菠菜HD-ZIP III基因家族鑒定與表達分析

摘" 要： 植物葉片在生長發(fā)育過程中，近-遠軸極性的建立與維持是葉片正常行使光合效應、呼吸作用、蒸騰作用的結構基礎. HD-ZIP III是重要的葉片近軸極性基因，本研究在菠菜（Spinacia oleracea）基因組中鑒定到3個HD-ZIP III基因家族成員，依次命名為SoHB1，SoHB2和SoHB3，并對其蛋白理化性質、保守結構域和進化關系進行了分析. 研究結果表明：3個HD-ZIP III蛋白都具有4個保守結構域. 共線性分析表明：菠菜SoHB1，SoHB2和SoHB3分別與擬南芥ATHB8，ATREV和ATHB15存在共線性關系. 啟動子順式作用元件預測結果表明：菠菜HD-ZIP III家族基因啟動子上游包含光響應、逆境脅迫反應、激素響應等順式作用元件. 在不同葉型菠菜種質中的表達模式分析結果表明：單戟型葉片的SoHBs表達量最高；此外，經干旱脅迫處理后，SoHB1，SoHB2和SoHB3的基因表達量普遍下降；對菠菜包括根、莖、薹葉、功能葉、薹葉柄、功能葉柄等部位進行表達分析，發(fā)現(xiàn)SoHB1在根部表達最為豐富，SoHB2和SoHB3在薹葉處表達最為豐富.

關鍵詞： 菠菜（Spinacia oleracea）； HD-ZIP III基因家族； 干旱脅迫； 基因表達量

中圖分類號： S 636.1""" 文獻標志碼： A""" 文章編號： 1000-5137（2024）03-0352-10

Identification and expression analysis of HD-ZIP III gene family in spinach

LIU Zihan1?， ZHANG Qiyue1?， YUAN Man1， WENG Li1， SHAO Feng2，

GU Lijun2， CAI Xiaofeng1*

（1.College of Life Sciences， Shanghai Normal University， Shanghai 200234， China； 2.Shanghai Chongming

Vegetable Science and Technology Extension Station， Shanghai 202150， China）

Abstract： During the growth and development of plant leaves， the establishment and maintenance of paraxial and abaxial polarity are essential for the normal functioning of photosynthesis， respiration and transpiration. HD-ZIP III genes play a crucial role in establishing leaf adaxial polarity. In this study， three HD-ZIP III family genes were identified in the spinach genome， and designated as SoHB1， SoHB2 and SoHB3. Their physicochemical properties， conserved domains and evolutionary relationships were analyzed. The results showed that all three HD-ZIP III proteins possessed four conserved domains. Collinear analysis indicated that spinach SoHB1， SoHB2 and SoHB3 exhibited collinear relationships with Arabidopsis ATHB8， ATREV and ATHB15 respectively. The prediction results of promoter cis-acting elements reveled that the promoters of spinach HD-ZIP III family genes contained cis-acting elements related to light response， stress response and hormone response. Analysis of expression patterns in spinach germplasms with different leaf types indicated that the single halberd leaf exhibited the highest expression of HD-ZIP III. Furthermore， the expression levels of SoHB1， SoHB2 and SoHB3 genes decreased following drought stress treatment. Expression analysis across various parts of spinach， including roots， stems， bolting leaves， functional leaves， bolting petioles， functional petioles and others， showed that SoHB1 was predominantly expressed in roots， while SoHB2 and SoHB3 were predominantly expressed in bolting leaves.

Key words： spinach （Spinacia oleracea）； HD-ZIP III gene family； drought stress； gene expression

