基于磁性納米粒子的固定化胰脂肪酶制備條件的研究

摘 要：胰脂肪酶（Pancreatic Lipase，PL）作為一種高效的生物催化劑和治療肥胖的關(guān)鍵靶點(diǎn)，已經(jīng)在食品工業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，但游離胰脂肪酶穩(wěn)定性較差，活力不易保持且難以重復(fù)利用。本研究以磁性納米粒子（Magnetic Nanoparticles，MNPs）為載體，利用MNPs與PL的親和作用，構(gòu)建了PL功能化的MNPs（PL-MNPs）篩選模型。以PL的酶固載量和相對酶活為考察指標(biāo)對PL-MNPs的合成條件進(jìn)行單因素和響應(yīng)面優(yōu)化，確定PL-MNPs的最佳合成條件為pH=6.53，酶濃度25.28 mg·mL-1，固定化溫度30.69 ℃，固定化時(shí)間3.00 h。在此條件下，理論酶固載量為144.95 μg·mg-1，相對酶活為94.27%。

關(guān)鍵詞：胰脂肪酶；磁性納米粒子；固定化酶

Study on the Preparation Conditions of Immobilized Pancreatic Lipase Based on Magnetic Nanoparticles

LIU Cuicui1， CHEN Yushi2

（1.Food and Drug Safety Inspection Center of Maanshan， Maanshan 243000， China;"2.School of Chemistry， Fuzhou University， Fuzhou 350000， China）

Abstract： Pancreatic lipase （PL）， as an efficient biocatalyst and key target for treating obesity， has been widely used in the food industry and pharmaceutical fields. However， the stability of free pancreatic lipase is poor， and its activity is difficult to maintain and reuse. In this study， magnetic nanoparticles （MNPs） were used as carriers， and a PL-functionalized MNPs （PL-MNPs） screening model was constructed by using the affinity between MNPs and PL. The synthesis conditions of PL-MNPs were optimized by single factor and response surface methodology based on the enzyme immobilized capacity and relative enzyme activity of PL. The optimum synthesis conditions"were determined as follows： pH=6.53， enzyme concentration 25.28 mg·mL-1， immobilization temperature 30.69 ℃ and"immobilization time 3.00 h. Under these conditions， the theoretical enzyme immobilized capacity was 144.95 μg·mg-1 and the relative enzyme activity was 94.27%.

Keywords： pancreatic lipase; magnetic nanoparticles; immobilized enzymes

胰脂肪酶（Pancreatic Lipase，PL）是一種羧酸酯酶，由胰腺腺泡細(xì)胞分泌，能夠消化水解膳食中50%～70%的三酰甘油酯[1]，是開發(fā)抗肥胖藥物的重要靶點(diǎn)。然而游離胰脂肪酶存在分離純化成本高，活性容易受到外界環(huán)境影響，無法回收再利用等問題，限制了其工業(yè)化應(yīng)用[2]。因此，將胰脂肪酶與合適的載體結(jié)合以固定化，改善其穩(wěn)定性并提高重復(fù)利用率，具有廣泛的應(yīng)用前景[3-4]。磁性納米粒子（Magnetic Nanoparticles，MNPs）又稱磁珠，是一種由磁性物質(zhì)和非磁性聚合物復(fù)合而成的粒子尺寸在0～100 nm的新型材料[5]。由于具有高比表面積、高穩(wěn)定性、低毒和高傳質(zhì)性，常作為固定化良好載體，實(shí)現(xiàn)長效釋放和靶向傳遞，從而保護(hù)和提高活性化合物的生物利用度[6]。將酶固定在修飾的MNPs上，酶的耐酸堿性、熱穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性都會有很大提升[7]。本文將MNPs與PL結(jié)合，制備固定化胰脂肪酶（PL-MNPs），并對其制備條件進(jìn)行優(yōu)化，為胰脂肪酶的應(yīng)用和研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

M3-P100羧基磁珠購自上海奧潤科技有限公司；胰脂肪酶（PL）購自美國Sigma公司；4-硝基苯基丁酸酯、2-嗎啉乙磺酸（MES）、N-羥基丁二酰亞胺（NHS）、1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）均購自麥克林生物試劑有限公司；Tween-20購自中廣東西隴化工有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

