PCR對PjTDC1基因在龜紋瓢蟲不同發(fā)育時期（卵、1～4齡幼蟲、蛹、雌蟲羽化第1、2、3、4、5、7和9天）和雌蟲羽化第5天的不同組織（頭、胸部、腸道、卵巢、鞘翅、背面表皮）的時空表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，PjTDC1在1齡幼蟲中的表達(dá)水平最高，在卵中的表達(dá)量僅為1齡幼蟲中表達(dá)量的34％，PjTDC1表達(dá)水平隨著幼蟲的發(fā)育進(jìn)程呈現(xiàn)降低的趨勢，在4齡幼蟲達(dá)到最低（圖3A）。從4齡幼蟲到羽化第1天的雌蟲，PjTDC1的表達(dá)水平急速上升，且在羽化第1天達(dá)到成蟲期的峰值。在羽化第1～7天的雌蟲中，PjTDC1的表達(dá)水平呈現(xiàn)下降趨勢，然而在成蟲羽化的第9天再次升高（圖3A）。從組織表達(dá)特異性來看，PjTDC1基因在羽化第5天的雌蟲卵巢、背部表皮和頭部中的表達(dá)量較高，在胸部的表達(dá)量相對較低（圖3B）。

2.4 PjTDC1基因沉默對生殖發(fā)育的影響

為了進(jìn)一步探索PjTDC1基因的功能，通過RNAi技術(shù)對龜紋瓢蟲PjTDC1基因進(jìn)行敲低。qRT-PCR結(jié)果顯示，PjTDC1基因的表達(dá)水平在注射dsRNA后第1 天與dsGFP對照組相比顯著下降31.98%，第2 天顯著下降62.04%，第3 天顯著下降39.32%（圖4A）。進(jìn)一步評估PjTDC1基因敲低對龜紋瓢蟲生殖發(fā)育的影響，注射后第3 天，dsGFP對照組初級卵母細(xì)胞逐步膨大，開始沉積卵黃，卵母細(xì)胞呈現(xiàn)淺黃色；然而dsPjTDC1處理組卵母細(xì)胞較小，卵黃沉積少。注射后第5天，相比dsGFP對照組，dsPjTDC1處理組的卵母細(xì)胞發(fā)育遲緩，多數(shù)卵母細(xì)胞沒有完成卵黃沉積。注射后第7天，dsGFP對照組大量卵母細(xì)胞完成卵黃沉積發(fā)育成熟，而dsPjTDC1處理組僅有個別卵母細(xì)胞發(fā)育成熟（圖4B）。初步推測，PjTDC1基因的敲低主要影響卵母細(xì)胞中卵黃沉積過程。

觀察和檢測PjTDC1基因敲低對卵巢管長度和卵母細(xì)胞寬度發(fā)育的影響（圖5），dsPjTDC1處理組和dsGFP對照組的卵巢管長度無顯著差異；但注射后第1天和第3天dsPjTDC1處理組的初級卵母細(xì)胞寬度比對照組顯著降低10.03%和18.60%，處理組初級卵母細(xì)胞的寬度分別為162.71 μm和290.63 μm，對照組則分別為180.84 μm和357.06 μm。進(jìn)一步驗證PjTDC1基因的敲低影響卵母細(xì)胞卵黃沉積。

3 討論

TDC作為OA合成的關(guān)鍵酶，在生殖發(fā)育中扮演重要角色。本研究克隆了龜紋瓢蟲PjTDC1基因，分析了PjTDC1～4基因的基本結(jié)構(gòu)和分子特征，探索了PjTDC1基因在不同組織和不同發(fā)育時期的表達(dá)模式，初步驗證了PjTDC1基因在龜紋瓢蟲中的功能。本研究發(fā)現(xiàn)龜紋瓢蟲中存在4個TDC同源基因，并且4個TDC蛋白均含有與酪氨酸脫羧酶相關(guān)的結(jié)構(gòu)域PLN02880。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，PjTDC1與甘薯小象甲XP_060529679.1有最高同源性，PjTDC2與米象XP_030761693.1親緣關(guān)系最近，PjTDC3與牛犀金龜XP_022920893.1親緣關(guān)系最近，PjTDC4與白蠟窄吉丁XP_018332420.1有較高同源性。結(jié)果表明TDC基因具有很高的進(jìn)化保守性。

