萊茵衣藻LRR-1蛋白多克隆抗體的制備與鑒定

關(guān)鍵詞 萊茵衣藻； 富亮氨酸重復(fù)序列； 先天免疫； 防御反應(yīng)； 多克隆抗體

富亮氨酸重復(fù)序列（leucine-rich repeat，LRR）長(zhǎng)度為20～30 個(gè)氨基酸，可分為高度保守段（highlyconserved segment，HCS）和可變段（variable seg?ment，VS），HCS 通常由11 個(gè)氨基酸殘基組成：Lxx?LxLxxNxL，其中L 為L(zhǎng)eu、Ile、Val 或Phe；N 是Asn、Thr、Ser 或Cys［1-2］。大多數(shù)LRR 結(jié)構(gòu)域由2～45 個(gè)LRR 折疊成弧形或馬蹄形，介導(dǎo)蛋白與蛋白之間的相互作用［3-5］。含有LRRs 的蛋白包括酪氨酸激酶受體、細(xì)胞黏附分子、毒力因子和細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合糖蛋白等，參與多種生物過(guò)程，如激素受體的相互作用、先天免疫反應(yīng)、DNA 修復(fù)、RNA 轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)元發(fā)育、細(xì)胞抗病、凋亡等［6］。

LRR 結(jié)構(gòu)域在許多與動(dòng)植物先天免疫相關(guān)的蛋白質(zhì)中是進(jìn)化保守的。作為第一道防線，先天免疫反應(yīng)是通過(guò)感知病原體相關(guān)分子模式（pathogen-as?sociated molecular patterns，PAMPs）啟動(dòng)的。在植物中，含有核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（nucleotide binding site，NBS）的NBS-LRR 蛋白依賴LRRs 識(shí)別多種病原物［7］；在哺乳動(dòng)物中，Toll 樣受體（toll-like receptors，TLRs）和NOD 樣受體（NOD-like receptors，NLRs）通過(guò)其LRR 結(jié)構(gòu)域，可感知來(lái)自細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)和病毒衍生物的結(jié)構(gòu)多樣的病原微生物標(biāo)志分子［8-9］。研究發(fā)現(xiàn)，一些適應(yīng)性免疫發(fā)育較差的水生動(dòng)物主要依賴于它們的先天免疫，海膽和文昌魚(yú)在缺乏適應(yīng)性免疫的情況下極大地?cái)U(kuò)展了LRR 蛋白庫(kù)［10］。LRR 蛋白在植物中主要參與植物防御反應(yīng)、抵御外界脅迫和調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育等。例如，LRR型伸展蛋白（leucine-rich repeat extensins，LRX）是植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)蛋白，可抵御病原物的入侵，研究表明LRX 蛋白也能被植物非生物脅迫所誘導(dǎo)［11］。擬南芥細(xì)胞壁富亮氨酸重復(fù)序列伸展蛋白LRX3/4/5對(duì)擬南芥的耐鹽性至關(guān)重要，LRXs 可以與快速堿化因子（rapid alkalinization factor，RALF）以及受體樣蛋白激酶（feronia，F(xiàn)ER）作為一個(gè)模塊來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞壁信號(hào)，調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)和耐鹽性［12］。此外，植物中已鑒定的類受體激酶（receptor-like protein kinase，RLK）絕大多數(shù)也屬于LRR 型蛋白［13-15］。水稻Xa21蛋白的胞外LRR 結(jié)構(gòu)在細(xì)胞表面識(shí)別病原體配體后會(huì)誘導(dǎo)胞內(nèi)激酶磷酸化，激活細(xì)胞內(nèi)防御反應(yīng)，保護(hù)水稻免受病原菌的侵害［16］。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)LRR-RLK胞外域LRR 基序之間的結(jié)構(gòu)發(fā)生突變時(shí)，將會(huì)極大影響LRR-RLK 分子作為受體的結(jié)合能力［17-18］。目前，大多數(shù)LRRs 與其配體之間的相互作用方式以及結(jié)合位點(diǎn)仍不清楚，為深入研究LRR 型蛋白功能，闡明其參與生物體先天免疫反應(yīng)的分子機(jī)制，需制備一支能特異性識(shí)別LRR 結(jié)構(gòu)的多克隆抗體。利用分子生物學(xué)技術(shù)將某些功能明確的LRR 基因引入作物中，是提高作物抗逆性和促進(jìn)作物生長(zhǎng)發(fā)育的有效策略。

萊茵衣藻屬于單細(xì)胞真核藻類，具有成本低、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)周期短等優(yōu)點(diǎn)，是一種成熟的模式生物。本研究利用萊茵衣藻內(nèi)源LRR-1 肽段免疫新西蘭白兔制備多克隆抗體，旨在為深入研究LRR 型蛋白功能及其分子機(jī)制提供材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水稻（Oryza sativa L.）葉片，萊茵衣藻野生型藻株21gr 和突變?cè)逯阬rr-1 為江漢大學(xué)遺傳與生物技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室保存。新西蘭白兔（體質(zhì)量2.0kg）購(gòu)于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 多肽的設(shè)計(jì)與合成

