噬菌肽SEYT4對食品鏈中常見致病菌的清除效果

關(guān)鍵詞 食源性細(xì)菌； 致病菌； 噬菌肽； 食品加工鏈； 消毒劑

食品生產(chǎn)、加工等過程中，致病菌在不銹鋼、塑料等材料制成的食品加工設(shè)備表面可長時間存活［1］；此外，在家庭廚房中，未清洗的蔬菜和水果由于清潔不當(dāng)或與砧板等廚具交叉污染也會引起疾病的發(fā)生［2-4］，導(dǎo)致致病菌對食物及其接觸表面的污染成為引起食源性疾病的重要原因［5］。為了避免由致病菌引起的食物中毒，清除在食物接觸表面污染的和食物來源的致病菌十分重要。

在食品工業(yè)中，常用的化學(xué)消毒劑如含氯化合物、乙醇、有機(jī)酸和表面活性劑等，雖然能控制致病菌的污染［6］，但會對加工設(shè)備產(chǎn)生不良影響，甚至危害人體健康［7］。此外，近年來對消毒劑產(chǎn)生抗性的細(xì)菌的出現(xiàn)［8］，也促使學(xué)者們尋求安全有效的新型消毒劑。抗菌肽在控制食品中的致病菌和保持其原有的感官品質(zhì)和營養(yǎng)特性方面展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景［9］，因此受到了廣泛關(guān)注。早在1969 年，F(xiàn)AO 和WHO就批準(zhǔn)乳酸鏈球菌肽（nisin）作為食品防腐劑在乳制品、肉制品和罐裝食品等領(lǐng)域投入使用［10］。近年來有研究者在噬菌體中也發(fā)現(xiàn)了具有抗菌活性的多肽類物質(zhì)，簡稱噬菌肽。例如在金黃色葡萄球菌噬菌體中發(fā)現(xiàn)的能抑制細(xì)菌生長的新型噬菌肽家族［11］，以及在假單胞菌噬菌體裂解酶中發(fā)現(xiàn)的能夠殺死細(xì)菌的抗菌肽類似物［12］等，但這些噬菌肽尚未在食品工業(yè)中應(yīng)用。

筆者以課題組前期篩選到的沙門氏菌噬菌體LPSEYT［13］為基礎(chǔ)，從中篩選出1 條抗菌肽SEYT4，選擇在食品加工鏈中常見的致病細(xì)菌進(jìn)行殺菌試驗，探究該噬菌肽發(fā)揮殺菌作用的最佳溫度、鹽濃度和pH 值并評估其安全性。同時，通過模擬被致病菌污染的葉菜和廚具，探究SEYT4 清除食品中致病菌的效果，以期拓寬抗菌肽的來源，并為今后將該噬菌肽開發(fā)為新型食品消毒劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1）菌株。豬鏈球菌（Streptococcus suis）SC19、P1/7、LSM102、LSM178 菌株，糞腸球菌（Enterococ?cus faecalis）LEFS2 菌株，屎腸球菌（Enterococcus fae?cium）LEFM1、LEFM2 菌株，鮑曼不動桿菌（Acineto?bacter baumannii）LAB11、LAB12、LAB13 菌株，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）LPA3、LPA4、LPA6 菌株及副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）LVP1、LVP78 菌株由筆者所在實驗室保存；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）LSA139、LSA140、LSA141、LSA144 菌株，糞腸球菌（Enterococcus fae?calis）ATCC51299 菌株，大腸桿菌（Escherichia coli）LEC32、LEC33 菌株及沙門氏菌（Salmonella）ATCC13076、ATCC13311 菌株來源于美國菌種保存中心。

所有菌株使用LB 液體培養(yǎng)基并于37 ℃進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。使用添加1.5%（ m/V）瓊脂的LA固體培養(yǎng)基進(jìn)行單菌落篩選和細(xì)菌計數(shù)。

2）30 mmol/L HEPES（pH=7.4）緩沖液。使用1 mol/L HEPES 緩沖液和1 mol/L HEPES sodiumsalt 緩沖液調(diào)整pH 至7.4，過濾除菌后用無菌水稀釋備用。