磁分離架BeyoMag，上?；茖?shí)驗(yàn)器材有限公司；磁力攪拌器Big Squid，德國IKA公司；渦旋混勻儀VORTEX-5，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；旋轉(zhuǎn)混勻器Thermomixer，北京康高特儀器設(shè)備有限公司；多功能酶標(biāo)儀SpectraMax·iD3，美谷分子儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 固定化PL（PL-MNPs）的合成

（1）磁珠的活化。取羧基磁珠溶液200 μL于2 mL的離心管，加入MEST溶液（含Tween-20的MES溶液）500 μL置于旋轉(zhuǎn)混勻器振蕩混勻，在磁分離架上磁分離去除上清液，重復(fù)洗滌3次后加入200 μL EDC和NHS溶液繼續(xù)振蕩混勻1 h后，進(jìn)行磁分離去除上清液，最后用MEST溶液重復(fù)洗滌4次去除上清液后，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）PL的固定化。取650 μL PL溶液于裝有活化磁珠的離心管中，振蕩混勻1 h后進(jìn)行磁分離去除上清液，加入PBST溶液（含Tween-20的PBS溶液，含有1%甘氨酸，0.05% Tween-20）重復(fù)洗滌4次后去除上清液，加入PBST溶液1 mL于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 酶固載量與酶活力的測定

（1）酶固載量的測定。測定PL固定前后于595 nm處的吸光度值，代入以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)繪制的曲線方程中，計(jì)算獲得PL固定前后上清液的蛋白濃度，并按照公式（1）[8]求得固定后PL-MNPs的酶固載量。

（1）

式中：E為PL-MNPs的固載量，μg·mg-1；C1為固定PL前溶液蛋白含量，μg·mL-1；C2為固定PL后上清液蛋白含量，μg·mL-1；C0為游離磁珠的濃度，mg·mL-1；V1為加入的PL溶液體積，mL；V0為加入的磁珠體積，mL。

（2）酶活力的測定。取Tris-HCl緩沖液800 μL，已配制好的固定化PL溶液（PL-MNPs）100 μL于2 mL的離心管中，37 ℃恒溫水浴10 min后，加入4-硝基苯丁酸酯（pNPB，10 mmol·L-1）溶液100 μL，37 ℃水浴10 min后，吸取200 μL于96孔板中，依次測定不同孔溶液于405 nm處的吸光度值，空白對照組不添加PL-MNPs，并按照公式（2）[9]計(jì)算酶活。

（2）

式中：M為PL-MNPs的酶活；C2為pNPB的濃度，mmol·L-1；C0'為PL溶液中的蛋白含量，μg·mL-1；V2為反應(yīng)體系總體積，mL；V0'為PL溶液體積，μL；t為反應(yīng)時(shí)間，min。

相對酶活按照公式（3）[10]計(jì)算。

（3）

式中：X為PL-MNPs的相對酶活，X1為PL-MNPs的酶活力，X2為游離PL的酶活力。

1.3.3 PL-MNPs固定化條件的優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)。①緩沖液pH值。磁珠濃度（10 mg·mL-1），用不同pH值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的PBS緩沖液配制PL（5 mg·mL-1）溶液，于溫度30 ℃，振蕩速率810 r·min-1下混勻3 h。②PL濃度。磁珠濃度（10 mg·mL-1），用PBS緩沖液（pH=6.5）配制不同濃度（5 mg·mL-1、10 mg·mL-1、15 mg·mL-1、20 mg·mL-1、25 mg·mL-1、30 mg·mL-1）的PL溶液，于溫度30 ℃，振蕩速率810 r·min-1下混勻3 h。③固定化溫度。磁珠濃度（10 mg·mL-1），用PBS緩沖液（pH=6.5）配制PL（25 mg·mL-1）溶液，分別置于不同溫度（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃），振蕩速率810 r·min-1下混勻3 h。④固定化時(shí)間。磁珠濃度（10 mg·mL-1），用PBS緩沖液（pH=6.5）配制PL（25 mg·mL-1）溶液，于溫度30 ℃，振蕩速率810 r·min-1下混勻1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h。