在NCBI 網(wǎng)站檢索萊茵衣藻CrLRR-1 同源蛋白，分析該蛋白特異性，通過(guò)PHD、DSC、MLRC 和Sec.Cons 對(duì)CrLRR-1 的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，利用TMHMM、SMART 預(yù)測(cè)CrLRR-1 跨膜區(qū)和結(jié)構(gòu)域，使用DNA Star 軟件分析CrLRR-1 蛋白親水性、免疫原性及抗原表位暴露性，根據(jù)以上分析選擇親水性好、抗原性指數(shù)高的肽段。多肽的合成、純化及偶聯(lián)KLH 委托武漢愛(ài)博泰克生物科技公司完成。

1.3 動(dòng)物免疫

免疫動(dòng)物為2.0 kg 左右的雄性新西蘭白兔，免疫前取耳緣靜脈血作為陰性對(duì)照。第1 次免疫取200μg 純化好的CrLRR-1 多肽抗原與等體積完全弗氏佐劑（Sigma F5881）混勻至完全乳化，進(jìn)行頸背部皮下注射6～8 個(gè)點(diǎn)。首次免疫11 d 后進(jìn)行第2 次免疫，取100 μg 多肽與等體積不完全弗氏佐劑（SigmaF5506）混勻并充分乳化，在頸背部皮下免疫4 個(gè)點(diǎn)，接著每隔2 周進(jìn)行1 次加強(qiáng)免疫，連續(xù)3 次，免疫方法、劑量均與第2 次相同。全程共免疫5 次，免疫結(jié)束后第12 天進(jìn)行動(dòng)脈取血100 mL 左右，4 ℃離心收集上層血清。

1.4 間接ELISA法檢測(cè)抗血清效價(jià)

用包被液（Solarbio SEKF105）稀釋CrLRR-1 多肽至1 μg/mL 作為包被抗原，以100 μL/孔包被酶標(biāo)板，4 ℃過(guò)夜。用含0.05% Tween-20 的PBST 洗滌3次，每孔加入200 μL 封閉液（含5% BSA），37 ℃孵育2 h，PBST 洗滌3 次。待測(cè)抗血清為一抗，從1∶2 000開(kāi)始2 倍梯度稀釋至1∶512 000，并設(shè)同等稀釋度的陰性兔血清做對(duì)照，每孔100 μL，37 ℃ 孵育1 h，PBST 洗滌3 次后每孔加入100 μL 辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶20 000 稀釋），37 ℃孵育1 h，PBST 洗滌5 次。每孔加入100 μL TMB 顯色劑，37 ℃避光反應(yīng)10 min，每孔加入50 μL 終止液，即刻用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)在450 nm 下的吸光值?？寡錙D450 nm 大于0.1，且與陰性對(duì)照血清OD450 nm 比值大于2，其對(duì)應(yīng)的最高稀釋倍數(shù)即為抗血清效價(jià)。

1.5 抗血清純化

首先采用Protein A 純化法，稱取1.5 g Protein ASepharoseCL-4B 填料于純化柱，使用去離子水使其充分溶脹，加入Protein A 結(jié)合緩沖液（0.1 mol/LTris，150 mmol/L NaCl，pH 7.5）平衡填料，將CrLRR-1 抗血清用結(jié)合緩沖液稀釋后加入處理好的純化柱，4 ℃過(guò)夜結(jié)合。用結(jié)合緩沖液洗去純化柱中非特異性吸附的雜蛋白，加入0.1 mol/L（pH 2.7）甘氨酸洗脫液洗脫抗體，并立即用1 mol/L Tris-HCl（pH 9.0）中和抗體。采用抗原親和純化法進(jìn)一步純化，將CrLRR-1 多肽抗原結(jié)合到瓊脂糖凝膠樹(shù)脂上，使其專一性吸附CrLRR-1 的抗體，按上述方法將抗體洗脫下來(lái)。

1.6 抗體特異性檢測(cè)

突變?cè)逯阬rr-1 是筆者所在實(shí)驗(yàn)室通過(guò)向野生型藻株21gr 基因組中引入隨機(jī)插入突變的方式獲得。首先利用RESDA-PCR（restriction enzyme site-di?rected amplification PCR）技術(shù)擴(kuò)增出插入片段兩側(cè)的DNA 序列［19］，測(cè)序后與衣藻基因組進(jìn)行比對(duì)，確定突變基因及外源片段的插入位點(diǎn)；接著，分別提取野生型21gr 和突變?cè)逯阬rr-1 的總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，鑒定CrLRR-1 基因的表達(dá)情況；然后，提取21gr 和lrr1 的全細(xì)胞蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5% 脫脂乳粉室溫封閉1 h，以1∶5 000 稀釋純化后的抗血清作為一抗，室溫孵育1 h，用含0.05% Tween-20 的TBST 洗滌3次，加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫孵育45 min，TBST 洗滌3 次，加ECL 化學(xué)發(fā)光液曝光顯影。