1.2 噬菌肽合成及生物信息學(xué)分析

噬菌肽SEYT4（RKQNWTEMCNRITDWD?MGGKYRGLTIRKQSQSRESQC）采用固相肽技術(shù)合成（南京GenScript 公司）并使用高效液相色譜法測定肽的純度為90.60%。將合成的噬菌肽溶于純水中，制備質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的原液，-80 ℃保存?zhèn)溆?。使用ProtParam（https：//web. expasy. org/prot?param/）和HeliQuest 服務(wù)器（http：//heliquest.ipmc.cnrs.fr/）分別預(yù)測噬菌肽的各種物理和化學(xué)參數(shù)。使用I-TASSER 在線服務(wù)器（https：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/）預(yù)測噬菌肽的結(jié)構(gòu)。

1.3 噬菌肽二級結(jié)構(gòu)測定

分別使用無菌水（水環(huán)境）、50% 三氟乙醇（TFE，模擬微生物膜的疏水環(huán)境）和30 mmol/LSDS 膠束（模擬帶負(fù)電的原核膜的類似環(huán)境）制備200 μg/mL 的肽溶液以測定在不同條件下肽的狀態(tài)。將上述肽溶液置于石英比色皿中，使用圓二色譜儀記錄其在室溫下的波長變化，其中掃描速度為100nm/min，光譜帶寬為0.1 nm，帶寬為1 nm，掃描波長范圍為190～250 nm，每個波長下掃描3 次取平均值，作圖后根據(jù)掃描出的譜帶判斷噬菌肽的二級結(jié)構(gòu)。

1.4 噬菌肽殺菌譜測定

測定方法如Euler 等［14］所述，略有修改。挑取供試菌株的單克隆分別接種于5 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃下過夜培養(yǎng)后按比例轉(zhuǎn)接并繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)期（OD600 nm=0.5， 108 CFU/mL）。離心收集細(xì)菌，使用30 mmol/L HEPES 緩沖液重懸并稀釋至105 CFU/mL。將上述菌液加入96 孔板，并加入100μg/mL 等體積的肽，陰性對照為加入等體積的HEPES 緩沖液。37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h 后稀釋并涂布LA 固體平板上，過夜培養(yǎng)后計數(shù)。試驗設(shè)置2 組平行，重復(fù)3 次，取平均值。平板上細(xì)菌菌落數(shù)越少即表明噬菌肽的殺菌效果越好。

1.5 噬菌肽殺菌效率測定

細(xì)菌處理方法同本文“1.4”，在96 孔板中加入等體積的菌液（105 CFU/mL）和100 μg/mL 噬菌肽，陰性對照為加入等體積的HEPES 緩沖液，置于37 ℃下振蕩培養(yǎng)。在預(yù)定時間點吸取反應(yīng)液，稀釋至合適梯度后涂布于LA 固體板上，過夜培養(yǎng)后計數(shù)。試驗設(shè)置2 組平行，重復(fù)3 次，取平均值。

1.6 噬菌肽殺菌特性測定

細(xì)菌處理方法同本文“1.4”，處理后的細(xì)菌（105CFU/mL）分別在不同溫度、不同濃度鹽溶液和不同pH 緩沖液中與100 μg/mL 的噬菌肽反應(yīng)（除在不同溫度下反應(yīng)的試驗外，其余試驗反應(yīng)溫度均為37 ℃），振蕩培養(yǎng)1 h 后，將反應(yīng)液稀釋后在LA 平板上涂布，過夜培養(yǎng)后計數(shù)。陰性對照為加入等體積的HEPES 緩沖液。試驗設(shè)置2 組平行，重復(fù)3 次，取平均值。

1.7 噬菌肽溶血活性測定

取1 mL 5 周齡C57BL/6 雌性小鼠的全血于肝素鈉抗凝管中，4 ℃下以3 500 r/min 離心10 min，棄上清后使用PBS 洗滌2～3 次以除去血清和其他雜質(zhì)，獲得100% 紅細(xì)胞。將紅細(xì)胞用PBS 稀釋至4%（V/V）并吸取100 μL 分裝至不同離心管中，加入100 μL 不同質(zhì)量濃度的噬菌肽，分別以PBS 和1%（V/V）Triton X-100 作為陰性對照和陽性對照，混勻后置于37 ℃孵育1 h，然后將混合物在4 ℃下以3 500r/min 離心10 min，吸取150 μL 上清至96 孔板，用酶標(biāo)儀測定在540 nm 處的吸光值，試驗設(shè)置2 組平行，重復(fù)3 次，取平均值。試驗組與陰性對照吸光值越接近即表明噬菌肽的溶血活性越低，即噬菌肽安全性越高。