（2）響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對PL-MNPs酶固載量和酶活影響較為顯著的因素，pH（A）、PL濃度（B）與固定化溫度（C）為自變量，利用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì)模型進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)（表1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 PL-MNPs固定化條件單因素優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 緩沖液pH值對PL-MNPs制備影響

PBS緩沖液的不同pH值對PL-MNPs的酶固載量和相對酶活的影響如圖1所示。隨著pH值從5.5提高至6.5，PL-MNPs的酶固載量和相對酶活均逐漸增大；繼續(xù)增大pH值，PL-MNPs的酶固載量和相對酶活均逐漸降低。說明PL-MNPs最適pH值為6.5。

2.1.2 PL濃度對PL-MNPs制備影響

不同PL濃度對PL-MNPs的酶固載量和相對酶活的影響如圖2所示。隨著PL濃度從5 mg·mL-1提高至25 mg·mL-1，PL-MNPs的酶固載量和相對酶活均呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢；繼續(xù)增加PL濃度，PL-MNPs的固載量趨于平緩，相對酶活下降。故選擇PL最佳濃度為25 mg·mL-1。

2.1.3 溫度對PL-MNPs制備影響

不同固定化溫度對PL-MNPs的酶固載量和相對酶活的影響如圖3所示。隨著溫度從25 ℃提高至35 ℃，PL-MNPs的酶固載量和相對酶活均逐漸增大；繼續(xù)升高溫度，PL-MNPs的固載量和相對酶活均呈現(xiàn)下降趨勢。故選擇35 ℃為最適固定化溫度。

2.1.4 時(shí)間對PL-MNPs制備影響

不同固定化時(shí)間對PL-MNPs的酶固載量和相對酶活的影響如圖4所示。由圖4可以看到，隨著固定化時(shí)間從1 h增加至3 h，PL-MNPs的酶固載量和相對酶活均逐漸增大；繼續(xù)延長固定化時(shí)間，PL-MNPs的固載量和相對酶活均下降。故選擇3 h為PL-MNPs的最適固定化時(shí)間。

2.2 PL-MNPs制備條件響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇pH值（A）、PL濃度（B）和固定化溫度（C）為自變量，以PL-MNPs的酶固載量和相對酶活為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見表2。經(jīng)回歸分析得酶固載量和相對酶活與各因素的3元2次回歸方程如下。

酶固載量=144.82+6.12A+2.17B+3.35C+3.18AB+5.02AC+1.08BC-18.62A2-14.52B2-3.82C2（4）

相對酶活=91.22+6.12A+2.14B-3.32C+3.18AB+5.02AC+1.16BC-14.60A2-10.58B2+0.12C2（5）

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證

根據(jù)模型預(yù)測得到PL-MNPs的最佳工藝條件為pH=6.53，酶濃度為25.28 mg·mL-1，固定化溫度為30.69 ℃，固定化時(shí)間3.00 h。在此條件下得到理論酶固載量為144.95 μg·mg-1，相對酶活為94.27%。在實(shí)際操作中，為操作簡便，將PL-MNPs的合成條件最終調(diào)整為pH=6.5，PL濃度25.0 mg·mL-1，固定化溫度30.0 ℃，固定化時(shí)間3.0 h。在此條件下得到的酶固載量為（142.26±1.80） μg·mg-1，相對酶活為91.03%±0.76%。

3 結(jié)論

本研究以羧基磁珠為載體，制備得到固定化胰脂肪酶（PL-MNPs）。通過單因素試驗(yàn)探究了緩沖液pH值、PL濃度、固定化溫度和固定化時(shí)間對PL-MNPs固載量和相對酶活的影響，并通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，獲得PL-MNPs的最佳固定化條件為pH=6.53，酶濃度為25.28 mg·mL-1，固定化溫度為30.69 ℃，固定化時(shí)間為3.00 h。在此條件下得到理論酶固載量為144.95 μg·mg-1，相對酶活為94.27%，大大提高了游離PL的穩(wěn)定性和重復(fù)利用性，為進(jìn)一步推進(jìn)胰脂肪酶在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)。

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