0" 引言

同源異型域-亮氨酸拉鏈（HD-ZIP）蛋白屬于同源異型域（HD）轉錄因子超家族［1］，是高等植物所特有的轉錄因子［2］. 轉錄因子參與的轉錄調控是基因表達調控的重要一步，轉錄因子序列具有DNA結合結構域和轉錄調控結構域，其中，DNA結合調控結構域的主要功能是與靶序列的上游啟動子區(qū)域特異的DNA序列相結合；轉錄調控結構域既可以激發(fā)轉錄活性，也可以抑制轉錄活性，兩段序列共同作用調控靶基因表達［3］. HD-ZIP蛋白所具有的同源異型結構域和亮氨酸拉鏈（LZ）結構域是該蛋白的結構基礎，其HD結構域是一種由60或61個氨基酸組成保守結構域，這些氨基酸序列折疊成1個三螺旋結構，能夠與DNA特異性相互作用；HD-Zip家族的成員在HD下游有一個亮氨酸拉鏈基序，HD結構域提供了蛋白與DNA結合的能力，而LZ結構域對于識別DNA極為重要［4］. 根據(jù)HD-ZIP蛋白所參與的不同代謝及除HD-ZIP外的其他保守結構域［5］，HD-ZIP家族可以分為4個亞家族：HD-ZIP I～IV［6］，分別具有不同的基因功能［7］. 其中，HD-ZIP III作為蛋白結構最復雜的亞家族，在植物側生器官的發(fā)生、側生器官極性的建立和維管系統(tǒng)的發(fā)育等多種細胞分化過程中都起著重要作用，是植物生長發(fā)育過程中重要的影響因子［8］.

HD-ZIP III轉錄因子是葉片近-遠軸極性建成的重要影響因素. 植物葉片在細胞形態(tài)、生理功能、組織結構上的不對稱性被稱為葉片極性［9］，葉片極性呈中-邊、基-頂、近-遠3條軸分布［10］，其中，近-遠軸（近軸面是靠近莖間分生組織的一面，遠軸面是遠離莖間分生組織的一面）極性建成是葉光合效應、蒸騰作用等多種功能行使的重要結構基礎：葉近軸面細胞排列均勻緊湊并富含大量葉綠體，遠軸細胞分布不規(guī)則且排列松散. 葉組織中的維管束結構也都分別具有近-遠軸極性分布及輸送功能差異；維管束結構中的木質部位主要集中分布于近軸面，負責水分物質及各種礦物質成分的輸送；韌皮部位主要集中分布于遠軸面，負責各種糖類物質及各種有機物的輸送［2］. 植物葉片近-遠軸極性的建立是植物正常生長發(fā)育的基礎.

菠菜（Spinacia oleracea）是重要綠葉類蔬菜作物之一，以幼嫩的莖和葉片為主要食用部位. 葉片的近-遠軸極性建立通過影響葉片光合作用、蒸騰作用等生理功能影響葉片發(fā)育，因此，研究菠菜葉片的近-遠軸極性發(fā)育和調控對解析菠菜葉片形成和產量增加具有重要的研究意義. 在對擬南芥的研究中，HD-ZIP III作為近軸極性基因［11］，它的缺失會導致葉片遠軸化特征加重，葉片近軸面細胞間距增大， 而遠軸面細胞形態(tài)趨于規(guī)則，細胞密度增加［12］，葉邊緣下卷，嚴重的葉片會皺縮甚至無法擴張，而HD-ZIP III的過度表達會加重葉片近軸化，破壞近-遠軸極性的建立［2］. 本研究在菠菜基因組中進行HD-ZIP III基因的鑒定，對其蛋白理化性質、保守結構域、進化關系和表達模式進行分析，為后期HD-ZIP III基因的克隆與功能分析提供理論基礎.

1" 材料與方法

1.1 菠菜HD-ZIP III基因家族成員鑒定及理化性質分析

為系統(tǒng)全面地鑒定菠菜HD-ZIP III基因家族成員，從Pfam（http：//pfam.xfam.org/）網站下載HD-ZIP III保守結構域的隱馬爾可夫模型文件（PF00046，PF02183，PF08670和PF01852），在菠菜數(shù)據(jù)庫（http：//spinachbase.org/？q=home）下載菠菜全基因組序列、蛋白序列及結構注釋文件［13］. 利用TBtools軟件從菠菜全基因組序列中篩選得到具有相同保守結構域的候選蛋白序列［14］，并將候選蛋白序列提交到NCBI-Conserved Domain Search Service 進行蛋白保守結構域分析，得到菠菜HD-ZIP III基因家族成員，并根據(jù)所處染色體的位置重新命名. 利用網站ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）對HD-ZIP III氨基酸序列進行理化性質分析，包括分子質量、等電點（pI）、不穩(wěn)定指數(shù)和親水性系數(shù). 利用在線工具SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）預測蛋白的二級結構. 利用在線工具EukmPLOC（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/）預測亞細胞定位.