1.8 在香菜中的殺菌活性檢測

新鮮的香菜（Coriandrum sativum L.）購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場。使用自來水徹底清洗未受損的香菜葉片，在75% 乙醇中浸泡1 min 后用無菌水徹底沖洗，再在無菌水中浸泡30 min。將大小相近的葉片在HEPES 緩沖液中浸泡10 min 后轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)皿中晾干。細(xì)菌培養(yǎng)方法同本文“1.4”，吸取10 μL細(xì)菌（105 CFU/mL）滴于葉片中央并晾干，將晾干后的葉片轉(zhuǎn)移至加有500 μg/mL 噬菌肽的24 孔板中，37 ℃孵育1 h 后，使用HEPES 緩沖液沖洗葉片后轉(zhuǎn)移至離心管，加入300 μL HEPES 緩沖液并研磨至完全破碎。吸取以上均質(zhì)液至96 孔板中，稀釋至合適梯度涂布于LA 固體平板上，37 ℃下過夜培養(yǎng)后計數(shù)；同時將24 孔板中剩余的溶液稀釋至合適梯度，在LA 平板上涂布計數(shù)。試驗設(shè)置6 組平行，重復(fù)2 次，取平均值。

1.9 在食品接觸面上的殺菌活性檢測

使用2 cm×2 cm 的無菌塑料板和硅膠片模擬不同材質(zhì)的廚具。按照本文“1.4”所述處理細(xì)菌。隨后將100 μL 處理后的細(xì)菌（105 CFU/mL）滴加于不同食品接觸面上，無菌條件下干燥1 h。接著在滴加細(xì)菌的區(qū)域滴加等體積的噬菌肽（100 μg/mL），滴加等體積HEPES 緩沖液為陰性對照，并于室溫下反應(yīng)1 h。為了恢復(fù)細(xì)菌，用無菌棉簽徹底擦拭塑料板或硅膠片表面并將棉簽浸入含有500 μL HEPES 緩沖液的試管中，將棉簽上的細(xì)菌全部刮入緩沖液中。懸浮液連續(xù)稀釋后涂布于LA 固體平板上，37 °C 過夜培養(yǎng)后計數(shù)。試驗設(shè)置6 組平行，重復(fù)2 次，取平均值。

1.10 數(shù)據(jù)分析

使用GraphPad Prism（6.0 版）進(jìn)行統(tǒng)計分析并作圖。檢驗數(shù)據(jù)采用雙尾t 檢驗進(jìn)行分析，Plt;0.05 被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 SEYT4 特性分析

根據(jù)噬菌體LPSEYT 的基因組（GenBank：MH181876.1），篩選出含有37 個氨基酸的噬菌肽SEYT4。I-TASSER 的預(yù)測結(jié)果顯示SEYT4是1個發(fā)夾狀的雙α-螺旋結(jié)構(gòu)（圖1A），分子質(zhì)量約為4.5ku，凈電荷為+4，理論等電點為9.69，疏水指數(shù)為0.109，疏水力矩為0.166。SEYT4 是1 個兩親螺旋（圖1B），SEYT4 中精氨酸含量最豐富（13.50%），其次是谷氨酰胺（10.80%）。使用圓二色譜法測定噬菌肽SEYT4 在細(xì)胞外水環(huán)境、疏水膜環(huán)境和帶負(fù)電荷的膜環(huán)境中的結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果如圖1C 所示，在水環(huán)境中，噬菌肽SEYT4 的結(jié)構(gòu)呈隨機(jī)卷曲形式，但在疏水膜環(huán)境和帶負(fù)電荷的膜環(huán)境中，SEYT4 的圓二色譜在192 nm 附近有1 條正譜帶，在208 nm 和222nm 附近分別有1 條負(fù)譜帶，說明SEYT4 在以上2 種環(huán)境中均呈典型的α 螺旋結(jié)構(gòu)。