1.7 免疫熒光檢測(cè)蛋白亞細(xì)胞定位

收集細(xì)胞狀態(tài)良好的野生型21gr 和突變體lrr-1藻細(xì)胞，8% PFA 固定細(xì)胞，使用0.5% NP40 通透細(xì)胞2 min，將細(xì)胞輕滴在0.1% PEE 處理過(guò)的載玻片上，室溫下用山羊血清封閉1 h。一抗采用CrLRR-1抗體（1∶100 稀釋）和衣藻鞭毛膜蛋白（flagellar mem?brane glycoprotein 1B，F(xiàn)MG-1B）抗體，等量混合，37 ℃孵育4 h，二抗分別使用紅色熒光素標(biāo)記的羊抗兔二抗（Merck R37116）和綠色熒光素標(biāo)記的羊抗小鼠二抗（Merck R37120），37 ℃ 避光孵育2 h，滴加Fluoromount-G（SBA-0100）防熒光淬滅劑后封片，激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察熒光信號(hào)并拍攝圖像。

1.8 CrLRR-1 抗體檢測(cè)水稻葉片總蛋白

稱取0.2 g 水稻新鮮葉片，在液氮中將葉片迅速、充分研磨成粉末，裝入1.5 mL 離心管，加入1 mL 蛋白裂解液并上下顛倒混勻，冰上放置20 min，期間每隔5 min 振蕩1 次，充分裂解后4 ℃ 14 000 r/min 離心30min，上清即為葉片總蛋白。加入蛋白上樣緩沖液將樣品進(jìn)行梯度稀釋，采用CrLRR-1 抗體（1∶5 000 稀釋）進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CrLRR-1 蛋白多肽的設(shè)計(jì)

CrLRR-1 在萊茵衣藻中的基因位點(diǎn)編號(hào)為Cre06.g302700（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/report/gene/Creinhardtii_v5_6/Cre06. g302700） ，CrLRR-1 蛋白結(jié)構(gòu)域分析如圖1A 所示，該蛋白含有富亮氨酸重復(fù)序列，選擇含有結(jié)構(gòu)域的區(qū)域有助于增加抗體的特異性。CrLRR-1 蛋白經(jīng)DNAStar 分析結(jié)果如圖1B 所示，將CrLRR-1 蛋白369～386 aa 位置的多肽作為候選，用Kyte-Doolittle 方法對(duì)多肽序列進(jìn)行親水性分析，結(jié)果顯示該序列親水性較好，用Jameson-Wolf 方法預(yù)測(cè)CrLRR-1 蛋白上的抗原決定簇，結(jié)果顯示候選多肽的抗原性指數(shù)較高，可能為潛在的抗原決定簇，經(jīng)Emini 方法預(yù)測(cè)該候選多肽位于蛋白表面的可能性較高。同時(shí)，候選肽段屬于LRR序列的高度保守段，綜合分析，確認(rèn)選擇CrLRR-1 蛋白369～386 aa 處合成多肽：C-DNKGLSVLDLG?GNNIGPK，其中N 端的半胱氨酸提供巰基偶聯(lián)到KLH 上。

2.2 抗血清效價(jià)的測(cè)定

利用間接ELISA 法測(cè)定CrLRR-1 抗血清效價(jià)，結(jié)果如圖2 所示，CrLRR-1 抗血清最高稀釋512 000倍，其OD450 nm 值為0.225，是陰性對(duì)照（OD450 nm=0.094）的2 倍，因此，本次免疫所制備抗血清效價(jià)為1∶512 000。

2.3 CrLRR-1 抗體的特異性分析

突變?cè)逯阬rr-1 的RESDA-PCR 擴(kuò)增結(jié)果如圖3A 所示，切取較亮條帶測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，外源片段插入到CrLRR-1 基因第一個(gè)外顯子207～208 bp 處。提取野生型21gr 和突變?cè)逯阬rr-1 的總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，結(jié)果顯示，以21gr 的cDNA 為模板能夠擴(kuò)增出CrLRR-1 基因的CDS 全長(zhǎng)序列，而突變?cè)逯阬rr-1 中不能擴(kuò)增出CrLRR-1 基因的CDS 序列（圖3B），表明lrr-1 中CrLRR-1 基因無(wú)法正常表達(dá)。制備的CrLRR-1 抗血清經(jīng)Protein A 和抗原親和純化后通過(guò)Western blot 進(jìn)行檢測(cè)（圖3C），野生型21gr 泳道顯示特異性條帶，與預(yù)期大小57 ku 接近，而突變體lrr?1泳道未檢測(cè)到目標(biāo)條帶，表明制備的抗體能夠特異性結(jié)合CrLRR-1 蛋白，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.4 CrLRR-1 蛋白在萊茵衣藻中的定位