1.2 菠菜HD-ZIP III基因家族系統(tǒng)進化分析與功能預測

在NCBI下載擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、甜菜（Beta vulgaris）的HD-ZIP III蛋白序列，利用ClustalW進行多重比對，用MEGA7.0軟件構建系統(tǒng)進化樹［15］，并根據(jù)進化關系及已知的擬南芥HD-ZIP III基因功能預測菠菜HD-ZIP III基因家族成員的功能. 利用TBtools對擬南芥和菠菜的全基因組序列進行基因組共線性分析，以印證AtHBs基因與SoHBs基因之間的線性化關系.

1.3 保守結構域與順式作用元件可視化分析

利用NCBI-Conserved Domain Search Service數(shù)據(jù)庫進行擬南芥、水稻、甜菜、菠菜的HD-ZIP III蛋白序列保守結構域分析；提取菠菜HD-ZIP III基因起始密碼子前2 000 bp的DNA序列，提交至PlantCARE（http：//Bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預測順式作用元件，并采用TBtools進行基因結構與順式作用元件分析與可視化.

1.4 保守基序與基因共線性可視化分析

利用MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）進行氨基酸序列保守基序分析，并將獲得的菠菜、擬南芥各染色體序列與結構注釋提交至TBtools-One Step MCScanX. 將兩者的分析結果利用TBtools進行可視化分析.

1.5 菠菜材料的培養(yǎng)與脅迫處理

以上海師范大學植物種質資源中心保存的菠菜種質S4為材料，在人工氣候室中進行穴盤育苗，基質中，珍珠巖、蛭石、草炭的體積比約為1∶1∶1. 幼苗長出兩片真葉時，將長勢相似、發(fā)育良好的菠菜幼苗移植于培養(yǎng)盆中，培育于氣候室內，氣候室光周期為每天光照10 h，溫度21 ℃，黑暗環(huán)境下溫度為18 ℃，光照強度約為5 000 lx，濕度設定為70%.

培育一周后，對幼苗分別使用質量濃度為5%和10%的聚乙二醇溶液進行干旱脅迫，分別于處理后的1，2，3，4 d后采集菠菜葉片，用液氮處理并保存于-80 ℃的環(huán)境下；使用物質的量濃度為400 mmol?L-1的NaCl溶液對菠菜材料進行鹽脅迫處理，并分別于處理2，6，12，24 h后采樣；使用黑色塑料袋與塑料罩罩住菠菜，模擬黑暗脅迫環(huán)境，分別于處理1，2，3，4 d后采樣；對已經抽薹的S4材料，分別采取根、莖、薹葉、功能葉、薹葉柄、功能葉柄；對具有典型葉片形狀的不同品種菠菜葉片（圓形葉片、單戟形葉、雙戟形葉、三戟形葉、光滑葉片和褶皺葉片）進行采樣分析.

1.6 RNA提取與基因表達分析

以Trizol法提取菠菜葉片RNA，使用反轉錄試劑盒將提取的RNA反轉錄成cDNA，使用SYBR Green試劑盒在Applied Biosystems 7500 Real Time PCR儀器上進行實時熒光定量PCR實驗. 以So18s作為內參基因，以未經處理的、生長狀態(tài)類似的S4材料為空白對照，每個反應設定3次重復，用2-ΔΔCt法計算相對基因表達量.