在時空表達(dá)模式分析中發(fā)現(xiàn)，PjTDC1在龜紋瓢蟲不同發(fā)育階段和不同組織中均有表達(dá)，這表明PjTDC1在龜紋瓢蟲的不同發(fā)育時期和不同組織中均發(fā)揮著重要的調(diào)控功能[26]。PjTDC1在龜紋瓢蟲1齡幼蟲中表達(dá)水平最高，在幼蟲期整體呈現(xiàn)逐漸下降的表達(dá)趨勢。PjTDC1在龜紋瓢蟲1齡幼蟲中的高表達(dá)與鞘翅目模式昆蟲赤擬谷盜（T. castaneum）OA受體基因OctβR3和褐飛虱（Nilaparvata lugens）OA家族受體基因NIOA3的表達(dá)模式類似[27-28]。因此，推測PjTDC1在龜紋瓢蟲幼蟲發(fā)育早期的高表達(dá)可能預(yù)示PjTDC1基因與赤擬谷盜OctβR3和褐飛虱NIOA3具有相似的功能。結(jié)合這些研究結(jié)果推測，在幼蟲的發(fā)育過程中，昆蟲對OA合成的需求逐漸降低，OA在幼蟲的早期發(fā)育中發(fā)揮更關(guān)鍵的功能。當(dāng)龜紋瓢蟲從蛹期羽化為成蟲時，PjTDC1基因的表達(dá)水平顯著升高；然而，隨著成蟲日齡的增加，PjTDC1的表達(dá)水平持續(xù)下降。這一表達(dá)趨勢與家蠶（Bombyx mori）、亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）中與卵巢發(fā)育、卵子成熟相關(guān)的卵巢絲氨酸蛋白酶編碼基因BmOsp和OfOsp1的情況一致[29-30]。推測PjTDC1基因在蛹期羽化為成蟲時的上調(diào)表達(dá)與龜紋瓢蟲羽化以及羽化后成蟲卵巢快速發(fā)育和卵子成熟相關(guān)。這一結(jié)果與PjTDC1在卵巢中的高表達(dá)一致，暗示PjTDC1基因參與龜紋瓢蟲成蟲期卵巢的發(fā)育和卵形成調(diào)控過程。

為驗證上述推論，進(jìn)行了RNAi實驗，結(jié)果表明，PjTDC1基因的沉默影響卵母細(xì)胞的卵黃沉積過程。dsRNA注射后第3天，dsPjTDC1處理組卵母細(xì)胞較小，卵黃沉積少。在第5天和第7天，dsPjTDC1處理組僅有個別卵母細(xì)胞發(fā)育成熟，而dsGFP對照組大量卵母細(xì)胞完成卵黃沉積發(fā)育成熟。這與褐飛虱中OA合成酶基因NlTβH在卵巢發(fā)育中的功能研究結(jié)果一致[31]。褐飛虱中NlTβH的敲低抑制OA合成水平，阻礙環(huán)腺苷酸/蛋白激酶A信號通路和保幼激素合成相關(guān)信號通路關(guān)鍵基因的表達(dá)[31]，導(dǎo)致卵黃原蛋白水平顯著降低，卵黃沉積受到抑制。OA通過特異性結(jié)合G-蛋白偶聯(lián)受體進(jìn)而調(diào)控第二信使環(huán)腺苷酸，從而實現(xiàn)調(diào)控昆蟲的產(chǎn)卵、排卵、精子釋放和覓食等多種行為[13]。除此之外，研究表明OA還能間接作用于咽側(cè)體和前胸腺，調(diào)節(jié)保幼激素和蛻皮激素的合成和分泌，進(jìn)而通過影響卵黃生成和卵母細(xì)胞的成熟影響生殖[21， 31]。在果蠅中發(fā)現(xiàn)，OA合成酶基因的敲除造成雌性生殖缺陷，主要通過影響輸卵管肌肉和排卵過程實現(xiàn)[32-33]。本研究發(fā)現(xiàn)PjTDC1基因正調(diào)控龜紋瓢蟲卵巢卵黃沉積和初級卵母細(xì)胞寬度，推測這種調(diào)控作用很可能是通過對保幼激素和蛻皮激素的調(diào)控而實現(xiàn)的，但具體的分子機理還有待研究。

4 結(jié)論

本研究明確了龜紋瓢蟲PjTDC1基因的基本結(jié)構(gòu)特征以及在不同發(fā)育階段和不同組織中的時空表達(dá)模式，探明了PjTDC1基因表達(dá)量隨著幼蟲齡期、成蟲日齡的增長而逐漸降低，并在羽化第5天的雌性成蟲卵巢、背部表皮和頭部中有較高水平的表達(dá)。除此之外，通過RNA干擾實驗證實了PjTDC1基因?qū)敿y瓢蟲卵黃沉積和卵形成的正調(diào)控作用。

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（責(zé)任編輯：王國鑫" " 責(zé)任校對：王小璐）