2.2 SEYT4 的殺菌譜

如圖2A 所示，SEYT4 對大多數(shù)革蘭氏陽性細(xì)菌均有良好的殺菌活性，對于4 株金黃色葡萄球菌（LSA139、LSA140、LSA141 和LSA144），噬菌肽SEYT4 在1 h 內(nèi)最多可殺滅約99.99%；對于豬鏈球菌，噬菌肽SEYT4 在1 h 內(nèi)最多可殺滅約80.00%；對于糞腸球菌和屎腸球菌，噬菌肽SEYT4 同樣有良好的殺菌活性，在1 h 內(nèi)最多可殺滅約99.99%。

如圖2B 所示，SEYT4 能有效殺滅多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌：噬菌肽SEYT4 能夠?qū)ⅤU曼不動桿菌、大腸桿菌和副溶血弧菌減少約99.99%；可將銅綠假單胞菌在1 h 內(nèi)最多殺滅約95.00%；對于沙門氏菌，噬菌肽SEYT4 在1 h 內(nèi)最多可殺滅約95.00%。

2.3 SEYT4 的殺菌動力學(xué)

噬菌肽的殺菌動力學(xué)結(jié)果顯示，噬菌肽在2 min內(nèi)能夠?qū)⒔瘘S色葡萄球菌減少約99.99%，且在1 h 內(nèi)經(jīng)噬菌肽處理后的細(xì)菌未見增長，殺菌活性依舊良好（圖3A）；對于鮑曼不動桿菌，噬菌肽SEYT4 在20min 內(nèi)能殺滅約99.99%，同樣在1 h 內(nèi)保持良好的殺菌活性（圖3B）。

2.4 溫度、鹽濃度和pH 對SEYT4 殺菌活性的影響

噬菌肽SEYT4 在不同溫度（4 ℃、25 ℃和37 ℃）下均具有較高的活性，可將105 CFU/mL 的金黃色葡萄球菌和鮑曼不動桿菌的活菌數(shù)量減少約99.99%。而在沒有SEYT4 作用時，以上溫度下未觀察到細(xì)菌數(shù)量的減少（圖4A 和4B）。

在不同濃度的NaCl 溶液中，噬菌肽SEYT4 的殺菌活性受到影響。在50 mmol/L NaCl 溶液中，噬菌肽SEYT4 能夠?qū)⒔瘘S色葡萄球菌減少約99.99%，能將鮑曼不動桿菌減少約90.00%；但當(dāng)NaCl 溶液濃度超過50 mmol/L 時，噬菌肽SEYT4 對金黃色葡萄球菌的殺菌活性完全被抑制，對于鮑曼不動桿菌最多可殺滅約60.00%（圖4C 和4D）。

在不同pH 下，噬菌肽SEYT4 對金黃色葡萄球菌LSA140（圖4E）和鮑曼不動桿菌LAB12（圖4F）的殺菌效果不同：在pH=5 和pH=6 時，SEYT4 對金黃色葡萄球菌幾乎無殺菌作用，在pH=7～10 時，SEYT4 能將金黃色葡萄球菌減少約99.99%；對于鮑曼不動桿菌，在pH=5 時，SEYT4 幾乎無殺菌作用，在pH=7 和pH=8 時，SEYT4 能將細(xì)菌減少約99.99%，在pH=6、pH=9 和pH=10 時，SEYT4 可將細(xì)菌減少約99.00%。由此可知，該肽在中性和弱堿性條件下殺菌效果更好。

2.5 SEYT4 對紅細(xì)胞的安全性

SEYT4 的安全性試驗結(jié)果顯示，不同質(zhì)量濃度的噬菌肽（3.125～100 μg/mL）均不會破壞小鼠紅細(xì)胞的完整性，表明SEYT4 對小鼠是安全的（圖5）。

2.6 SEYT4 在香菜上的殺菌作用

在37 ℃ 條件下，用質(zhì)量濃度為500 μg/mL 的SEYT4 處理香菜葉片1 h 后，觀察到受污染香菜葉片上的金黃色葡萄球菌和鮑曼不動桿菌的數(shù)量減少約80.00%（圖6A），而洗滌液中細(xì)菌的數(shù)量則可減少約85.00%～99.00%（圖6B）。由此可見，SEYT4 能夠有效清除葉菜中污染的致病菌。