2" 結果與分析

2.1 菠菜HD-ZIP III基因家族成員全基因組鑒定與理化性質分析

根據(jù)菠菜基因組數(shù)據(jù)鑒定出3個菠菜HD-ZIP III家族成員，其基因編號分別是SOV1g036220.1，SOV2g023480.1和SOV4g057220.1，根據(jù)其在染色體上的位置依次命名為SoHB1，SoHB2和SoHB3. 其中，分子質量最小的是SoHB3（92.1），分子質量最大的是SoHB1（95.1）；pI分別是5.75，6.12和6.03；不穩(wěn)定系數(shù)分析表明，三者均屬于不穩(wěn)定蛋白質（不穩(wěn)定系數(shù)40以下穩(wěn)定性良好，40以上不穩(wěn)定），其中SoHB1蛋白質最不穩(wěn)定. 菠菜HD-ZIP III蛋白二級結構類型主要包括α-螺旋、β-轉角、無規(guī)卷曲、擴展鏈結構等幾種形式，其中α-螺旋是占比最高的二級結構主要形式. 預測SoHB1，SoHB2和SoHB3蛋白的亞細胞定位均位于細胞核（表1）.

2.2 菠菜HD-ZIP III基因家族系統(tǒng)進化分析

有研究表明，在雙子葉作物擬南芥中鑒定到5個HD-ZIP III基因，分別是：REV，PHV，PHB，ATHB8和ATHB15［8］. 單子葉植物水稻中的HD-ZIP III成員也有5個：OsHB1，OSHB2，OsHB3，OsHB4，OsHB5［16］. 通過保守結構域鑒定得到甜菜HD-ZIP III成員：BvHB1，BvHB2，BvHB3，BvHB4. 將各物種HD-ZIP III基因家族成員的氨基酸序列與分析得到的3個SoHBs氨基酸序列，利用MEGA軟件進行多序列比對并構建進化樹，如圖1（a）所示，所有HD-ZIP III家族成員根據(jù)序列同源性可以被分為5個亞組，其中，第1個亞組含有成員SoHB2，BvHB4，ATREV，OsHB1和OsHB2；第2個亞組含有成員APHV，ATPHB，OsHB3和OsHB4；第3個亞組僅含有OsHB5一個成員；第4個亞組含有成員SoHB1，BvHB3，ATHB8；第5個亞組含有成員ATHB15，SoHB3，BvHB1和BvHB2. 5個亞組中，只有第1個亞組涵蓋了擬南芥、水稻、菠菜、甜菜4個物種.

對菠菜HD-ZIP III基因家族的外顯子和內含子進行分析，如圖1（b）所示，以進一步了解該基因家族的基因結構. 從內含子與外顯子的位置、序列長度和數(shù)量，可知3個基因的基因結構存在差異. SoHB1序列全長6 699 bp，CDS長2 595 bp，包括17個內含子、18個外顯子，以及5’端長205 bp和35 bp的非編碼基因和3’端長192 bp的非編碼基因. SoHB2序列全長8 111 bp，CDS長2 541 bp，共有17個內含子、18個外顯子，5’端和3’端非編碼基因長度分別為604 bp和201 bp. SoHB3序列全長10 772 bp，CDS長2 514 bp，共有16個內含子，17個外顯子，5’端和3’端非編碼基因長度分別為938 bp和337 bp.

2.3 菠菜HD-ZIP III基因家族保守結構域與共線性分析

對菠菜、擬南芥、水稻和甜菜的HD-ZIP III蛋白保守結構域進行比較分析（圖2），除OsHB3外，其他HD-ZIP III蛋白都具有4個相同的保守結構域，其分布位置與氨基酸殘基數(shù)量都大致相同，從N端到C端依次是同源異型結構域（homeobox）、亮氨酸拉鏈結構域（bZIP）、START結構域和MEKHLA結構域. 而OsHB3所具有的結構域BRLZ（basic region leucin zipper）表明其是bZIP supperfamily的一員. 通過對菠菜、擬南芥、水稻和甜菜HD-ZIP III蛋白homeobox-bZIP保守序列進行多序列比對，發(fā)現(xiàn)HD-ZIPIII序列有高度保守性，可以觀察到亮氨酸拉鏈結構域的結構特征，即亮氨酸（Leucine，L）規(guī)律地每7個氨基酸出現(xiàn)一次（圖3）.