由圖4 可知，野生型21gr 與突變體lrr-1 的鞭毛和細(xì)胞膜均被染上綠色熒光，在野生型21gr 細(xì)胞膜上觀察到明顯紅色熒光，同時(shí)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在少量彌散信號(hào)，而在突變體lrr-1 細(xì)胞內(nèi)幾乎看不到熒光信號(hào)，說(shuō)明該抗體具有較強(qiáng)特異性，可特異性識(shí)別CrLRR-1 蛋白。

2.5 CrLRR-1 抗體特異性識(shí)別水稻LRRL1 蛋白

由圖5A 可知，CrLRR-1 蛋白369～386 aa 肽段在水稻LRR 蛋白中具有較高保守性。提取水稻葉片總蛋白進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，結(jié)果顯示（圖5B），在水稻葉片總蛋白印跡的PVDF 膜上70～100 ku 之間有明顯陽(yáng)性條帶，且隨著樣品濃度梯度稀釋而逐級(jí)減弱。經(jīng)質(zhì)譜鑒定該陽(yáng)性條帶為水稻LRRL1（leucine richrepeat-like 1）蛋白，大小為90 ku，基因位點(diǎn)編號(hào)為L(zhǎng)OC_Os06g13050。

3 討論

抗體制備是研究目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)、蛋白間相互作用、蛋白亞細(xì)胞定位及其生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析CrLRR-1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、免疫原性、抗原表位暴露性以及與衣藻中其他蛋白的同源性等，以此為依據(jù)選取CrLRR-1蛋白369～386 aa 區(qū)域，合成該特異性肽段與KLH 偶聯(lián)后免疫新西蘭白兔。與天然抗原或重組蛋白相比，人工合成多肽的抗原表位優(yōu)勢(shì)富集，與載體蛋白偶聯(lián)后不僅能增加抗原的大小，也能增強(qiáng)免疫性，更好地刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體［20］。本研究成功制備CrLRR-1 抗血清，采用間接ELISA 法檢測(cè)其效價(jià)達(dá)到1∶512 000，經(jīng)Protein A 和抗原親和純化后得到CrLRR-1 蛋白多克隆抗體。通過(guò)免疫印跡與免疫熒光檢測(cè)該抗體能特異性識(shí)別萊茵衣藻內(nèi)源LRR-1 蛋白，并初步判斷CrLRR-1蛋白主要定位于萊茵衣藻細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)。由于本研究選擇作為免疫原的多肽屬于LRR 高度保守段，因此制備的多克隆抗體可特異性識(shí)別水稻LR?RL1蛋白，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

LRRs 是與先天免疫相關(guān)的蛋白質(zhì)中最常見(jiàn)的蛋白結(jié)構(gòu)域之一，先天免疫在保護(hù)生物體免受內(nèi)源性和外源性病原物入侵方面發(fā)揮重要作用。已有研究表明，LRRs 主要作為特異性識(shí)別區(qū)域，參與生物體對(duì)病原物的感知與識(shí)別［21］。目前已克隆了很多植物的LRR 基因，并且發(fā)現(xiàn)大部分植物的LRR 型蛋白為病害抑制蛋白［22］，但是對(duì)于這些基因參與植物先天免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制研究尚不完善。Chen 等［23］研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的水稻LRRlike1蛋白YPD1（yellow and premature dwarf 1）定位在葉綠體膜上，ypd1 突變體對(duì)強(qiáng)光敏感，具有異常的葉綠體和較低水平的光合色素。YPD1 基因的突變加速了水稻細(xì)胞的衰老和死亡，但其具體的調(diào)控機(jī)制還不清楚。本研究制備的CrLRR-1 抗體可特異性識(shí)別水稻LRR-like1 蛋白，將為該蛋白調(diào)控水稻生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)制研究提供有力工具。

綜上所述，本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析萊茵衣藻LRR-1 蛋白理化性質(zhì)，設(shè)計(jì)并合成特異性多肽，與KLH 偶聯(lián)后免疫新西蘭白兔，成功制備了效價(jià)高、特異性好的CrLRR-1 多克隆抗體，并應(yīng)用該抗體特異性識(shí)別了水稻內(nèi)源LRRL1 蛋白。該抗體的制備可為后續(xù)深入研究LRR 型蛋白功能，闡明其作用機(jī)制奠定材料基礎(chǔ)。