2.7 SEYT4 在食品接觸面上的殺菌作用

在模擬的塑料接觸面上，噬菌肽SEYT4 最多可清除約99.00% 以上的金黃色葡萄球菌和鮑曼不動桿菌（圖7A），同樣，SEYT4 對硅膠接觸面上的細(xì)菌也有顯著的殺菌效果，最多可將細(xì)菌數(shù)量減少約99.99%（圖7B）。表明SEYT4 可作為一種理想的消毒劑，用于清除塑料和硅膠等食品接觸表面上的金黃色葡萄球菌和鮑曼不動桿菌。

3 討論

噬菌肽SEYT4 是筆者所在研究室從沙門氏菌噬菌體LPSEYT 中篩選出1 條活性良好的抗菌肽［13］，其殺菌能力及安全性尚不清楚。本研究結(jié)果顯示噬菌肽SEYT4 可高效清除對數(shù)生長期的細(xì)菌，殺菌能力在90.00%～99.99%，其中包括許多食源性病原菌和腐敗細(xì)菌，表明該肽殺菌的廣譜性。在肽的殺菌動力學(xué)試驗中，SEYT4 能夠快速清除金黃色葡萄球菌和鮑曼不動桿菌，表明該肽殺菌的高效性。SEYT4 在不同溫度下仍保持近99.99% 的殺菌活性，室溫下可以有效防止食品加工過程中金黃色葡萄球菌和鮑曼不動桿菌的交叉污染；在較高的pH下，SEYT4 活性較強(qiáng)，但在弱酸性環(huán)境中其活性被抑制；當(dāng)氯化鈉濃度大于50 mmol/L 時，SEYT4 會失活，這在一定程度上限制了SEYT4 在偏酸性環(huán)境和高鹽環(huán)境中的應(yīng)用。有研究表明可從替換氨基酸入手對肽進(jìn)行改造，改造后的肽在鹽存在的情況下對致病菌有強(qiáng)大的殺菌作用［15-16］。因此后續(xù)可通過對噬菌肽進(jìn)行改造以提高其耐受性。隨著分子設(shè)計和優(yōu)化策略的發(fā)展，以及納米技術(shù)的迅速崛起，有更多方法可以用來改善抗菌肽的生物和化學(xué)性質(zhì)，以拓寬噬菌肽在食品加工鏈中的應(yīng)用［17-18］。

噬菌肽在實際生產(chǎn)應(yīng)用中使用需考慮其安全性，而通過噬菌肽與真核細(xì)胞相互作用可以評判噬菌肽應(yīng)用于食品中的潛力。本研究中安全性試驗結(jié)果表明，噬菌肽SEYT4 不會損害哺乳動物小鼠紅細(xì)胞。另外，細(xì)胞毒性也是評判多肽類抗菌藥物安全性的一個重要指標(biāo)。已有研究表明抗菌肽CPF-C1質(zhì)量濃度達(dá)到128 μg/mL 時，肽對人胚腎細(xì)胞系未顯示出細(xì)胞毒性［19］。后續(xù)可探究噬菌肽SEYT4 的細(xì)胞毒性以進(jìn)一步評估其安全性。

金黃色葡萄球菌、不動桿菌和大腸桿菌等常見的致病菌多存在于食品加工各個環(huán)節(jié)，在食品加工和儲存期間的不良衛(wèi)生狀況可能會導(dǎo)致它們進(jìn)入食物鏈。在本研究的香菜葉片模型中，SEYT4 被證明是一種有效的消毒劑，能夠明顯清除葉片上細(xì)菌的同時也能將洗滌液中約99.00% 的細(xì)菌清除，大大降低了洗滌過程中交叉污染的風(fēng)險；在接觸面模型中，SEYT4 能清除食品接觸面上約99.99% 的細(xì)菌，表明噬菌肽在食品加工鏈中具有很大的應(yīng)用潛力。然而與殺菌試驗相比，噬菌肽在香菜中的殺菌能力相對降低，推測可能是由于噬菌肽與葉片表面未充分接觸或香菜中維生素和醇類等物質(zhì)的存在導(dǎo)致噬菌肽在香菜葉片上的殺菌能力有所降低。

綜上所述，噬菌肽SEYT4 可有效控制食品加工鏈中致病菌的交叉污染，有望成為一種食品加工鏈中的實用消毒劑。本研究在拓寬抗菌肽來源的同時，也為食品安全領(lǐng)域提供了一種新的防控技術(shù)。