相關序列在NCBI的編號依次是：

OsHB1： NP_001388949； OsHB2： NP_001390961.1； OsHB3： NP_001067260.1； OsHB4： NP_001050745.1； OsHB5： BAG31403.1； SoHB1： XP_021847759.1； SoHB2： XP_021858740.1； SoHB3： XP_021836126.1； PgHB3： ADV04322.1； PgHB4： HQ391915； PgHB5： ADV04323.1； PgHB6： ADV04325.1； PpHB10： ABG73235.1； PpHB11： ABG73236.1； PpHB12： ABG73237.1； PpHB13： ABG73238.1； PpHB14： ABG73239.1； BvHB1： XP_010691423.1； BvHB2： XP_048492725.1； BvHB3： XP_010668539.1； BvHB4： XP_010689538.2； ATPHB： NP_181018.1； ATPHV： NP_174337.1； ATREV： NP_200877.1； AtHB15： NP_001077702.1； AtHB8： NP_195014.1.

通過對擬南芥與菠菜的全基因組共線性分析（圖4），鑒定出ATREV（AT5G60690）與SoHB2（SOV2g023480），ATHB8（AT4G32880）與SoHB1（SOV1g36220）和ATHB15（AT1G52150）與SoHB3（SOV4g057220）三對共線性蛋白基因.

2.4 菠菜HD-ZIP III基因家族保守基序與順式作用元件分析

菠菜SoHBs保守基序分析結果表明，3個菠菜HD-ZIP III蛋白具有相似的保守基序結構，如圖5（a）所示，每個氨基酸序列中都含有鑒定出的8個保守基序，且每個保守基序在氨基酸序列上排序都是相同的，從5'端至3'端依次是motif1，6，2，5，4，8，7和3，如圖5（b）所示.

對菠菜HD-ZIP III家族基因起始密碼子上游2 000 bp的基因序列進行順式作用元件預測（圖6）發(fā)現(xiàn)，在這3個基因啟動子區(qū)域共鑒定出39種順式作用元件，除了常見的ATAT box與CAAT box外，主要包括：光響應元件、植物激素（Abscisic Acid，Gibberellic Acid和MeJA）響應元件和參與逆境（干旱、無氧和低溫）誘導的作用元件. 所有順式作用元件中，參與光響應的順式作用元件種類最多，數(shù)量也最多. SoHB2和SoHB3基因啟動子區(qū)域均具有赤霉素響應元件和參與干旱誘導的作用元件，而SoHB1基因啟動子區(qū)域不具有.

2.5 菠菜HD-ZIP III表達模式分析

干旱脅迫后對菠菜葉片中HD-ZIP III基因的表達量進行分析，如圖7所示，與未經處理的對照組（0）相比，經干旱處理后葉片的SoHBs表達量普遍下降，僅經10% PEG-6000處理后第2天SoHB2表達量有所升高.

黑暗脅迫后，4 d內SoHBs基因表達并不規(guī)律，如圖8（a）所示，其中SoHB1在第1，2天和第4天表現(xiàn)為表達量降低，第3天表達量升高；SoHB3在第1，2，3天表現(xiàn)為表達量降低，第4天表達量升高；SoHB2在第1天表達量降低，第2，3，4天表達量升高.

經鹽脅迫處理后，進行SoHBs表達量分析，如圖8（b）所示，4 d內SoHB2表達量均高于對照組；SoHB1表達量僅在第1天高于對照組，第2，3，4天均低于對照組 ；SoHB3表達量在第3天表達量低于對照組，第1，2和4天均高于對照組.

對菠菜根、莖、功能葉、薹葉、功能葉柄、薹葉柄等不同部位SoHBs進行表達量分析，結果如圖9（a）所示， SoHB1在根部表達量最高，SoHB2，SoHB3在薹葉處表達量最高.

對比了有著不同葉形葉片（圓葉、戟形葉、光滑葉、褶皺葉）的SoHBs基因表達量，結果如圖9（b）所示，戟形葉的基因表達量要高于圓葉. 其中，單戟葉片的HD-ZIP III基因表達量最高；褶皺葉片的HD-ZIP III基因表達量要高于光滑葉片.

3" 討 論

本研究從菠菜基因組中共鑒定出3個HD-ZIP III基因家族成員，通過對其蛋白理化性質的分析，以及基因結構、保守結構域、保守基序、順式作用元件和進化關系的分析后，發(fā)現(xiàn)這3個菠菜HD-ZIP III基因家族成員在系統(tǒng)進化中高度保守，且都具有相似的結構特征和相同的保守結構域：同源異型結構域、亮氨酸拉鏈結構域、START結構域和MEKHLA結構域，可以認為這4個結構域是HD-ZIP III家族的蛋白質結構特征［17］. 其中，MEKHLA結構域是HD-ZIP家族中HD-ZIP III亞家族所特有的［2］.

系統(tǒng)進化分析表明，擬南芥REV，PHB和PHV遺傳距離相近，這與PHV，REV和PHB三者功能冗余，且都參與控制莖尖分生組織（SAM）細胞分裂、葉片近軸極性維持及維管束結構分化［18］的結論吻合. 推測與REV，PHB和PHV同源性相近的菠菜基因SoHB2具有與三者類似的生物學功能. 從序列同源性和進化樹分析來看，擬南芥ATHB8與菠菜SoHB1基因，ATHB15與菠菜SoHB3基因高度近似. 而ATHB8和ATHB15在擬南芥維管束組織處表達，通過調控生長素的含量及其分布來影響維管形成層的分化［19］. 推測菠菜基因SoHB1與SoHB3具有與ATHB8和ATHB15相似的調節(jié)生長素含量及分布的功能. 結合3對基因間展現(xiàn)的共線性關系和進化樹分析，推測SoHB2可能參與控制莖尖分生組織細胞分裂和葉片近軸極性維持及維管束結構分化，SoHB1和SoHB3可能以調控生長素的含量及其分布來影響維管形成層的分化.

根據(jù)啟動子元件推斷，菠菜基因HD-ZIP III的表達可能受環(huán)境調控，對光、低溫、干旱等脅迫有響應. 通過比較干旱狀態(tài)下葉片HD-ZIP III的基因表達量可以看出，干旱脅迫與HD-ZIP III基因表達有所關聯(lián)，干旱狀態(tài)下的HD-ZIP III表達量明顯低于正常狀態(tài)，可以推測SoHBs針對干旱脅迫存在某種響應機制. 在對菠菜不同部位SoHBs表達量的研究中發(fā)現(xiàn)，SoHB1在根部表達量最高，SoHB2和SoHB3在薹葉處表達量最高，在后續(xù)對菠菜近-遠軸相關基因的研究中，可以優(yōu)先以薹葉與根為研究材料. 具有較高HD-ZIP III基因表達量的單戟、褶皺葉型菠菜種質US339可用于接下來關于菠菜近-遠軸極性的研究實驗.

葉片近-遠軸極性建立是葉片正常行使生理功能的結構基礎，這一過程與葉片光合效應、呼吸作用和蒸騰效應等重要的生理過程密切相關. 葉片近軸極性的增強或遠軸極性的缺失，將會使葉片遠軸面細胞由原本形態(tài)不規(guī)則、胞間距相對較大的細胞逐漸變?yōu)榘g距窄小且形態(tài)相對規(guī)整的細胞，特征上類似于近軸面細胞，葉片邊緣逐漸上卷，近軸化劇烈的葉片甚至無法舒展. 葉片遠軸面極性的增強或近軸面極性的缺失會導致葉片遠軸化，葉片近軸面細胞出現(xiàn)遠軸面特征，葉緣下卷［7］. 近-遠軸極性的建立與調節(jié)涉及復雜的基因調控機制，其中主要包括近軸極性基因、遠軸極性基因、葉面發(fā)育基因等. 葉片極性基因之間往往還存在促進和拮抗關系，作為近軸極性基因的HD-ZIP III與遠軸極性基因KAN，在KAN的缺失突變體中，HD-ZIP III往往過度表達，而HD-ZIP III的缺失突變體葉片出現(xiàn)遠軸化現(xiàn)象［20］. 對不同植物近-遠軸極性建立的過程中，基因家族間的作用過程、逆境環(huán)境下表達量的變化與作用機制都值得深究. 對SoHBs基因的亞細胞定位、作為近軸極性基因的SoHBs與遠軸極性基因KAN之間的相互作用，以及SoHBs基因的克隆與功能分析將作為下一步的研究內容.

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（責任編輯：顧浩然）